禽補體C3d增強新城疫病毒F基因核酸疫苗免疫效果的研究

夏慶祥 沈美艷 李 舫

（山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院 山東 濰坊 261061）

牛鐘相*

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 山東 泰安 271018）

王曉藝

（山東省煙臺市牟平區(qū)姜格莊街道獸醫(yī)工作站）

禽補體C3d增強新城疫病毒F基因核酸疫苗免疫效果的研究

夏慶祥 沈美艷 李 舫*

（山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院 山東 濰坊 261061）

牛鐘相*

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 山東 泰安 271018）

王曉藝

（山東省煙臺市牟平區(qū)姜格莊街道獸醫(yī)工作站）

本文對禽C3d的分子結(jié)構(gòu)，對抗原免疫原性的影響做了初步研究。結(jié)果表明，理論上本動物C3d的免疫增強效果更好。

C3d F基因 核酸疫苗 免疫原性

補體系統(tǒng)的核心成分是C3蛋白，在補體反應(yīng)的三條途徑中居于樞紐地，是宿主防御機制中的關(guān)鍵分子。C3d是產(chǎn)生于補體激活過程中補體C3裂解后的一個片段。研究發(fā)現(xiàn)C3d作為分子佐劑可以降低B細胞的活化閾，促進抗原的加工和遞呈，提高抗體水平[1～4]。補體裂解片段C3d由于其分子中的分子內(nèi)硫酯鍵和與CD21的結(jié)合位點的存在，使其能夠發(fā)揮分子佐劑的作用從而在抗原誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。自 Dempsy等通過基因工程方法將雞卵溶菌酶(hen egg lysozyme, HEL)分別與小鼠C3d分子串聯(lián)制備成融合蛋白免疫小鼠從而發(fā)現(xiàn)C3d的分子佐劑作用以來，人們陸續(xù)克隆了鼠、羊、牛等動物的C3d基因[5～7]，用于基因疫苗的構(gòu)建或表達融合蛋白，來改進疫苗的免疫原性，以提高疫苗的抗體滴度、親和力和細胞免疫水平。雖然有報道 C3d能在異源動物中保持免疫佐劑活性，但異源C3d在應(yīng)用過程中可能產(chǎn)生抗C3d抗體或引起自身免疫從而降低其在疫苗中的免疫佐劑作用，但理論上應(yīng)用同源C3d可能避免這些缺陷而且可能具有更高的生物學(xué)活性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 商品紹興麻鴨，購自山東省棗莊市苗莊種鴨場；AA肉雞，購自山東省畜禽疾病防治中心。

1.1.2 毒株和菌株：新城疫病毒F48E9株、大腸桿菌(Escherichia, E.coli BL21)，本研究室保存。

1.1.3 試劑和儀器 pMD18-T載體、限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、AMV反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Taq酶、dNTp等pCR相關(guān)試劑，均購自TaKaRa公司；Trizol Reagent，購自Invitrogen公司；凝膠回收試劑盒，購自O(shè)MEGA公司；質(zhì)粒小提試劑盒、無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒，購自TIANGEN公司

1.2 方法

1.2.1 C3d的克隆及鑒定 分別取雞和鴨的肝臟，提取肝臟總RNA，RT-PCR擴增C3d基因，連接到T載體，轉(zhuǎn)化BL21，測序。

1.2.2 P29串聯(lián)體的構(gòu)建 參照楮新星[8]等報道的策略，構(gòu)建pcDNA3.1-P29(2、4、6)串聯(lián)體，然后將抗原基因連接至pcDNA3.1-P29串聯(lián)體，構(gòu)建重組質(zhì)粒。

1.2.3 重組質(zhì)粒免疫效果的檢測 用試劑盒大量提取重組質(zhì)粒分別免疫雞和鴨，做攻毒保護試驗。

2 結(jié)果

2.1 C3d的克隆及連接

對C3d的擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳后，出現(xiàn)了大小為0.9kb左右的清晰條帶，測序后證明得到了C3d基因。

圖1 C3d-PMD18-T質(zhì)粒的酶切鑒定

圖2 RT-PCR擴增C3d cDNA

圖3 不同動物補體C3d基因進化樹

2.2 重組質(zhì)粒的鑒定

圖4 新城疫F基因疫苗酶切鑒定

2.3 血凝抑制試驗

血凝抑制是檢測新城疫抗體的主要指標之一。在初免后第7、14、21、28天分別采血分離血清，結(jié)果取平均值。見圖5。

圖5 不同F(xiàn)基因疫苗的HI抗體變化

2.4 攻毒保護試驗結(jié)果

初免后4周每組以F48E9 1000LD50/只攻毒，攻毒后每日觀察各組的死亡情況以及健康狀況，空載體和空白對照組在3d內(nèi)全部死亡，其他組有不同程度的死亡和臨床癥狀。攻毒后2周統(tǒng)計各組存活數(shù)，結(jié)果見附表。

附表 不同F(xiàn)基因疫苗的保護效果比較

3 討論

國內(nèi)外對于C3d的研究主要集中在人和小鼠的C3d，試驗動物主要是小鼠[8～10]，對雞、鴨的C3d研究較少。理論上同種動物的C3d比異種動物的C3d具有更高的免疫增強作用，本試驗克隆了雞和鴨的C3d基因，并對其免疫增強作用進行了初步探索。現(xiàn)C3d的免疫佐劑效應(yīng)主要與CR2/CD21有關(guān)[9～11]。C3d可以與B淋巴細胞或者是抗原遞呈細胞(APC)上的CD21結(jié)合，CD21與CD19一起參與信號傳導(dǎo)。其中CD21主要起到橋梁作用，將C3d與B淋巴細胞或者APC連接，CD19主要功能是將抗原信息傳遞到細胞內(nèi)部。APC與C3d－抗原復(fù)合物結(jié)合后，增強了捕獲以及加工抗原的能力；B淋巴細胞與C3d－抗原復(fù)合物結(jié)合后，B細胞表面受體(BCR)與CD19共同傳遞抗原信息，降低了B淋巴細胞的活化閾，促進B淋巴的分化成熟，增加了抗原特異性B淋巴細胞的數(shù)量，從而提高了水平以及抗體維持時間。鑒于CD21的重要作用以及雞CR2結(jié)合區(qū)的特殊性，模擬C3d的作用過程，將C3d-P29串聯(lián)體與F基因通過基因工程的方法相連免疫動物。利用同裂酶BamH I(識別序列為G↓GATCC)和Bgl II(識別序列為A↓GATCT)切割靶序列后可形成相同粘性末端的特性，構(gòu)建了不同拷貝數(shù)的P29基因串聯(lián)體，作為P29分子佐劑。另據(jù)報道，C3d發(fā)揮免疫佐劑效應(yīng)必須要有兩個以上的C3d基因串聯(lián)。因此構(gòu)建了基因疫苗pCDNA-F-P29.4、pCDNA-FP29.6。免疫動物后發(fā)現(xiàn)pCDNA-F-P29.6的HI抗體高出pCDNA-F-P29.4 0.5～2個滴度，連接P29串聯(lián)體的基因疫苗比單純的F基因疫苗抗體的出現(xiàn)時間縮短，抗體滴度升高。連接P29串聯(lián)體的基因疫苗第1周便能夠檢測到HI抗體，單純的F基因疫苗直到第3周才能檢測到，并且其最高的HI抗體滴度只有2 log2，而pCDNA-F-P29.6的最高滴度達5.7log2。雖然pCDNA-F-P29.6的HI抗體滴度沒有滅活苗的滴度高，但是其可以完全抵抗致死量病毒的攻擊，這可能與pCDNA-F-P29.6能夠誘導(dǎo)更強的細胞免疫有關(guān)。

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S818.9

A

1007-1733(2017)03-0004-02

2016-11-25）

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系家禽創(chuàng)新團隊建設(shè)項目（SDAIT-13-011-05）

*通訊作者