酵母培養(yǎng)物對(duì)南美白對(duì)蝦生長(zhǎng)性能、消化酶活性及非特異性免疫的影響

劉 明，李文輝，郭 丹，孫 敏，楊鳳娟，譙仕彥，戴 剛*

（1.北京中農(nóng)弘科生物技術(shù)有限公司，北京 102206；2.廊坊市農(nóng)業(yè)局，河北廊坊 065000；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，北京100193）

酵母培養(yǎng)物對(duì)南美白對(duì)蝦生長(zhǎng)性能、消化酶活性及非特異性免疫的影響

劉 明1，李文輝2，郭 丹1，孫 敏1，楊鳳娟1，譙仕彥3，戴 剛1*

（1.北京中農(nóng)弘科生物技術(shù)有限公司，北京 102206；2.廊坊市農(nóng)業(yè)局，河北廊坊 065000；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，北京100193）

本試驗(yàn)旨在研究酵母培養(yǎng)物（益康樂(lè)）對(duì)南美白對(duì)蝦生長(zhǎng)性能、蛋白酶活性及非特異性免疫的影響。選擇南美白對(duì)蝦600尾，隨機(jī)分成4組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)50尾對(duì)蝦，4組分別投喂基礎(chǔ)日糧（對(duì)照組）和添加0.3%、0.5%、1.0%酵母培養(yǎng)物試驗(yàn)飼料。經(jīng)過(guò)45 d池塘網(wǎng)箱養(yǎng)殖試驗(yàn)。結(jié)果表明：與對(duì)照組相比，添加0.3%、0.5%、1.0%酵母培養(yǎng)物組增重率分別提高了8.50%、16.74%、9.48%（P<0.05），飼料系數(shù)分別降低了7.69%、9.79%、9.09%（P<0.05）；與對(duì)照組相比，添加0.3%、0.5%、1.0%酵母培養(yǎng)物組對(duì)蝦肝胰腺蛋白酶活性分別提高了13.35%、16.26%、14.94%（P<0.05），添加酵母培養(yǎng)物有提高南美白對(duì)蝦腸道蛋白酶活性的趨勢(shì)（P>0.05）；相比對(duì)照組，各試驗(yàn)組南美白對(duì)蝦酚氧化酶和溶菌酶活性得到了顯著提高（P<0.05），而添加酵母培養(yǎng)物對(duì)南美白對(duì)蝦超氧化物歧化酶活性影響不顯著（P>0.05）。綜上可知，添加酵母培養(yǎng)物對(duì)南美白對(duì)蝦具有明顯的促生長(zhǎng)作用，顯著提高其肝胰腺消化酶活性，并改善部分非特異性免疫指標(biāo)。

酵母培養(yǎng)物；南美白對(duì)蝦；生長(zhǎng)性能；蛋白酶活性；非特異性免疫

近年來(lái)，南美白對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）養(yǎng)殖快速發(fā)展，成為我國(guó)養(yǎng)殖量最大的對(duì)蝦養(yǎng)殖品種。但隨著集約化養(yǎng)殖程度不斷加深，導(dǎo)致南美白對(duì)蝦養(yǎng)殖中出現(xiàn)疾病頻發(fā)、抗生素濫用、環(huán)境惡化等諸多問(wèn)題，嚴(yán)重制約了行業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展。由于甲殼動(dòng)物的免疫機(jī)制以非特異性免疫為主[1]，因此，尋找綠色環(huán)保的飼料添加劑以改善南美白對(duì)蝦自身免疫力是應(yīng)對(duì)南美白對(duì)蝦疾病爆發(fā)的重要途徑。酵母培養(yǎng)物（Yeast Culture）是在一定工藝條件下酵母菌在特定培養(yǎng)基經(jīng)過(guò)深度發(fā)酵而得到的微生態(tài)制品，含有豐富的寡糖、有機(jī)酸、小肽、維生素及未知生長(zhǎng)因子等成分。已有研究表明，飼料中添加酵母培養(yǎng)物有提高水產(chǎn)動(dòng)物生長(zhǎng)性能、改善腸道健康和提高機(jī)體免疫力的作用[2-5]。本研究在南美白對(duì)蝦基礎(chǔ)飼料中添加不同濃度的酵母培養(yǎng)物，探討酵母培養(yǎng)物對(duì)南美白對(duì)蝦生長(zhǎng)性能和免疫指標(biāo)的影響，為其在南美白對(duì)蝦飼料中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 酵母培養(yǎng)物（益康樂(lè)）由北京中農(nóng)弘科生物技術(shù)有限公司提供，主要營(yíng)養(yǎng)成分見(jiàn)表1，南美白對(duì)蝦由福建漳州某水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與日糧組成 試驗(yàn)用蝦經(jīng)過(guò)1周馴化飼養(yǎng)后，選擇規(guī)格一致、初始均重為（5.37±0.18）g、體質(zhì)健壯的個(gè)體600尾，隨機(jī)分成4組。以基礎(chǔ)飼料作為對(duì)照組，在基礎(chǔ)飼料中分別添加0.3%、0.5%、1.0%的酵母培養(yǎng)物作為3個(gè)試驗(yàn)組。每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)50尾，基礎(chǔ)飼料配方及營(yíng)養(yǎng)成分見(jiàn)表2。飼料原料粉碎后過(guò)60目篩，混合均勻后壓制成粒徑為1.5 mm的飼料，冷藏儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

表2 基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)成分 %

1.3 飼養(yǎng)管理 試驗(yàn)在福建漳州某水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)內(nèi)一個(gè)3 300 m2左右的池塘內(nèi)進(jìn)行，共12個(gè)網(wǎng)箱，網(wǎng)箱規(guī)格為1 m×1 m×1 m。試驗(yàn)期為45 d，飼料每天投喂3次（06:00、12:00和18:00），早晚投喂量占總量的60%，日投飼率為體重的5%左右。試驗(yàn)期間水溫為（25±2.0）℃，溶解氧>5.0 mg/L，pH為7.5～8.5，氨氮<0.2 mg/L，亞硝酸鹽<0.01 mg/L。

1.4 指標(biāo)測(cè)定與方法

1.4.1 生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定 養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后，試驗(yàn)蝦在網(wǎng)箱中停食24 h，然后逐箱起捕，計(jì)數(shù)、稱重，計(jì)算增重率、飼料系數(shù)、成活率。

增重率=（末體質(zhì)量-初體質(zhì)量）/初體質(zhì)量×100%

飼料系數(shù)=攝食量/（末體質(zhì)量-初體質(zhì)量）

成活率=試驗(yàn)?zāi)?duì)蝦尾數(shù)/試驗(yàn)初對(duì)蝦尾數(shù)×100%

1.4.2 消化酶活性測(cè)定 養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后，每個(gè)網(wǎng)箱隨機(jī)選取對(duì)蝦15尾，分別取出腸道和肝胰腺，腸道去除糞便，于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。測(cè)定時(shí)，將上述組織在4℃解凍，于10倍體積雙蒸水中冰浴勻漿。在4℃下離心30 min（10 000 r/min），取上清液備用。

蛋白酶活性的測(cè)定采用福林-酚法，以37℃每分鐘水解酶蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸為1個(gè)酶活力單位。酶液蛋白含量的測(cè)定采用考馬斯亮蘭法。

1.4.3 非特異性免疫指標(biāo)測(cè)定 養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后，試驗(yàn)蝦在網(wǎng)箱中停食24 h，每個(gè)網(wǎng)箱取對(duì)蝦15尾，用1 mL的無(wú)菌注射器抽取對(duì)蝦心臟血液，4℃靜置過(guò)夜，然后3 000 r/min離心10 min，取上清液于-20℃冰箱保存待測(cè)。

酚氧化酶活性測(cè)定采用Ashida[6]的方法。將100 μL濃度為0.01 mol/L的L-dopa加入到3.0 mL磷酸鉀緩沖液（0.1 mol/L，pH為6.0）中，混勻，再加入100 μL血清，混勻，于490 nm波長(zhǎng)下讀取光密度值。以試驗(yàn)條件下每分鐘OD490增加0.001為一個(gè)酶活力單位。

溶菌酶活性測(cè)定采用比濁法，參照Hultmark等[7]的方法，以溶壁微球菌（Micrococcus lysodeikticus）凍干粉（購(gòu)于南京建成生物工程研究所）為底物，用 0.1 mol/L的PBS緩沖液（稱取 13.97 g K2HPO4和2.69 g KH2PO4溶于蒸餾水中，定容到1 000 mL，pH為7.4）配制成底物懸液（OD570=0.3）。取3 mL懸液加入試管中，分別加入待測(cè)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品（購(gòu)于南京建成生物工程研究所）混勻，分別測(cè)定570 nm處吸光度值T樣0和T標(biāo)0，然后將試液移入37℃水浴中30 min，取出后立即置于冰浴中10 min終止反應(yīng)，測(cè)定其吸光度值T樣和T標(biāo)。溶菌酶活力UL計(jì)算公式：

超氧化物歧化酶采用南京建成生物工程研究所的試劑盒進(jìn)行測(cè)定，具體方法參考試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。超氧化物歧化酶活性定義為每毫升血清中超氧化物歧化酶抑制率達(dá)50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的超氧化物歧化酶的量為1個(gè)酶活單位。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS 14.0版統(tǒng)計(jì)軟件中One-Way過(guò)程進(jìn)行方差分析，并進(jìn)行Duncan's法多重比較，顯著水平為0.05，結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié) 果

2.1 生長(zhǎng)性能 由表3可知，相比對(duì)照組，0.3%、0.5%、1.0%酵母培養(yǎng)物組增重率分別提高了8.50%、16.74%、9.48%（P<0.05）；飼料系數(shù)分別降低了7.69%、9.79%、9.09%（P<0.05）。對(duì)蝦成活率在91.00%～96.00%，各組之間差異不顯著（P>0.05）。

2.2 蛋白酶活性 由表4可知，與對(duì)照組相比，0.3%、0.5%、1.0%酵母培養(yǎng)物對(duì)蝦肝胰腺蛋白酶活性分別提高了13.35%、16.26%、14.94%（P<0.05），添加酵母培養(yǎng)物有提高南美白對(duì)蝦腸道蛋白酶活性的趨勢(shì)（P>0.05）。

2.3 非特異性免疫酶活性 由表5可知，相比對(duì)照組，各試驗(yàn)組南美白對(duì)蝦酚氧化酶和溶菌酶活性得到了顯著提高（P<0.05），而添加酵母培養(yǎng)物對(duì)南美白對(duì)蝦超氧化物歧化酶活性影響不顯著（P>0.05）。

3 討 論

在飼料中添加酵母培養(yǎng)物可促進(jìn)水產(chǎn)動(dòng)物生長(zhǎng)已有大量報(bào)道。劉哲等[8]在建鯉飼料中添加0.5%的酵母培養(yǎng)物，顯著提高了建鯉的生長(zhǎng)性能，餌料系數(shù)降低了19.34%。李高鋒等[9]報(bào)道，0.2%的酵母培養(yǎng)物能提高團(tuán)頭魴特定生長(zhǎng)率12.95%，餌料系數(shù)降低9.87%。Robinette等[10]研究表明，在飼料中添加0.12%酵母培養(yǎng)物提高了斑點(diǎn)叉尾增重率22%，餌料系數(shù)降低15%。在本研究中，飼料中添加0.5%酵母培養(yǎng)物能顯著提高南美白對(duì)蝦增重率25.81%，降低餌料系數(shù)12.59%。酵母培養(yǎng)物能提高動(dòng)物的生長(zhǎng)性能與其含有豐富的寡糖、有機(jī)酸、小肽、維生素等活性成分有關(guān)。酵母培養(yǎng)物通過(guò)改善腸道健康、促進(jìn)消化酶活性，提高機(jī)體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收利用[11-12]，從而促進(jìn)水產(chǎn)動(dòng)物生長(zhǎng)。在本試驗(yàn)條件下，飼料中添加0.3%、0.5%、1.0%酵母培養(yǎng)物均能促進(jìn)南美白對(duì)蝦生長(zhǎng)，最佳添加量為0.5%，但在栗雄高等[13]的報(bào)道中，飼料中僅添加0.075%和0.1%酵母培養(yǎng)物能顯著提高南美白對(duì)蝦生長(zhǎng)性能，這可能與酵母培養(yǎng)物的生產(chǎn)工藝、產(chǎn)品劑型有關(guān)。

水產(chǎn)動(dòng)物中肝胰臟及腸道蛋白酶活性能夠直接影響機(jī)體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用程度，從而影響水產(chǎn)動(dòng)物的生長(zhǎng)[14]。本研究中，酵母培養(yǎng)物能顯著提高南美白對(duì)蝦肝胰腺蛋白酶活性，同時(shí)有提高南美白對(duì)蝦腸道蛋白酶活性趨勢(shì)，但各組之間差異不顯著，這與栗雄高等[13]的研究結(jié)果相似。酵母培養(yǎng)物對(duì)機(jī)體消化酶活性的影響可能與其含有豐富的有機(jī)酸有關(guān)，有機(jī)酸解離出的H+能夠降低消化道pH，從而提高消化器官蛋白酶活性[15]，具體機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

溶菌酶和酚氧化酶等指標(biāo)常用來(lái)表征對(duì)蝦等甲殼動(dòng)物的非特異性免疫機(jī)能[16]。在本研究中，酵母培養(yǎng)物能顯著提高南美白對(duì)蝦酚氧化酶活性及溶菌酶活性，這與在牙鲆[17]、黃顙魚(yú)[5]、刺參[18]等水產(chǎn)動(dòng)物中的報(bào)道一致。酵母培養(yǎng)物是一種復(fù)雜的發(fā)酵產(chǎn)物，它能提高南美白對(duì)蝦免疫指標(biāo)可能與其含有豐富的β-葡聚糖、甘露寡糖、有機(jī)酸、核苷酸等多種活性成分有關(guān)。β-葡聚糖作為一種天然免疫增強(qiáng)劑，在多種甲殼動(dòng)物中進(jìn)行了大量的研究[19-21]，它可激活甲殼動(dòng)物酚氧化酶原系統(tǒng)，促進(jìn)細(xì)胞因子的釋放、溶菌酶等的分泌[22]；甘露寡糖可提高吞噬細(xì)胞活性，能與某些病毒、毒素等抗原結(jié)合，減緩抗原吸收，還能促進(jìn)有益菌的繁殖[23]。另外也有研究表明，有機(jī)酸、核苷酸對(duì)提高甲殼動(dòng)物機(jī)體非特異性免疫也有積極作用[24-25]，具體機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

表3 酵母培養(yǎng)物對(duì)南美白對(duì)蝦生長(zhǎng)性能的影響

表4 酵母培養(yǎng)物對(duì)南美白對(duì)蝦蛋白酶的影響 U/mg Prot

表5 酵母培養(yǎng)物對(duì)南美白對(duì)蝦血清非特異性免疫酶活性的影響 U/mL

4 小 結(jié)

飼料中添加酵母培養(yǎng)物能顯著提高南美白對(duì)蝦生長(zhǎng)性能和肝胰腺蛋白酶活性，可顯著提高南美白對(duì)蝦部分非特異性免疫指標(biāo)。酵母培養(yǎng)物在南美白對(duì)蝦飼料中最佳添加水平為0.5%。

[1] 王雷, 李光友. 甲殼動(dòng)物的體液免疫研究進(jìn)展[J]. 海洋科學(xué), 1992, 16(3): 18-19.

[2] 李高鋒, 葉元土, 張俊, 等. 酵母培養(yǎng)物對(duì)團(tuán)頭魴生長(zhǎng)的影響[C]. 昆明: 中國(guó)水產(chǎn)學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì), 2008.

[3] 趙貴萍. 不同豆粕水平的飼料中添加一種酵母培養(yǎng)物(益康XP)對(duì)大菱鲆生長(zhǎng)、組織學(xué)結(jié)構(gòu)以及腸道菌群的影響[D]. 青島: 中國(guó)海洋大學(xué), 2008.

[4] 徐磊, 劉波, 謝駿, 等. 酵母培養(yǎng)物對(duì)異育銀鯽生長(zhǎng)、血液生化及免疫的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010, (6): 371-374.

[5] 陳昌福. 酵母培養(yǎng)物對(duì)黃顙魚(yú)非特異性免疫功能的調(diào)節(jié)作用[J]. 飼料與畜牧:新飼料, 2013, (5): 9-12.

[6] Ashida M. Purification and characterization of prophenoloxidase from the hemolymph of the silkworm Bombyx morí[J]. Arch Biochem Biophys, 1971,144(2): 749-762.

[7] Hultmark D, Steiner H, Rasmuson T, et al. Insect immunity. Purification and properties of three inducible bactericidal proteins from hemolymph of immunized pupae of Hyalophora cecropia[J]. Eur J Biochem, 1980, 106(1): 7-16.

[8] 劉哲, 魏時(shí)來(lái). 酵母培養(yǎng)物對(duì)建鯉生長(zhǎng)性能影響的研究[J]. 飼料工業(yè), 2003, 24(4): 52-53.

[9] 李高鋒, 葉元土, 林炳賢, 等. 酵母培養(yǎng)物對(duì)團(tuán)頭魴生長(zhǎng)的影響[J]. 飼料工業(yè), 2009, 30(22): 17-22.

[10] Robinette H R, Constance Y, 孟繁伊. 酵母培養(yǎng)物對(duì)斑點(diǎn)叉尾 幼魚(yú)生長(zhǎng)性能的影響[J]. 飼料工業(yè), 2011, 32(6): 25-27.

[11] 邱燕, 葉元土, 蔡春芳, 等. 酵母培養(yǎng)物對(duì)草魚(yú)(Ctenopharyngodon idellus)生長(zhǎng)性能與腸道粘膜形態(tài)的影響[J]. 飼料工業(yè), 2010, 31(18): 15-17.

[12] 姚仕彬, 葉元土, 蔡春芳, 等. 酵母培養(yǎng)物水溶物對(duì)離體草魚(yú)腸道黏膜細(xì)胞生長(zhǎng)及細(xì)胞膜完整性的影響[J]. 動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào), 2014, 26(11): 3478-3484.

[13] 粟雄高, 李小勤, 冷向軍, 等. 酵母培養(yǎng)物和芽孢桿菌對(duì)南美白對(duì)蝦生長(zhǎng)、蛋白酶活性和免疫性能的影響[J]. 海洋漁業(yè), 2012, 34(2): 168-176.

[14] 唐黎, 王吉橋, 程駿馳, 等. 水產(chǎn)動(dòng)物消化酶的研究[J].飼料工業(yè), 2007, 28(2): 28-31.

[15] Luckstadt C, Luckstadt C. The use of acidifiers in fish nutrition[J]. Cab Reviews: Perspectives in Agriculture Veterinary Science Nutrition and Natural Resources, 2008, 3(44): 1-9.

[16] 黃旭雄, 周洪琪, 宋理平. 急性感染對(duì)中國(guó)明對(duì)蝦非特異免疫水平的影響[J]. 水生生物學(xué)報(bào), 2007, 31(3): 325-331.

[17] 溫俊. 復(fù)合益生菌與酵母培養(yǎng)物對(duì)牙鲆(Paralichthys olivaceus)生長(zhǎng)、免疫及抗病力的影響[D]. 青島: 中國(guó)海洋大學(xué), 2007.

[18] 張琴. 刺參(Apostichopus japonicus Selenka)高效免疫增強(qiáng)劑的篩選與應(yīng)用[D]. 青島: 中國(guó)海洋大學(xué), 2010.

[19] 陽(yáng)會(huì)軍, 譚北平, 方懷義. 飼料中添加不同水平β-葡聚糖對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦生長(zhǎng)、存活及其抗病力的影響[J]. 飼料工業(yè), 2001, 22(9): 18-19.

[20] 陳云波, 周洪琪, 華雪銘, 等. 飼料中添加β-葡聚糖對(duì)南美白對(duì)蝦的生長(zhǎng)、存活及飼料系數(shù)的影響[J]. 淡水漁業(yè), 2002, 32(5): 55-56.

[21] 余水法, 蔡春芳, 宋學(xué)宏,等. β-葡聚糖對(duì)河蟹免疫功能的影響[J]. 中國(guó)飼料, 2006, (5): 20-22.

[22] Cleary J A, Kelly G E, Husband A J. The effect of molecular weight and beta-1,6-linkages on priming of macrophage function in mice by (1,3)-beta-D-glucan[J]. Immunol Cell Biol, 1999, 77(5): 395-403.

[23] 陳小兵, 丁宏標(biāo), 喬宇. 甘露寡糖的益生作用、免疫機(jī)制與應(yīng)用技術(shù)[J]. 中國(guó)畜牧獸醫(yī), 2005, 32(8): 6-8.

[24] Safari O, Shahsavani D, Paolucci M, et al. The ef f ects of dietary nucleotide content on the growth performance, digestibility and immune responses of juvenile narrow clawed crayfish, Astacus leptodactylus leptodactylus Eschscholtz, 1823[J]. Aquac Resh, 2015, 46(11): 2685-2697.

[25] Romano N, Koh C B, Ng W K. Dietary microencapsulated organic acids blend enhances growth, phosphorus utilization, immune response, hepatopancreatic integrity and resistance against Vibrio harveyi in white shrimp, Litopenaeus vannamei[J]. Aquaculture, 2015, 435(3): 228-236.

S945.1

A

10.19556/j.0258-7033.2017-04-108

2017-01-20；

2017-02-14

2016年北京市科技型中小企業(yè)促進(jìn)專項(xiàng)項(xiàng)目（Z160 10101463）

劉明（1981-），男，山東萊陽(yáng)人，碩士，主要從事綠色飼料及飼料添加劑研發(fā)工作，E-mail：liuming@ hongkebio.cn

* 通訊作者：戴剛，碩士，主要從事綠色飼料及飼料添加劑研發(fā)工作，E-mail：daigang@hongkebio.cn