• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    組蛋白修飾的結腸癌臨床預后價值與年齡的相關性研究

    2017-04-17 02:19:26賈業(yè)貴王國樑
    中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志 2017年4期
    關鍵詞:表觀甲基化結腸癌

    賈業(yè)貴,王國樑

    組蛋白修飾的結腸癌臨床預后價值與年齡的相關性研究

    賈業(yè)貴1,王國樑2

    (1.江漢大學附屬醫(yī)院 消化內科,湖北 武漢 430015;2.江漢大學醫(yī)學院,湖北 武漢 430056)

    目的 評價組蛋白修飾在TNMⅠ~Ⅲ期結腸癌患者腫瘤細胞中的表達及其預后價值,并進一步探討組蛋白修飾表達預后價值與年齡的相關性。方法 采用免疫組織化學方法檢測254例TNMⅠ~Ⅲ期CRC患者組織芯片中組蛋白修飾表達情況。根據(jù)生存狀態(tài)對患者進行分組,比較各組間組蛋白修飾形態(tài)H3K9ac和H3K27me3表達差異及其與年齡的相關性。結果 隨著年齡增長,組蛋白修飾在隨訪期間存活患者中表達降低,而隨著年齡增長,組蛋白修飾在隨訪期間復發(fā)或死亡患者中表達增加。組蛋白修飾在兩組間的表達差異表明組蛋白修飾在結腸癌中的預后價值與年齡相關。組蛋白修飾細胞核高表達在年齡更低組中提示較好的臨床結局,而在年齡更高組中提示更差的臨床結局。結論 組蛋白修飾物H3K9ac和H3K27me3在細胞核中單獨或聯(lián)合高表達對結腸癌患者具有預后價值。隨著年齡增加表觀遺傳標志物的預后影響不但發(fā)生變化,甚至發(fā)生逆轉。年青和年老結腸癌患者的生物學存在差異,年齡對結腸癌具有重要影響。

    結腸癌;預后價值;組蛋白修飾;年齡

    年齡老化通常伴有基因轉錄特征改變和基因組不穩(wěn)定,是包括腫瘤在內的眾多人類疾病的主要危險因素?;蚝捅碛^遺傳學機制調控細胞功能是十分復雜而又精確的過程[1-3]。表觀遺傳學類型在年齡老化過程中發(fā)生改變,該現(xiàn)象被稱之為“表觀遺傳學漂移”,例如,隨著年齡增長,DNA主動去甲基化反應(global deme-thylation)明顯降低[4-5]。年齡相關DNA去甲基化也與組蛋白修飾類型變化有關[6]。例如,組蛋白H3賴氨酸第9位點乙?;╝cetylation of histone 3 lysine 9,H3K9ac)和組蛋白H3賴氨酸第27位點三甲基化(trimethylation of histone 3 lysine 27,H3K27me3)等組蛋白修飾隨著年齡增長,在正常細胞內整體表達下降。組蛋白修飾調控染色質結構,從而可調節(jié)轉錄、復制及DNA修復活性等。在正常細胞基因表達過程中,H3K9ac和H3K27me3分別呈陽性和陰性表達。通常組蛋白修飾類型H3K9ac發(fā)生在轉錄更為活躍的基因中。相反,H3K27me3修飾特異性與端粒近端區(qū)域和部分沉默基因相關。但是目前也有研究證實在端粒近端區(qū)域存在H3K9ac。多項研究證實,隨著患者年齡增加,腫瘤細胞全基因組內CpG島甲基化快速增加,而非CpG島甲基化迅速降低。正常組織中70%~90%的CpG位點表達與年齡有關,而在數(shù)種腫瘤中,這些CpG位點表達明顯增加。還有研究發(fā)現(xiàn)在小鼠中早期抑制DNA甲基化能夠預防腫瘤形成,該研究結果提示老化過程加速或失控能夠導致腫瘤形成。

    本文主要探討手術時腫瘤患者年齡和原發(fā)腫瘤中表觀遺傳學類型表達失控的相關性及預后價值。本實驗采用免疫組織化學方法檢測H3K9ac和H3K27me3在腫瘤細胞核中的表達情況,并分析其表達的臨床和預后意義。

    1 資料與方法

    1.1 研究對象

    254例在江漢大學附屬醫(yī)院住院治療的TNM分期為Ⅰ~Ⅲ期的結腸癌患者納入本次研究。收集患者手術時年齡、性別、TNM分期、腫瘤部位、腫瘤直徑、微衛(wèi)星狀態(tài)、腫瘤史、輔助治療和復發(fā)等信息,隨訪截止至2014年12月。

    1.2 H3K9ac和H3K27me3檢測

    患者腫瘤組織芯片由美國生物公司biomax制作。采用免疫組織化學法在組織芯片上檢測H3K9ac(ab61231,美國Abcam公司),H3K27me3(ab6002,美國Abcam公司)表達。采用德國徠卡公司semiautomated Ariolsystem分析H3K9ac和H3K27me3在細胞核中陽性染色情況。每例患者隨機選擇組織芯片中3個點的平均陽性率用于生存分析。根據(jù)患者生存狀態(tài)分層后,包括年齡交互作用在內的線性回歸方法分析手術時年齡和組蛋白修飾的相關性。

    1.3 統(tǒng)計學方法

    采用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析,Kaplan-Meier法預測生存率,采用Cox比例風險模型分析H3K9ac或H3K27me3核表達在結腸癌患者中的預后價值。單因素和多因素分析單個標志物對患者結局的影響。所有統(tǒng)計均為雙側檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結果

    2.1 組蛋白標志物表達與年齡的相關性

    H3K9ac和H3K27me3表達與標準臨床病理參數(shù)均無相關性,提示腫瘤細胞中H3K9ac和H3K27 me3核表達與年齡無相關性(見表1)。但是根據(jù)患者的生存狀態(tài)分層后,腫瘤細胞中H3K9ac和H3K27 me3等組蛋白修飾表達類型與年齡存在相關性(見圖1A)。在隨訪期結束后仍存活的患者中(生存組),H3K9ac和H3K27me3隨著年齡增長,表達降低,而在隨訪期結束后死亡或復發(fā)的患者中(死亡或復發(fā)組),H3K9ac和H3K27me3隨著年齡增長,表達升高。將生存組不同年齡階段患者H3K9ac和H3K27me3的平均表達量減去死亡或復發(fā)組患者H3K9ac和H3K27me3的平均表達量,評價兩組患者H3K9ac和H3K27me3平均表達量的差異,結果發(fā)現(xiàn)隨著年齡增長,兩組間差異下降(圖1B和見表2)。H3K9ac和H3K27me3在結腸癌中的表達見圖1C。

    2.2 H3K9ac或H3K27me3表達的預后價值

    采用 Cox比例風險模型分析 H3K9ac或H3K27me3核表達在結腸癌患者中的預后價值,結果發(fā)現(xiàn)生存組和死亡或復發(fā)組間 H3K9ac或H3K27me3核表達水平和手術時年齡存在相關性。當未考慮年齡交互作用時,單因素方差分析和多因素生存分析表明H3K9ac或H3K27me3核表達無預后價值。而將H3K9ac或H3K27me3核表達作為連續(xù)變量進行單因素和多因素生存分析發(fā)現(xiàn),H3K9ac或H3K27me3核表達對結腸癌患者臨床結局具有顯著年齡依賴的預后價值(見表3)。單因素方差分析

    和多因素分析H3K9ac表達及H3K9ac表達與手術時年齡的交互作用表明,H3K9ac表達與疾病特異性生存率(disease-specific survival,DSS)、無局部復發(fā)生存率(recurrence-free survival,LRRFS)和無遠處復發(fā)生存率(distantrecurrence-free survival,DRFS)密切相關,而H3K27me3表達與年齡的交互作用與LRRFS和DRFS有關。此外,交互作用分析還表明H3K9ac或H3K27me3核表達與臨床結局關系隨年齡增長而發(fā)生改變(見圖2A)。在年齡<65歲的患者中,H3K9ac或H3K27me3核表達高于平均水平與患者預后較好相關,低于平均水平則與患者預后較差有關。相反,在年齡≥65歲的患者中,H3K9ac或H3K27me3核表達高于平均水平與患者預后較差相關,低于平均水平則與患者預后較好有關。總之,多因素生存分析表明H3K9ac或H3K27me3的核表達是年齡依賴的結腸癌患者臨床結局的預后因素。

    表1 單個標志物狀態(tài)與臨床參數(shù)相關性分析 例(%)

    圖1 與死亡或復發(fā)相關的組蛋白修飾在手術時不同年齡組結腸癌患者中的表達差異

    表2 相同年齡組生存患者與死亡或復發(fā)患者組蛋白修飾表達的差值比較 (%,x±s)

    表3 單因素和多因素分析單個標志物對患者結局的影響

    2.3 H3K9ac和H3K27me3聯(lián)合表達對臨床結局的影響

    H3K9ac和H3K27me3在腫瘤細胞中的陽性表達水平分別為93.2%和92.9%。根據(jù)H3K9ac和H3K27me3的表達水平將患者分為3組:組1:H3K9ac和H3K27me3的表達水平均低于平均水平;組2:H3K9ac或H3K27me3的表達水平均高于平均水平;組3:H3K9ac和H3K27me3的表達水平均高于平均水平。H3K9ac和H3K27me3聯(lián)合表達除了與微衛(wèi)星穩(wěn)定狀態(tài)相關外,與其他標準臨床參數(shù)都不相關,隨著高于平均表達水平的組蛋白修飾數(shù)量增加,微衛(wèi)星穩(wěn)定腫瘤的數(shù)量也增加(見表4)。同樣,多元生存分析H3K9ac和H3K27me3聯(lián)合表達及其與手術時年齡的交互作用表明,H3K9ac和H3K27me3聯(lián)合表達與總生存期(overall survival,OS)、DSS、LRRFS和DRFS相關。此外,交互統(tǒng)計分析還發(fā)現(xiàn)隨著年齡增長,H3K9ac和H3K27me3聯(lián)合表達與臨床結局的相關性也發(fā)生改變。在年齡<65歲的患者中,高于平均表達水平的組蛋白修飾類型越多與患者臨床結局較好相關。相反,在年齡≥65歲的患者中,高于平均表達水平的組蛋白修飾類型越少與患者臨床結局較好相關(見圖2B)。

    表4 單因素和多因素分析H3K9ac和H3K27me3聯(lián)合表達對患者結局的影響

    圖2 H3K9ac單獨(A)或聯(lián)合H3K27me3(B)表達對結腸癌患者結局的影響

    3 討論

    本文實驗結果表明,組蛋白修飾H3K9ac和H3K27me3單獨或聯(lián)合表達是結腸癌患者年齡依賴的預后因素。就筆者所能查閱到的文獻,本研究是國內首次探討表觀遺傳學生物標志物在結腸癌中預后機制與年齡的相關性。免疫組織化學結果顯示,年齡<65歲患者中,H3K9ac或H3K27me3核表達高于平均水平與患者預后較好相關,低于平均水平則與患者預后較差有關。相反,年齡≥65歲患者中,H3K9ac或H3K27me3核表達高于平均水平與患者預后較差相關,低于平均水平則與患者預后較好有關。以往也有研究發(fā)現(xiàn),某些條件或基因、蛋白表達水平對臨床結局有利或不利的影響與患者年齡相關。例如,RAMSEY等[7]識別自閉癥譜系障礙(Autism Spectrum Disorder,ASD)患者中存在12種血清蛋白具有年齡依賴的生物標志物特征。通過分析ASD患者和其健康同胞中該血清蛋白與年齡的關系,發(fā)現(xiàn)隨著年齡增長,該蛋白的表達發(fā)生相反的改變,提示該蛋白以年齡依賴方式影響ASD患者。同樣,表觀遺傳學調控對不同年齡段患者的影響也有差異。由于H3K9ac和H3K27me3對基因表達的影響不同,激活組蛋白修飾H3K9ac和沉默組蛋白修飾H3K27me3對結腸癌患者臨床結局應該有相反的作用。然而,蛋白編碼基因僅占基因組很小一部分,本研究發(fā)現(xiàn)H3K9ac和H3K27me3在腫瘤基因組中的表達對臨床結局有相同影響,且都具有年齡依賴性。除了在基因組中整體表達水平,也有研究分析組蛋白修飾在單個基因中的表達情況[8]。由于以往研究主要關注正常細胞基因組中DNA甲基化和特異性組蛋白修飾與年齡相關的整體變化情況,本研究主要分析腫瘤細胞基因組中組蛋白修飾H3K9ac和H3K27me3的中表達情況。

    研究已經(jīng)證實,正常組織中所有組蛋白修飾全局表達水平隨著年齡增長逐漸下降[9]。本組生存患者中組蛋白修飾H3K9ac和H3K27me3隨年齡增長而表達下降,其可能原因與端粒長度縮短過程有關。正常細胞中端粒隨著年齡增長而不斷縮短,最終導致細胞衰老[10]。端粒長度縮短有助于年齡相關組蛋白總量下降,而年齡相關組蛋白總量下降是人類基因組穩(wěn)定的重要條件,因此隨著年齡增長,正常細胞內修飾組蛋白總量也隨之下降。

    本研究隨訪期間死亡或復發(fā)患者中H3K9ac和H3K27me3組蛋白修飾在結腸癌細胞核中表達隨年齡增長而增加,該結果提示表觀遺傳學能夠調控腫瘤細胞復制性永生化。復制性永生化是由端粒延長引起的一種腫瘤特異性生長現(xiàn)象,端粒長度可以通過持續(xù)表達人端粒酶逆轉錄酶(human telomerase re-verse transcriptase,hTERT)維持,hTERT是端粒酶的催化亞基[11-12]。H3K乙?;潭仍黾雍?,由于缺少募集至hTERT近端啟動子的組蛋白去乙酰化酶2(histone deacetylase 2,HDAC2),導致hTERT表達增加和端粒酶激活,由此促進腫瘤細胞生存。以往研究表明正常細胞過程中由于染色質致密化喪失,引起H3K27me3表達隨年齡增長而下降,由此最終導致基因整體表達水平增加[13]。維持H3K27高水平三甲基化對細胞壽命十分重要[14-15]。本研究死亡或復發(fā)結腸癌患者中H3K27me3表達隨年齡增長而增加,H3K27me3表達增加與腫瘤細胞壽命延長和生存率提高有關,與該發(fā)現(xiàn)一致的是,該患者中H3K9ac表達也增加,而H3K9ac表達增加能夠激活端粒酶。正常細胞內H3K9ac和H3K27me3表達隨年齡增長而下降,而在腫瘤中當H3K9ac和H3K27me3表達隨年齡增長而增長時,提示患者死亡復發(fā)風險更高,臨床結局更差。因此,當腫瘤細胞內H3K9ac和H3K27me3表達隨年齡增長而增長與腫瘤細胞壽命更長和生存率更高相關,也與腫瘤侵襲性高相關,由該患者臨床結局更差??傊?,H3K9ac和H3K27me3表達都與細胞生存和壽命有關,且兩種標志物具有協(xié)同作用,聯(lián)合檢測H3K9ac和H3K27me3表達在結腸癌患者預后中的價值更顯著。

    [1]KLIRONOMOS F D,BERG J,COLLINS S.How epigenetic mutations can affect genetic evolution:model and mechanism[J]. Bioessays,2013,35(6):571-578.

    [2]YOU J S,JONES P A.Cancer genetics and epigenetics:two sides of the same coin[J].Cancer Cell,2012,22(1):9-20.

    [3]劇宏燕,柴秀坤,白文元.結直腸癌的表觀遺傳學[J].世界華人消化雜志,2014,22(15):2128-2133.

    [4]JOHNSON A A,AKMAN K,CALIMPORT S R G,et al.The role of DNA methylation in aging,rejuvenation,and age-related disease[J].Rejuvenation Research,2012,15(5):483-494.

    [5]BERGMAN Y,CEDAR H.DNA methylation dynamics in health and disease[J].Nature Structural&Molecular Biology,2013,20(3): 274-281.

    [6]XU Z,TAYLOR J A.Genome-wide age-related DNA methylation changes in blood and other tissues relate to histone modification, expression and cancer[J].Carcinogenesis,2014,35(2):356-364.

    [7]RAMSEY J M,GUEST P C,BROEK J A C,et al.Identification of an age-dependent biomarker signature in children and adolescents with autism spectrum disorders[J].Molecular Autism,2013, 4(1):1.

    [8]DE KRUIJF EM,BASTIAANNET E,RUBERTA F,et al.Comparison of frequencies and prognostic effect of molecular subtypes between young and elderly breast cancer patients[J].Mol Oncol 2014,8(2):1014-1025.

    [9]HALLAN S I,MATSUSHITA K,SANG Y,et al.Age and association of kidney measures with mortality and end-stage renal disease[J].JAMA,2012,308(9):2349-2360.

    [10]GAUDET M M,PRESS M F,HAILE R W,et al.Risk factors by molecularsubtypesofbreastcanceracrossa population-based study of women 56 years or younger[J].Breast Cancer Res Treat,2011,130(21):587-597.

    [11]ZHANG Y,LI Q,CHEN H.DNA methylation and histone modifications of Wnt genes by genistein during colon cancer development[J].Carcinogenesis 2013,34(29):1756-1763.

    [12]LIQ,CHEN H.SilencingofWnt5aduringcolon cancer metastasis involves histone modifications[J].Epigenetics,2012,7: 551-558.

    [13]ENROTH S,RADA-IGLESISAS A,ANDERSSON R,et al. Cancer associated epigenetic transitions identified by genomewide histone methylation binding profiles in human colorectal cancer samples and paired normal mucosa[J].BMC Cancer, 2011,11(13):450-452.

    [14]O’SULLIVAN R J,KUBICEK S,SCHREIBER S L,et al Reduced histone biosynthesis and chromatin changes arising from a damage signal at telomeres[J].Nat Struct Mol Biol,2010,17(9): 1218-1225.

    [15]HANAHAN D,WEINBERG R A.The hallmarks of cancer[J]. Cell,2000,100(286):57-70.

    (張蕾 編輯)

    Age-dependent clinical prognostic value of histone modifications in colorectal cancer

    Ye-gui Jia1,Guo-liang Wang2
    (1.Department of Gastroenterology,the Affiliated Hospital of Jianghan University,Wuhan,Hubei 430015,China;2.Medical College of Jianghan University,Wuhan,Hubei 430056,China)

    Objective To assess the expression of histone modifications in tumor cells of the patients with TNM stage I-III colorectal cancer (CRC)and its clinical outcome and association with age at surgery.Methods To quantify expression,immunohistochemical staining of the histone modifications was performed on a tissue microarray containing colorectal tissues of the 254 patients with TNM stage I-III CRC.The patients were stratified according to survival status and age-related tumor expression patterns of both H3K9ac and H3K27me3 were compared.Results Decreased expression with advancing age was observed in the patients who were alive after follow-up(no-event group),whereas increased expression with advancing age was observed in the patients who presented with a recurrence or death during follow-up(event group).These opposite expression patterns translated into age-dependent prognostic value of the individual histone modifications and their combination in CRC.The prognostic value reversed with increasing age,high nuclear expression associated with good clinical outcome in the young adults,in contrast, with poor clinical outcome in the elderly patients.Conclusions We identified an age-dependent prognostic effect of nuclear expressions of histone modifications H3K9ac and H3K27me3 and their combination in patients with CRC. We have demonstrated for the first time the prognostic impact of an epigenetic marker can not only change but also reverse with increasing age.This observation supports the hypothesis that CRC biology is distinct between young adults and the elderly and emphasizes the importance of focusing on age-related effects in CRC.

    colorectal cancer;prognostic value;istone modifications;age

    R735.35

    A

    10.3969/j.issn.1005-8982.2017.04.007

    1005-8982(2017)04-0033-07

    2016-05-31

    猜你喜歡
    表觀甲基化結腸癌
    綠盲蝽為害與赤霞珠葡萄防御互作中的表觀響應
    河北果樹(2021年4期)2021-12-02 01:14:50
    鋼結構表觀裂紋監(jiān)測技術對比與展望
    上海公路(2019年3期)2019-11-25 07:39:28
    例析對高中表觀遺傳學的認識
    MicroRNA-381的表達下降促進結腸癌的增殖與侵襲
    結腸癌切除術術后護理
    鼻咽癌組織中SYK基因啟動子區(qū)的甲基化分析
    胃癌DNA甲基化研究進展
    表觀遺傳修飾在糖脂代謝中的作用
    遺傳(2014年3期)2014-02-28 20:58:52
    基因組DNA甲基化及組蛋白甲基化
    遺傳(2014年3期)2014-02-28 20:58:49
    全甲基化沒食子兒茶素沒食子酸酯的制備
    国产精品精品国产色婷婷| 男人和女人高潮做爰伦理| 国产男人的电影天堂91| 亚洲av.av天堂| 精品午夜福利在线看| 黄片无遮挡物在线观看| 亚洲人成网站在线观看播放| 2021少妇久久久久久久久久久| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 久久女婷五月综合色啪小说 | 国产乱人偷精品视频| 一二三四中文在线观看免费高清| 久久99热这里只有精品18| 午夜福利网站1000一区二区三区| 亚洲,欧美,日韩| 干丝袜人妻中文字幕| 久久影院123| 免费观看在线日韩| 国产日韩欧美亚洲二区| 大片免费播放器 马上看| 国产高潮美女av| 成人二区视频| 午夜老司机福利剧场| 国产精品三级大全| 久久热精品热| 免费看光身美女| 国产免费又黄又爽又色| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 成人无遮挡网站| 国产精品爽爽va在线观看网站| 精品久久久久久久久亚洲| 欧美精品一区二区大全| 不卡视频在线观看欧美| 久久久久久久亚洲中文字幕| 成年免费大片在线观看| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 一区二区av电影网| 成人毛片a级毛片在线播放| 午夜免费男女啪啪视频观看| 亚洲人与动物交配视频| 在线观看美女被高潮喷水网站| 卡戴珊不雅视频在线播放| 街头女战士在线观看网站| 亚洲人成网站在线观看播放| 亚洲欧美成人精品一区二区| 欧美日韩亚洲高清精品| 国产精品嫩草影院av在线观看| 中文精品一卡2卡3卡4更新| eeuss影院久久| 欧美日韩综合久久久久久| 欧美老熟妇乱子伦牲交| av黄色大香蕉| 成年人午夜在线观看视频| 免费观看性生交大片5| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 大香蕉久久网| 久久久久网色| 久久国产乱子免费精品| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 黄色视频在线播放观看不卡| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 日韩电影二区| 六月丁香七月| 国产一区二区三区av在线| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频 | 2022亚洲国产成人精品| 黄色配什么色好看| 老女人水多毛片| 简卡轻食公司| 一级二级三级毛片免费看| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 亚洲,欧美,日韩| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 亚洲精品色激情综合| 亚洲精品亚洲一区二区| 欧美激情国产日韩精品一区| 亚洲av在线观看美女高潮| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 久久久亚洲精品成人影院| 午夜免费男女啪啪视频观看| 18禁动态无遮挡网站| 国内精品宾馆在线| 美女国产视频在线观看| 在线观看av片永久免费下载| 亚洲经典国产精华液单| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 久久精品夜色国产| 69人妻影院| 国产亚洲91精品色在线| 99热国产这里只有精品6| 亚洲av中文av极速乱| 身体一侧抽搐| 亚洲成色77777| 国产午夜精品一二区理论片| 乱码一卡2卡4卡精品| 免费看av在线观看网站| 男男h啪啪无遮挡| 综合色丁香网| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 亚洲伊人久久精品综合| 日韩欧美精品v在线| av在线蜜桃| 岛国毛片在线播放| 秋霞伦理黄片| 日韩一区二区视频免费看| 久久精品久久久久久久性| 街头女战士在线观看网站| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 久久精品久久精品一区二区三区| 男女边摸边吃奶| 99热这里只有是精品50| 一级毛片我不卡| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 亚洲欧美日韩东京热| 三级国产精品片| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 中国国产av一级| a级毛片免费高清观看在线播放| 麻豆国产97在线/欧美| 啦啦啦在线观看免费高清www| 免费电影在线观看免费观看| 草草在线视频免费看| 我的女老师完整版在线观看| 激情 狠狠 欧美| av国产精品久久久久影院| 国产视频首页在线观看| 久久99热这里只有精品18| eeuss影院久久| 亚洲精品一二三| 神马国产精品三级电影在线观看| 久久久久性生活片| 久久影院123| 亚洲最大成人av| 久久久精品欧美日韩精品| 亚洲精品国产成人久久av| 欧美少妇被猛烈插入视频| 亚洲怡红院男人天堂| 美女主播在线视频| 久久精品国产自在天天线| 又大又黄又爽视频免费| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 精品国产乱码久久久久久小说| 五月伊人婷婷丁香| 日韩中字成人| 91久久精品电影网| 边亲边吃奶的免费视频| 1000部很黄的大片| 我的老师免费观看完整版| 亚洲成人av在线免费| av天堂中文字幕网| 亚洲,欧美,日韩| 搞女人的毛片| 搞女人的毛片| 国产毛片a区久久久久| 99re6热这里在线精品视频| av在线亚洲专区| 黄色日韩在线| 亚洲av二区三区四区| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 乱系列少妇在线播放| 一本久久精品| 69av精品久久久久久| 听说在线观看完整版免费高清| 亚洲自偷自拍三级| 成人黄色视频免费在线看| 国产成人freesex在线| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 欧美日韩亚洲高清精品| 国产精品伦人一区二区| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 久久6这里有精品| 亚洲精品国产成人久久av| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 26uuu在线亚洲综合色| 2021天堂中文幕一二区在线观| 亚洲经典国产精华液单| 国产成人午夜福利电影在线观看| 成人综合一区亚洲| 亚洲成人久久爱视频| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 丝袜美腿在线中文| 欧美日韩国产mv在线观看视频 | 久久久久久国产a免费观看| 99热这里只有是精品50| 久热这里只有精品99| 国产在线男女| 在线精品无人区一区二区三 | 国产午夜精品一二区理论片| 欧美高清成人免费视频www| 熟女av电影| 免费看不卡的av| 日韩成人伦理影院| 亚洲最大成人中文| av天堂中文字幕网| 国产成人午夜福利电影在线观看| 在线观看人妻少妇| 国产成人a区在线观看| 国产v大片淫在线免费观看| 日韩 亚洲 欧美在线| 天天躁日日操中文字幕| 亚洲精品久久午夜乱码| 国产免费一区二区三区四区乱码| 一区二区三区乱码不卡18| 在线 av 中文字幕| 春色校园在线视频观看| 亚洲国产成人一精品久久久| 久久久精品免费免费高清| 亚洲av日韩在线播放| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 搡女人真爽免费视频火全软件| 看非洲黑人一级黄片| 国产精品av视频在线免费观看| 国产精品精品国产色婷婷| 一区二区三区四区激情视频| 午夜免费鲁丝| 最后的刺客免费高清国语| 午夜爱爱视频在线播放| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 日韩视频在线欧美| 可以在线观看毛片的网站| 国产精品人妻久久久久久| 不卡视频在线观看欧美| 老司机影院毛片| av网站免费在线观看视频| 久久99蜜桃精品久久| av免费观看日本| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 国产精品爽爽va在线观看网站| 国产黄片视频在线免费观看| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 午夜爱爱视频在线播放| 啦啦啦啦在线视频资源| 亚洲av在线观看美女高潮| 精品久久久噜噜| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 白带黄色成豆腐渣| 国产免费福利视频在线观看| 国产精品成人在线| 久久久久久久久大av| 偷拍熟女少妇极品色| 亚洲欧美清纯卡通| 色视频www国产| 涩涩av久久男人的天堂| a级一级毛片免费在线观看| 看十八女毛片水多多多| 男女边摸边吃奶| 久久久久久伊人网av| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 欧美日韩国产mv在线观看视频 | 免费观看的影片在线观看| 国产片特级美女逼逼视频| 成年av动漫网址| 99久久精品一区二区三区| 看十八女毛片水多多多| 中文字幕av成人在线电影| 日韩精品有码人妻一区| 麻豆国产97在线/欧美| 嫩草影院精品99| 好男人视频免费观看在线| 国产中年淑女户外野战色| 日韩成人av中文字幕在线观看| av女优亚洲男人天堂| 高清毛片免费看| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 内射极品少妇av片p| 肉色欧美久久久久久久蜜桃 | 国产精品一区www在线观看| 欧美成人午夜免费资源| 国产成人午夜福利电影在线观看| 精品国产露脸久久av麻豆| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 黑人高潮一二区| 一级毛片我不卡| 啦啦啦啦在线视频资源| 亚洲人成网站高清观看| 中文在线观看免费www的网站| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 少妇高潮的动态图| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 日韩av在线免费看完整版不卡| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 一区二区av电影网| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 一区二区三区免费毛片| 国产成人a∨麻豆精品| av女优亚洲男人天堂| 直男gayav资源| 嘟嘟电影网在线观看| 亚洲在线观看片| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 欧美日韩综合久久久久久| 欧美 日韩 精品 国产| 亚洲久久久久久中文字幕| 欧美一级a爱片免费观看看| 欧美激情久久久久久爽电影| 永久网站在线| 日韩制服骚丝袜av| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频 | 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 熟女人妻精品中文字幕| 国产91av在线免费观看| av专区在线播放| 成年版毛片免费区| 日本与韩国留学比较| 啦啦啦在线观看免费高清www| 嫩草影院入口| 韩国高清视频一区二区三区| 男女无遮挡免费网站观看| 国产男女超爽视频在线观看| 国产精品成人在线| 久久久国产一区二区| 97在线视频观看| 欧美日韩国产mv在线观看视频 | 日日摸夜夜添夜夜爱| 熟女人妻精品中文字幕| 麻豆成人av视频| 日韩人妻高清精品专区| 日日撸夜夜添| 在线观看美女被高潮喷水网站| 99热全是精品| 精品视频人人做人人爽| 三级经典国产精品| 中文字幕av成人在线电影| av又黄又爽大尺度在线免费看| 欧美成人a在线观看| 又爽又黄无遮挡网站| 精品人妻一区二区三区麻豆| 尾随美女入室| 免费观看在线日韩| 亚洲成人中文字幕在线播放| 国产精品三级大全| 日韩亚洲欧美综合| 高清毛片免费看| 亚洲,欧美,日韩| 中文天堂在线官网| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 免费观看无遮挡的男女| 麻豆成人午夜福利视频| 中文字幕免费在线视频6| 一级毛片aaaaaa免费看小| 人体艺术视频欧美日本| 国产黄频视频在线观看| 国产成年人精品一区二区| 最近中文字幕高清免费大全6| 亚洲国产色片| 国产精品久久久久久久久免| av在线老鸭窝| 国产伦理片在线播放av一区| 两个人的视频大全免费| 亚州av有码| 丝袜美腿在线中文| 又爽又黄无遮挡网站| 波多野结衣巨乳人妻| 三级国产精品欧美在线观看| 99久久精品热视频| 亚洲精品国产色婷婷电影| 插阴视频在线观看视频| 啦啦啦啦在线视频资源| 久久这里有精品视频免费| 天堂中文最新版在线下载 | 亚洲内射少妇av| 美女内射精品一级片tv| 亚洲精品国产av蜜桃| 久热这里只有精品99| 夫妻性生交免费视频一级片| 在线观看一区二区三区| 国产黄a三级三级三级人| 亚洲va在线va天堂va国产| 欧美 日韩 精品 国产| 国产在线男女| 国产毛片在线视频| 毛片女人毛片| 亚洲av日韩在线播放| 一级黄片播放器| 精华霜和精华液先用哪个| 亚洲国产成人一精品久久久| 久久精品国产亚洲av天美| 国产日韩欧美亚洲二区| 精品酒店卫生间| av免费观看日本| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 最近手机中文字幕大全| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 内射极品少妇av片p| 国产 一区精品| 亚洲av一区综合| 成人二区视频| 黄色配什么色好看| 欧美bdsm另类| 嫩草影院精品99| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 日韩成人伦理影院| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 激情 狠狠 欧美| 久久精品久久久久久久性| 色5月婷婷丁香| 日韩中字成人| 久久精品久久精品一区二区三区| 91精品国产九色| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 精品久久久久久久久亚洲| 看黄色毛片网站| 亚洲欧美精品自产自拍| 日韩大片免费观看网站| 亚洲精品日本国产第一区| 免费黄频网站在线观看国产| 女人久久www免费人成看片| 欧美日韩精品成人综合77777| 久久97久久精品| 成年av动漫网址| 国产高清不卡午夜福利| 久久久久久伊人网av| 久久6这里有精品| 九九爱精品视频在线观看| 高清视频免费观看一区二区| 亚洲精品,欧美精品| 天美传媒精品一区二区| 99热这里只有精品一区| 亚洲成色77777| 成人国产av品久久久| 制服丝袜香蕉在线| 日韩精品有码人妻一区| 国产成人免费无遮挡视频| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 国产高潮美女av| 国产高清有码在线观看视频| 青春草视频在线免费观看| 日韩欧美 国产精品| 欧美精品国产亚洲| 少妇人妻精品综合一区二区| 伦精品一区二区三区| 五月伊人婷婷丁香| 一二三四中文在线观看免费高清| 免费黄网站久久成人精品| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 国产男人的电影天堂91| 99热6这里只有精品| 免费看光身美女| www.色视频.com| av国产精品久久久久影院| 国产精品伦人一区二区| 黄色一级大片看看| 婷婷色麻豆天堂久久| 少妇人妻 视频| 国产老妇伦熟女老妇高清| kizo精华| 久久久成人免费电影| 丝袜脚勾引网站| 天天一区二区日本电影三级| 日韩制服骚丝袜av| 国产黄色视频一区二区在线观看| 日本熟妇午夜| 丰满人妻一区二区三区视频av| 在线免费十八禁| 天天一区二区日本电影三级| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 久久久久久国产a免费观看| 久热久热在线精品观看| 全区人妻精品视频| 在线观看国产h片| 又爽又黄无遮挡网站| 夫妻性生交免费视频一级片| 久久人人爽av亚洲精品天堂 | 美女cb高潮喷水在线观看| 久热这里只有精品99| 少妇人妻 视频| 精品人妻熟女av久视频| 国产成人freesex在线| 日本wwww免费看| 亚洲精品成人av观看孕妇| 女人久久www免费人成看片| 高清av免费在线| 国产精品蜜桃在线观看| 免费av不卡在线播放| 欧美少妇被猛烈插入视频| 国产中年淑女户外野战色| 精品视频人人做人人爽| 最近中文字幕2019免费版| 亚洲精品日韩av片在线观看| 丰满乱子伦码专区| 国产人妻一区二区三区在| tube8黄色片| 人体艺术视频欧美日本| 亚洲av成人精品一二三区| 久久97久久精品| 国产视频内射| 午夜视频国产福利| 国产爱豆传媒在线观看| 一级片'在线观看视频| 欧美成人一区二区免费高清观看| 免费黄网站久久成人精品| 十八禁网站网址无遮挡 | 国产一区二区三区av在线| 日韩av免费高清视频| 能在线免费看毛片的网站| 亚洲成人一二三区av| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| av在线蜜桃| 成人国产av品久久久| 成年av动漫网址| 黄色一级大片看看| 中国三级夫妇交换| 在线免费观看不下载黄p国产| 成人免费观看视频高清| 亚洲自偷自拍三级| 欧美丝袜亚洲另类| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 亚洲精品色激情综合| 国产69精品久久久久777片| 欧美三级亚洲精品| 天美传媒精品一区二区| 一级爰片在线观看| 日韩伦理黄色片| 国产精品99久久99久久久不卡 | av播播在线观看一区| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 在线播放无遮挡| 国产色爽女视频免费观看| 国产精品无大码| 男人和女人高潮做爰伦理| 久久鲁丝午夜福利片| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 国产v大片淫在线免费观看| 国产高潮美女av| 亚洲综合精品二区| 夫妻性生交免费视频一级片| 欧美一区二区亚洲| 丝袜喷水一区| 少妇人妻一区二区三区视频| 高清欧美精品videossex| 精品少妇黑人巨大在线播放| 一级毛片电影观看| 男女那种视频在线观看| av播播在线观看一区| 男人爽女人下面视频在线观看| 成人免费观看视频高清| av一本久久久久| 丝袜喷水一区| 午夜福利在线在线| 久久久久网色| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 舔av片在线| 亚洲av成人精品一区久久| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 久久久久性生活片| 亚洲成色77777| 国产精品精品国产色婷婷| 色视频www国产| 亚洲国产日韩一区二区| 成人国产麻豆网| 一本久久精品| 中文字幕久久专区| 日韩av在线免费看完整版不卡| 成人漫画全彩无遮挡| 久久久久国产精品人妻一区二区| 欧美高清成人免费视频www| 亚洲精品,欧美精品| 69av精品久久久久久| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 看免费成人av毛片| 七月丁香在线播放| 五月天丁香电影| 联通29元200g的流量卡| 久久精品人妻少妇| 综合色丁香网| 久久精品国产亚洲av天美| 国产免费福利视频在线观看| 搡老乐熟女国产| 免费黄网站久久成人精品| 99视频精品全部免费 在线| 精品午夜福利在线看| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 亚洲欧美日韩无卡精品| 午夜爱爱视频在线播放| 成年女人看的毛片在线观看| 国产精品久久久久久av不卡| 天天一区二区日本电影三级| 国产精品精品国产色婷婷| 另类亚洲欧美激情| 午夜激情久久久久久久| 亚洲av成人精品一区久久| 亚洲综合色惰| 欧美极品一区二区三区四区| 亚洲天堂av无毛| 国产精品久久久久久精品古装| 中文天堂在线官网| 99久国产av精品国产电影| 三级经典国产精品| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 男女国产视频网站| 欧美97在线视频| 国产成人免费观看mmmm| 国产日韩欧美亚洲二区| 99久久精品热视频| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 成人亚洲精品一区在线观看 | 永久免费av网站大全| 热99国产精品久久久久久7| 国产有黄有色有爽视频| 亚洲国产最新在线播放| 夫妻性生交免费视频一级片| 性插视频无遮挡在线免费观看| 成人免费观看视频高清| 卡戴珊不雅视频在线播放| 国产精品不卡视频一区二区| av一本久久久久| 免费av观看视频| 青春草亚洲视频在线观看| 尾随美女入室|