抗巨細胞病毒治療對獲得性免疫缺陷綜合征合并巨細胞病毒血癥患者外周血凋亡相關因子水平的影響*

聞 穎，周 瑩，孫翠明，王彥麗，劉 沛

抗巨細胞病毒治療對獲得性免疫缺陷綜合征合并巨細胞病毒血癥患者外周血凋亡相關因子水平的影響*

聞 穎，周 瑩，孫翠明，王彥麗，劉 沛

（中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 傳染科，遼寧 沈陽 110001）

目的 探討抗巨細胞病毒（CMV）治療對獲得性免疫缺陷綜合征（簡稱艾滋?。┖喜MV血癥患者的外周血凋亡相關因子水平的影響。方法 選取2014年1月1日～12月31日中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院確診住院的外周血CMVIgG陽性的男性艾滋病患者（CD4+T＜200個/μl）共34例（排除合并CMV視網(wǎng)膜炎者）。非隨機對照分為3組，陰性CMV血癥組（n=11）、陽性CMV血癥非抗CMV組（n=11）、陽性CMV血癥抗CMV組（n=12）。同時設立性別、年齡匹配的12例健康人做對照。同時全部入組患者于第3周末接受高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療。在隨訪12月末時，評價各組CD4+T細胞計數(shù)、CMV視網(wǎng)膜炎的發(fā)生率；評價外周血凋亡相關因子濃度的變化及組間差異。結(jié)果 與健康對照比較，艾滋病患者Fas、FasL、TRAIL、TNF-α水平升高（t=-3.369、-2.683、-4.321和-5.321，P=0.012、0.033、0.009和0.003），而Bcl-2水平降低（t=-4.321，P=0.001）。基線時3組年齡、HIVRNA載量、CD4+T細胞計數(shù)、WHO臨床分期差異無統(tǒng)計學意義；非抗CMV組與抗CMV組CMVDNA載量差異無統(tǒng)計學意義。與非抗CMV組比較，抗CMV組與陰性CMV血癥組12個月時CD4+T細胞計數(shù)升高（F=4.260，P=0.013和0.020）；外周血Bcl-2（F=3.621，P=0.009和0.006）、FasL（F=2.891，P= 0.024和0.002）、TNF-α濃度降低（F=4.912，P=0.003和0.001）；而抗CMV組與陰性CMV血癥組組間未見差異。與基線水平比較，艾滋病患者隨訪12個月時Fas、FasL和TRAIL水平下降（t=2.579、2.194和2.274，P= 0.015、0.035和0.030）。觀察期內(nèi)無CMV視網(wǎng)膜炎發(fā)生，無死亡病例，無HIV病毒學反彈發(fā)生。結(jié)論 抗CMV治療促進艾滋病合并CMV血癥患者的CD4+T細胞計數(shù)增長，這可能與外周血Bcl-2、FasL和TNF-α濃度降低有關。此外，高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療本身也可以降低Fas、FasL和TRAIL水平。

獲得性免疫缺陷綜合征；巨細胞病毒血癥；抗巨細胞病毒治療；凋亡

高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療（highly active antiretroviral therapy，HAART）在抑制人免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）復制同時引起CD4+T細胞上升，使艾滋病（acquired immunodeficiency syndrome，AIDS）的病死率明顯下降。本研究前期研究發(fā)現(xiàn)，人巨細胞病毒（Cytomegalovirus，CMV）感染是導致HAART后CD4+T細胞增長不良的重要因素[1-2]。APPAY等[3]也報道，啟動HAART時老齡與CMV共感染是HAART后免疫重建不良的原因。HIV/CMV共感染在中國十分普遍，更為重要的是CMV感染可加速HIV進展[4]。闡明CMV阻遏HAART后CD4+T細胞增長的機制及合理防治CMV感染，對改善HIV/CMV共感染者預后有重要意義[5]?；罨疶細胞的細胞死亡方式主要有2種：活化誘導的細胞死亡（activation-induced cell death，AICD）及活化T細胞自發(fā)死亡（T cell autonomous death，ACAD）。有文獻表明CMV特異性CD8+、CD4+T細胞可通過AICD及ACAD引起免疫T細胞凋亡[6-7]。在HIV嬰幼兒感染者中，急性CMV感染導致CD4+T細胞減少通過Fas途徑誘導CD4+T細胞凋亡[8]。在HIV成人感染者中，目前尚缺乏CMV共感染與T細胞凋亡相關機制的研究報道。本文動態(tài)評估艾滋病患者基線、HAART后12個月的CD4+T細胞計數(shù)、外周血凋亡相關因子（Fas、FasL、TRAIL、TNF-α和Bcl-2）濃度的動態(tài)變化，明確抗CMV治療（靜脈滴注更昔洛韋）對上述指標的影響，為其參與促進T細胞免疫重建的抗凋亡機制提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年1月1日～12月31日在中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院確診收治的男性艾滋病患者。納入標準：男性HIV感染者，年齡18～70歲，同時滿足3項條件：①CD4+T＜200個/μl。②外周血CMVIgG陽性。③無CMV視網(wǎng)膜炎。陽性CMV血癥定義：CMVDNA＞500 copies/ml。共納入患者34例，年齡20～67（40.13±14.25）歲，非隨機對照分組：陰性CMV血癥組（n=11）、陽性CMV血癥非抗CMV組（n=11）、陽性CMV血癥抗CMV組（n=12）。隨訪時間12個月。同時設立性別、年齡匹配的12例外周血CMVIgG陽性的健康人做外周血凋亡相關因子檢測對照。已經(jīng)取得全部患者的知情同意。

1.2 治療方法

全部患者均針對合并的其他機會性感染給予相應治療。陽性CMV血癥抗CMV組，應用更昔洛韋注射液靜脈滴注（單次劑量5 mg/kg，2次/d）治療5周；同時患者于第3周末行HAART治療（方案：拉米夫定+替諾福韋酯+依非韋倫）。

1.3 檢測方法與評價指標

1.3.1 檢測方法 用EDTA采血管分別收集基線、12個月外周血標本，2 000 r/min離心10 min，置入-70℃冰箱冷凍保存。應用上海西塘實業(yè)有限公司的酶聯(lián)免疫吸附試劑盒檢測人凋亡相關因子（Fas，CD95）、人凋亡相關因子配體（FasL）、TNF相關的凋亡誘導配體（TNF related apoptosis inducingligand，TRAIL）、人腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）、人B細胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2）水平。血漿CMV DNA定量檢測按照人CMV核酸擴增熒光定量檢測試劑盒（中山大學達安基因股份有限公司產(chǎn)品，批號：S20060056）。流式細胞儀（美國，BD公司，Aria)進行T淋巴細胞亞群分析（032046-D，北京賽馳生物科技有限公司）。HIV RNA定量檢測采用全自動病毒載量測定儀（Roche公司，COBAS），按照co-BAS TaqMan HIV-1 Test v2.0試劑盒操作。

1.3.2 評價指標 評價患者基線CMVDNA載量、HIVRNA載量、CD4+T細胞計數(shù)、WHO臨床分期有無差異。隨訪12個月末時評價患者CD4+T細胞計數(shù)、CMV視網(wǎng)膜炎的發(fā)生率、死亡率的差異。評價5種外周血可溶性凋亡相關因子（Fas、FasL、TRAIL、TNF-α和Bcl-2）的濃度的動態(tài)變化及組間差異。于基線、12個月時各評估患者眼底1次。

1.4 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，3組間計量資料比較方差齊者應用單因素方差分析，否則應用非參數(shù)檢驗；兩組間比較用兩獨立樣本t檢驗。患者治療前后計量資料比較用配對t檢驗；3組間計數(shù)資料的比較用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床轉(zhuǎn)歸

抗CMV組中全部病例均于4周內(nèi)出現(xiàn)CMV DNA陰轉(zhuǎn)，有3例因外周白細胞減少，曾予口服利可君提升白細胞治療。全部病例于第3周末行HAART治療（方案：拉米夫定+替諾福韋酯+依非韋倫）。觀察期內(nèi)兩組均無CMV視網(wǎng)膜炎發(fā)生。沒有死亡病例，無HIV病毒學反彈發(fā)生。

2.2 基線時各組指標比較

34例患者中，29例CD4+T細胞計數(shù)＜100個/ μl(占85.29%)。其中陰性CMV血癥組（n=11）、陽性CMV血癥非抗CMV組（n=11）、陽性CMV血癥抗CMV組（n=12）。3組在年齡、HIVRNA載量、CD4+T細胞計數(shù)、WHO臨床分期比較差異無統(tǒng)計學意義（F=0.621、0.756和0.549，P=0.532、0.433和0.645；χ2=0.215，P=0.323）。CMV DNA載量在陽性CMV血癥非抗CMV組與陽性CMV血癥抗CMV組兩組間差異無統(tǒng)計學意義（t=-1.696，P=0.315）。見表1。

與健康對照比較，艾滋患者基線Fas、FasL、TRAIL和TNF-α水平升高（t=-3.369、-2.683、-4.321和-5.321，P=0.012、0.033、0.009和0.003），而Bcl-2水平降低（t=-4.321，P=0.001）（見表2）?；€時各組Fas、FasL、TRAIL、TNF-α和Bcl-2水平差異無統(tǒng)計學意義（F=0.332、0.733、0.064、1.522和1.853，P=0.720、0.488、0.938、0.234和0.098）。見表3。

2.3 12個月時各組指標比較

與陽性CMV血癥非抗CMV組比較，抗CMV組與陰性CMV血癥組12個月時有較高的CD4+T細胞計數(shù)（F=4.260，P=0.013和0.020）；同時外周血Bcl-2濃度降低（F=3.621，P=0.001、0.000和0.006）；FasL的濃度降低（F=-2.891，P=0.002、0.024和0.002）；TNF-α的濃度降低（F=4.912，P=0.000、0.003和0.001）（見表3）；而抗CMV組與陰性CMV血癥組組間在 12個月時的 CD4+T細胞計數(shù)、Bcl-2、FasL、TNF-α 的濃度未見差異（P=0.403、0.521、0.216和0.198）。各組Fas和TRAIL在12個月時差異無統(tǒng)計學意義（F=0.843和0.992，P=0.501和0.482）。

2.4 基線與12個月時指標比較

全部患者在12個月時HIVRNA載量、CMV DNA載量轉(zhuǎn)陰，CD4+T細胞計數(shù)較基線時上升，但仍有13例患者CD4+T細胞計數(shù)＜100個/μl（占38.24%）。與基線水平比較，艾滋病患者隨訪12個月時Bcl-2、Fas和FasL水平下降（t=2.579、2.194和2.274，P=0.015、0.035和0.030），而TNF-α和TRAIL濃度的變化差異無統(tǒng)計學意義（t=1.950和-1.541，P=0.060和0.133）。見表4。

表1 艾滋病患者基線各組基線臨床指標比較 （x±s）

表2 兩組基線外周血可溶性凋亡相關因子水平比較 （pg/ml，x±s）

表3 艾滋病患者基線、12個月時外周血可溶性凋亡相關因子水平組間比較 （pg/ml，x±s）

表4 艾滋患者基線與12個月時外周血可溶性凋亡相關因子水平比較 （pg/ml，x±s）

3 討論

本研究結(jié)果提示，與健康對照比較，艾滋病患者外周血 Fas、FasL、TRAIL和 TNF-α 水平升高，Bcl-2水平降低，再次證實細胞凋亡是HIV感染T細胞丟失的一個重要原因；HAART治療可以降低Fas、FasL和TRAIL水平，再次證實HAART治療引起的細胞免疫重建伴隨著T細胞凋亡的減少；抗CMV治療促進艾滋病合并CMV血癥患者的CD4+T細胞計數(shù)增長，這與前期研究結(jié)果一致，其機制可能與外周血凋亡因子Bcl-2、FasL、TNF-α濃度降低有關，提示其促進T細胞免疫重建的抗凋亡機制。HUNT[9]曾報道，其與降低異常免疫活化有關。

CMV特異性T細胞免疫介導的免疫控制在CMV感染中起著決定性作用，該點已經(jīng)在器官移植受者得到廣泛證實[10]。由于抗CMV治療有助于CMV特異性T細胞免疫功能的恢復，因此在器官移植領域已將對CMV特異性免疫的監(jiān)測決策啟動/停止抗CMV治療列入指南。而針對HIV/CMV感染的患者，這方面研究結(jié)果較少，目前僅僅涉及對CMV視網(wǎng)膜炎的治療。以往的文獻曾觀察HAART治療對巨細胞特異性T細胞免疫的影響。HAART治療前，產(chǎn)生IFN-r的CMV特異性CD4+T幾乎消失；CMV特異性CD8+T細胞數(shù)量雖然無明顯減少，但產(chǎn)生IFN-r的細胞比例明顯下降，而產(chǎn)生穿孔素、顆粒酶B的細胞比例上升；HAART治療后，CMV特異性的T細胞免疫出現(xiàn)不完全的重建，抗原刺激后的T細胞增殖反應與產(chǎn)生細胞因子能力之間很不一致[11]。該結(jié)果提示，僅僅HAART治療難以滿意重建CMV特異性的T細胞免疫，而后者與艾滋病患者的預后息息相關。因此，對伴有CMV血癥的艾滋病患者，明確抗CMV治療是否有助于改善巨細胞特異性T細胞免疫以及探索相關機制具有重要意義。

艾滋病是一種T細胞過度凋亡的疾病，其機制涉及多種凋亡基因及信號轉(zhuǎn)導途徑的激活[12]。一種是死亡受體途徑，屬于外源性凋亡途徑，如Fas、TNF受體1和TRAIL受體等，可被TNF家族成員FasL、TNF-α和TRAIL等激活，其中Fas是AICD的主要調(diào)節(jié)者。另一種是線粒體-細胞色素C釋放途徑，屬于內(nèi)源性凋亡途徑，如Bcl-2家族[13]。隨訪中發(fā)現(xiàn)，抗CMV治療組FasL、TNF-a濃度是降低的，揭示了其參與了外源性抗凋亡機制。雖然有文獻指出TRAIL參與了旁觀者T細胞的凋亡[14]，而在本研究中TRAIL濃度組間差異無統(tǒng)計學意義，未提示其參與抗CMV治療抗凋亡機制。Bcl-2主要發(fā)揮抗凋亡機制。雖然與健康對照比較，HIV患者Bcl-2水平是降低的，該點與先前研究一致。但本研究卻發(fā)現(xiàn), HAART治療后Bcl-2水平降低；抗CMV治療組Bcl-2水平降低的更加明顯，其原因可能為：Bcl-2抑制凋亡的作用不是萬能，凋亡途徑對Bcl-2水平敏感與否與細胞類型有關，而該差異取決于線粒體是否參與這種凋亡途徑[15]；Bcl-2不是HAART治療與抗CMV治療抗凋亡機制中的參與因素。

綜上所述，抗CMV治療促進艾滋病合并CMV血癥患者的CD4+T細胞計數(shù)增長，其機制可能與外周血凋亡因子Bcl-2、FasL和TNF-α濃度降低有關，進一步明確其抗凋亡的具體途徑，即Fas途徑、TNF受體1途徑和Bcl-2途徑等是下一步的研究方向。

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（張西倩 編輯）

Effect of anti-cytomegalovirus therapy on blood levels of apoptosisrelated factors in patients with AIDS and cytomegalovirus viremia*

Ying Wen,Ying Zhou,Cui-ming Sun,Yan-li Wang,Pei Liu
(Department of Infectious Diseases,the First Affiliated Hospital of China Medical University, Shenyang,Liaoning 110001,China)

Objective To explore the effect of anti-cytomegalovirus therapy on the blood levels of apoptosisrelated factors of patients with acquired immunodeficiency syndrome(AIDS)and cytomegalovirus(CMV)viremia. Methods The study was carried out in the 34 male hospitalized patients who were newly diagnosed as AIDS in the First Affiliated Hospital of China Medical University from January 1,2014 to December 31,2014.The patients were divided into CMV viraemia negative group(n=11),CMV viraemia positive non-treatment group(n=11),and CMV viraemia positive treatment group(n=12).Meanwhile 12 healthy controls were included.The baseline age,CMVDNA,HIV-RNA,CD4+T cells and World Health Organization clinical stages were evaluated in the groups.Patients received highly active antiretroviral therapy at the end of the 3rd week.CD4+T cell count,the incidence of CMVretinitis and the blood levels of apoptosis-related factors were evaluated at the end of the 12th month.Results Compared with the health controls,the levels of Fas,FasL,TRAIL and TNF-α increased in the patients with AIDS (t=-3.369,-2.683,-4.321 and-5.321;P=0.012,0.033,0.009 and 0.003 respectively),while the level of Bcl-2 was lowered(t=-4.321,P=0.001).There was no significant difference in the baseline age,HIV-RNA load,CD4+T cell count or WHO clinical stages among the three disease groups.There was no difference in the CMV-DNA load between the CMV non-treatment group and the CMV treatment group.At the end of the 12th month,compared with the CMV non-treatment group,the CD4+T cell count increased (F=4.260,P=0.013 and 0.020),lower levels of Bcl-2(F=3.621,P=0.009 and 0.006),FasL(F=2.891,P=0.024 and 0.002)and TNF-α(F=4.912,P=0.003 and 0.001)were found in both the CMV treatment and CMV negative groups;while there were no differences between the CMV treatment group and the CMV negative group.Compared with levels at baseline,the levels of Fas, FasL and TRAIL were decreased at the end of the 12th month in the AIDS patients(t=2.579,2.194 and 2.274;P= 0.015,0.035 and 0.030).There was no occurrence of CMV retinitis,death or virological rebound.Conclusions Anticytomegalovirus therapy is beneficial to the increment of CD4+T cells in patients with AIDS and CMV viremia,which may be due to obvious decrease in blood levels of Bcl-2,FasL and TNF-α.Furthermore,the levels of Fas,FasL and TRAIL are also decreased after highly active antiretroviral therapy.

acquired immunodeficiency syndrome;cytomegalovirus viremia;anti-cytomegalovirus therapy; apoptosis

R512.91

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.04.009

1005-8982（2017）04-0046-05

2016-04-19

遼寧省自然科學基金（No：2013021013）