解淀粉芽孢桿菌植物亞種CGMCC 11640對(duì)山核桃干腐病菌的抑制機(jī)制

程 敏，徐秋芳

（浙江農(nóng)林大學(xué) 浙江省森林生態(tài)系統(tǒng)碳循環(huán)與固碳減排重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 臨安311300）

解淀粉芽孢桿菌植物亞種CGMCC 11640對(duì)山核桃干腐病菌的抑制機(jī)制

程 敏，徐秋芳

（浙江農(nóng)林大學(xué) 浙江省森林生態(tài)系統(tǒng)碳循環(huán)與固碳減排重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 臨安311300）

葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea引起的山核桃Carya cathayensis干腐病是導(dǎo)致山核桃樹發(fā)病甚至死亡的主要病害之一，對(duì)山核桃產(chǎn)業(yè)帶來了嚴(yán)重威脅。通過平板對(duì)峙法成功篩選出1株對(duì)病原菌有明顯抑制效果的解淀粉芽孢桿菌植物亞種Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum（菌種保藏號(hào)：CGMCC 11640）。試圖通過掃描電鏡探究該菌株對(duì)山核桃干腐病菌的抑制機(jī)制。對(duì)峙培養(yǎng)4，6和7 d后，比較菌絲和孢子形態(tài)，發(fā)現(xiàn)病原菌菌絲出現(xiàn)萎縮干癟現(xiàn)象，培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)，菌絲萎縮干癟程度越大；對(duì)峙培養(yǎng)4 d時(shí)病原菌孢子正常，而到第6天時(shí)部分病原菌孢子表現(xiàn)出凹陷、萎縮現(xiàn)象，第7天異常孢子數(shù)量增加。用CGMCC 11640發(fā)酵上清液與水分別按V（上清液）∶V（水）＝1∶9，2∶8，5∶5的比例配制成的馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）混合培養(yǎng)基培養(yǎng)病原菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)病原菌菌絲抑制率分別為75.81%，88.84%和94.30%，說明滅菌發(fā)酵上清液對(duì)病原菌有抑制作用。電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，病原菌菌絲在含有滅菌發(fā)酵上清液的PDA混合培養(yǎng)基上出現(xiàn)萎縮干癟現(xiàn)象。通過掃描電鏡觀察，推測(cè)CGMCC 11640菌株及其代謝物對(duì)病原菌的抑制作用主是通過破壞菌絲和孢子細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，使細(xì)胞內(nèi)原生質(zhì)泄露，從而導(dǎo)致菌絲和孢子萎縮，最終殺死病原菌細(xì)胞。圖3表1參20

森林保護(hù)學(xué)；山核桃干腐?。唤獾矸垩挎邨U菌植物亞種；抑菌機(jī)制；掃描電鏡

芽孢桿菌Bacillus因能產(chǎn)生耐熱、耐旱、抗紫外線和有機(jī)溶劑的芽孢［1］，具有在不同環(huán)境下存活、定殖與繁殖等方面的優(yōu)勢(shì)［2］，對(duì)植物病菌的作用機(jī)制多樣［2－3］，使得芽孢桿菌成為一種理想的生防菌。芽孢桿菌的作用機(jī)制主要包括競(jìng)爭(zhēng)作用、拮抗作用和誘導(dǎo)植物抗性［2－3］等方面，其中拮抗作用是指生防菌株產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物抑制有害病原菌的生長(zhǎng)、發(fā)展或直接殺滅病原菌，或是通過次生代謝產(chǎn)物改變自身周圍的微環(huán)境，使之不利于病原微生物的生長(zhǎng)繁殖［4］。芽孢桿菌產(chǎn)生的拮抗物質(zhì)主要有抗生素、細(xì)菌素、細(xì)胞壁降解酶類和其他抗菌蛋白及揮發(fā)性抗菌物質(zhì)［3］。脂肽類抗生素是一大類重要的拮抗物質(zhì)［5］，其理化性質(zhì)穩(wěn)定，對(duì)高溫、酸和弱堿具有一定的耐受［6］，已成為芽孢桿菌拮抗物質(zhì)領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌植物亞種Botryosphaeria amyloliquefaciens subsp.plantarun FZB42能夠產(chǎn)生surfactin,fengycin等脂肽類物質(zhì)抑制立枯絲核菌［7］，解淀粉芽孢桿菌SWB16菌株產(chǎn)生的fengycin和 iturin對(duì)球孢白僵菌分生孢子的發(fā)芽和菌絲生長(zhǎng)具有顯著的抑制作用［8］。借助掃描電子顯微鏡探究脂肽類抗生素對(duì)植物病原菌的抑菌機(jī)制表明，脂肽類抗生素導(dǎo)致真菌菌絲及孢子畸形，細(xì)胞膜破裂，從而使細(xì)胞代謝無法正常進(jìn)行，最終導(dǎo)致細(xì)胞的死亡［9－11］。山核桃 Carya cathayensis是投入產(chǎn)出效益很高的經(jīng)濟(jì)樹種之一［12］。由于純林化及片面追求產(chǎn)量的經(jīng)營(yíng)措施，導(dǎo)致山核桃林病蟲害日趨嚴(yán)重［13］，其中危害最大的是山核桃干腐病。山核桃干腐病又稱山核桃潰瘍病、墨汁病，病原菌為葡萄座腔菌 Botryosphaeria dothidea。2009年以來，浙江省與安徽省將近90%的山核桃林感染山核桃干腐病，且病情繼續(xù)加重。2015年僅臨安市枯死的山核桃樹累計(jì)達(dá)3.7萬(wàn)株，損失1 000萬(wàn)元之多。迄今為止對(duì)山核桃干腐病缺乏有效的防治方法，雖然某些化學(xué)農(nóng)藥有一定的效果，但化學(xué)農(nóng)藥的長(zhǎng)期大量使用，產(chǎn)生了環(huán)境污染、病蟲抗藥性及農(nóng)藥殘留等令人擔(dān)憂的問題。因此，從生物防治角度來控制山核桃干腐病病情將是有效的途徑。本研究應(yīng)用實(shí)驗(yàn)室前期分離得到的微生物資源，通過平板對(duì)峙法篩選出1株對(duì)病原菌有明顯抑制效果的解淀粉芽孢桿菌，經(jīng)鑒定為解淀粉芽孢桿菌植物亞種（菌種保藏號(hào)：CGMCC 11640）。為初步了解CGMCC 11640產(chǎn)生的拮抗物質(zhì)對(duì)山核桃干腐病病原菌的抑菌機(jī)制，推測(cè)拮抗物質(zhì)中是否含有耐高溫的脂肽類抗生素，本研究利用掃描電子顯微鏡觀察CGMCC 11640菌體及其滅菌發(fā)酵上清液對(duì)山核桃干腐病病原菌菌絲生長(zhǎng)及形態(tài)的影響，為山核桃干腐病生防菌的開發(fā)利用提供初步理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌種

山核桃干腐病病原菌，解淀粉芽孢桿菌植物亞種（菌種保藏號(hào)為CGMCC 11640）。

1.2 CGMCC 11640菌體對(duì)病原菌的抑制作用

平板對(duì)峙法共同培養(yǎng)病原菌與CGMCC 11640。在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）平板中央接種病原菌圓餅，在距平板中心10 mm的兩側(cè)接CGMCC 11640圓餅，3個(gè)圓餅保持在一條水平線上，28℃培養(yǎng)。從抑菌帶一側(cè)的病原菌菌落邊緣切正方形小塊制備掃描電鏡樣品，觀察對(duì)峙培養(yǎng)4，6，7 d后病原真菌的形態(tài)變化，以單獨(dú)培養(yǎng)的病原菌作為對(duì)照。

1.3 CGMCC 11640滅菌發(fā)酵上清液對(duì)病原菌的抑制作用

1.3.1 制備含CGMCC 11640滅菌發(fā)酵上清液的PDA混合培養(yǎng)基 選取CGMCC 11640菌的單菌落，接種于100 mL PDA液體培養(yǎng)基中，在 37℃，搖瓶轉(zhuǎn)速為180 r·min－1條件下培養(yǎng) 14 h，得到CGMCC 11640菌株種子液。CGMCC 11640種子液按接種量為3%（體積分?jǐn)?shù)）分別接種于500 mL PDA液體培養(yǎng)基中，在37℃，180 r·min－1條件下培養(yǎng)48 h，即得到CGMCC 11640菌株發(fā)酵液。將CGMCC 11640菌株發(fā)酵液3 000 r·min－1離心15 min后，去除菌體，得到CGMCC 11640滅菌上清液。將CGMCC 11640發(fā)酵上清液與水分別按V（上清液）∶V（水）=1∶9（處理1），2∶8（處理2），5∶5（處理3）的比例配制成的含有CGMCC 11640滅菌發(fā)酵上清液的PDA混合培養(yǎng)基。

1.3.2 CGMCC 11640滅菌發(fā)酵上清液對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用 采用生長(zhǎng)速率法測(cè)定菌絲抑制率。將含有CGMCC 11640滅菌發(fā)酵上清液的PDA混合培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基中央分別接種直徑10 mm的病原菌菌餅，重復(fù)3次·處理－1。28℃培養(yǎng)5 d后，十字交叉法測(cè)量病原菌菌落直徑，計(jì)算菌絲抑制率。抑制率（%）=［（對(duì)照組菌落直徑-處理組菌落直徑）/對(duì)照組菌落直徑］×100%。

1.3.3 CGMCC 11640滅菌發(fā)酵上清液對(duì)病原菌菌絲形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響 在含有CGMCC 11640滅菌發(fā)酵上清液的PDA混合培養(yǎng)基中央接種直徑10 mm的病原菌菌餅，28℃培養(yǎng)。重復(fù)3次·處理－1。從病原菌菌落邊緣切正方體小塊制備掃描電鏡樣品，觀察培養(yǎng)3 d后病原真菌菌絲的形態(tài)變化，以在不含CGMCC 11640滅菌發(fā)酵上清液的PDA純培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的病原菌作為對(duì)照。

1.3.4 掃描電鏡樣品制備 將切取的菌落邊緣正方體小塊，浸沒于體積分?jǐn)?shù)為2.5%的戊二醛，4℃下靜置過夜。0.1 mol·L－1磷酸緩沖鹽溶液（PBS）浸洗樣品15 min，重復(fù)3次。隨后，將樣品依次浸沒于梯度體積分?jǐn)?shù)為30%，50%，70%，80%，90%，95%的乙醇中15 min，再用體積分?jǐn)?shù)為100%的乙醇洗脫2次，20 min·次－1。用V（乙醇）∶V（醋酸異戊酯）＝1∶1混合液處理樣品30 min，再用體積分?jǐn)?shù)為100%醋酸異戊酯處理樣品2 h。樣品自然風(fēng)干后鍍金，使用掃描電鏡觀察。

2 結(jié)果

2.1 CGMCC 11640菌體對(duì)病原菌的抑制作用

平板對(duì)峙培養(yǎng)時(shí)病原菌與CGMCC 11640形成抑菌帶，說明CGMCC 11640抑制病原菌菌絲的生長(zhǎng)。用掃描電鏡觀察病原菌單獨(dú)培養(yǎng)（對(duì)照組）以及病原菌與CGMCC 11640對(duì)峙培養(yǎng)4，6，7 d時(shí)病原菌絲形態(tài)發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組培養(yǎng)4，6，7 d的病原菌菌絲均通體完整飽滿，粗細(xì)均勻，圖1A為對(duì)照組培養(yǎng)4 d時(shí)的掃描電鏡圖；對(duì)峙培養(yǎng)的病原菌菌落邊緣菌絲明顯異常，培養(yǎng)第4天時(shí)有部分菌絲出現(xiàn)萎縮干癟現(xiàn)象（圖1B），第6天則絕大多數(shù)菌絲出現(xiàn)縮干癟現(xiàn)象（圖1C），到培養(yǎng)第7天菌絲全部萎縮干癟（圖1D），說明后期干癟程度比前期嚴(yán)重。對(duì)照組的孢子形態(tài)飽滿（圖2A），而對(duì)峙培養(yǎng)第4天時(shí)病原菌孢子正常（圖2B），而到第6天時(shí)部分病原菌孢子表現(xiàn)出凹陷、萎縮現(xiàn)象（圖2C），第7天異常孢子數(shù)量增加花板（圖2D）?；捂咦拥臄?shù)量隨之培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增多。

圖1 掃描電鏡下CGMCC 11640菌體對(duì)山核桃干腐病菌絲形態(tài)的影響Figure 1 Effect of CGMCC 11640 cells on hypha of Botryosphaeria dothidea under scanning electron microscope

2.2 CGMCC 11640滅菌發(fā)酵上清液對(duì)病原菌的抑制作用

2.2.1 CGMCC 11640滅菌發(fā)酵上清液對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制效果 測(cè)量含有不同比例CGMCC 11640滅菌發(fā)酵上清液的PDA混合培養(yǎng)基上生長(zhǎng)5 d后的病原菌菌落直徑，計(jì)算出菌絲抑制率如表1。結(jié)果表明：CGMCC 11640滅菌發(fā)酵上清液對(duì)山核桃干腐病病原菌菌絲生長(zhǎng)均具有較強(qiáng)的抑制作用，含滅菌發(fā)酵上清液與水的比例分別為V（上清液）∶V（水）=1∶9，2∶8，5∶5的PDA混合培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的病原菌菌絲抑制率分別為75.81%，88.84%和94.30%，說明抑制效果在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)隨著發(fā)酵液含量的增加而增強(qiáng)。

2.2.2 含有CGMCC 11640滅菌發(fā)酵上清液培養(yǎng)基上的病原菌菌絲形態(tài)結(jié)構(gòu) 分別切取不含CGMCC11640滅菌發(fā)酵上清液的PDA純培養(yǎng)基（對(duì)照組）和含有CGMCC 11640滅菌發(fā)酵上清液PDA混合培養(yǎng)基（處理組）上生長(zhǎng)3 d后的病原菌邊緣菌落，制成掃描電鏡樣品，觀察菌絲形態(tài)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：對(duì)照組病原菌絲菌絲整體圓潤(rùn)光滑，粗細(xì)均勻（圖3A），處理組病原菌菌絲出現(xiàn)萎縮干癟現(xiàn)象（圖3 B），觀察結(jié)果與2.1相同，說明耐高溫的CGMCC 11640的代謝產(chǎn)物對(duì)病原菌起抑制作用。

圖2 掃描電鏡下CGMCC 11640菌體對(duì)山核桃干腐病孢子形態(tài)的影響Figure 2 Effect of CGMCC 11640 cells on spores of Botryosphaeria dothidea under scanning electron microscope

表1 CGMCC 11640滅菌發(fā)酵上清液對(duì)山核桃干腐病菌絲抑制率Table 1 Hyphal inhibitory ratio of CGMCC 11640 sterilized supernatant liquor against B.dothidea

圖3 掃描電鏡下CGMCC 11640滅菌發(fā)酵上清液對(duì)山核桃干腐病菌絲形態(tài)的影響Figure 3 Effect of sterilized supernatant liquor from CGMCC 11640 on hypha of B.dothidea under scanning electron microscope

3 討論

本研究通過掃描電鏡觀察，結(jié)合其他研究者對(duì)芽孢桿菌抑真菌的機(jī)制成果推測(cè)，得出結(jié)論：CGMCC 11640菌株及其代謝物對(duì)病原菌的抑制作用主是通過破壞菌絲和孢子細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，使細(xì)胞內(nèi)原生質(zhì)的泄露，從而導(dǎo)致菌絲和孢子萎縮，最終殺死病原菌細(xì)胞。

非核糖體合成的脂肽類抗生素是芽孢桿菌產(chǎn)生的拮抗物質(zhì)中重要的一類。常見的三大家族脂肽類物質(zhì)surfactins，iturins和fengycins在防治植物病害中最早開始研究［14－16］。因脂肽類穩(wěn)定的理化性質(zhì)及廣泛的抗菌活性使其成為生防菌劑的研究熱點(diǎn)。脂肽類的抗菌機(jī)制研究主要集中在作用于細(xì)胞膜，引起細(xì)胞膜的破裂和細(xì)胞質(zhì)的泄露［17－19］。陶陽(yáng)等［10］采用顯微技術(shù)觀察發(fā)現(xiàn)2種抗菌脂肽surfctin和fengycin能夠?qū)е绿臆浉【z體變形，細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的破裂，原生質(zhì)的泄露，細(xì)胞器、細(xì)胞核出現(xiàn)異常，使細(xì)胞代謝無法正常進(jìn)行，最終導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。胡陳云等［11］通過掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，被抗菌脂肽抑制的人參病原菌菌絲出現(xiàn)明顯萎縮、皺縮現(xiàn)象。有研究表明：脂肽抗生素理化性質(zhì)穩(wěn)定，如較好的熱穩(wěn)定性，121℃高溫處理仍有較高的活性［20］。本研究用含有CGMCC 11640滅菌發(fā)酵上清液的PDA混合培養(yǎng)基培養(yǎng)病原菌，發(fā)現(xiàn)病原菌菌絲生長(zhǎng)受到抑制，說明CGMCC 11640發(fā)酵液中含有耐高溫的抑菌物質(zhì)。然后利用掃描電鏡觀察與CGMCC 11640菌株對(duì)峙培養(yǎng)以及在含有CGMCC 11640滅菌發(fā)酵上清液的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的病原菌菌絲形態(tài)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)病原菌菌絲形態(tài)均發(fā)生異常，主要表現(xiàn)為菌絲萎縮、干癟、形成褶皺，但沒有觀察到菌絲體的外壁溶解現(xiàn)象；對(duì)峙培養(yǎng)6 d時(shí)觀察病原菌孢子出現(xiàn)凹陷、萎縮現(xiàn)象，畸形孢子的數(shù)量隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增多。由此說明：CGMCC 11640通過代謝產(chǎn)物破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，使細(xì)胞內(nèi)原生質(zhì)的泄露，從而導(dǎo)致菌絲和孢子萎縮，與報(bào)道的有關(guān)脂肽抗生素的作用機(jī)制相一致。后續(xù)采用酸沉淀法提取脂肽類物質(zhì)，經(jīng)HPLC，LC-MS技術(shù)分析鑒定得出，CGMCC 11640菌株能夠產(chǎn)生surfactins，iturins和fengycins三大類脂肽類物質(zhì)。2015年5月進(jìn)行初步林間試驗(yàn)，將脂肽粗提物與愈合劑混合后涂在山核桃干腐病斑處，2016年5月觀察發(fā)現(xiàn)，傷口愈合，不再有黑色液體流出，表明CGMCC 11640產(chǎn)生的脂肽類物質(zhì)對(duì)山核桃干腐有較好的抑制作用。因此，可以將CGMCC 11640菌株產(chǎn)生的脂肽類抗生素制成生物農(nóng)藥防治山核桃干腐病。

4 致謝

本研究承蒙浙江農(nóng)林大學(xué)林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院王彥先生在掃描電鏡使用方面的技術(shù)指導(dǎo)。謹(jǐn)此致謝！

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Inhibitory mechanism of Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum CGMCC 11640 against Botryosphaeria dothidea,the pathogen of canker disease of Carya cathayensis

CHENG Min,XU Qiufang
（Key Laboratory of Carbon Cycling in Forest Ecosystems and Carbon Sequestration of Zhejiang Province,Zhejiang A&F University,Lin’an 311300,Zhejiang,China）

The canker disease of Carya cathayensis caused by Botryosphaeria dothidea,is one of the diseases in China that has resulted in serious damage and even death for the tree.To overcome the serious disease threat to the C.cathayensis industry,Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum CGMCC 11640,which has shown a strong inhibitive activity in vitro against Botryosphaeria dothidea,was obtained by screening with the dual-culture method and cultured in medium mixtures with ratios of sterilized fermentation supernate to PDA being 1: 9,2:8,and 5:5 （volume ratio）.Then,the inhibitory mechanisms of strain CGMCC 11640 against Botryosphaeria dothidea were further explored by scanning electron microscopy （SEM）.Results revealed that the Botryosphaeria dothidea strain growth rate for the three volume ratio mediums were restrained by 75.8%for 1:9,88.8%for 2:8,and 94.3%for 5:5.The SEM results showed that both bacterial cells and their steril-ized fermentation supernate exhibited strong inhibition activity in vitro against Botryosphaeria dothidea and that the hyphae and spores of Botryosphaeria dothidea exhibited atrophy and introcession.Thus,CGMCC 11640 inhibited Botryosphaeria dothidea by destroying cell membranes （e.g.punching holes in them）and walls of hyphae and spores resulting in leakage of plasmatic material from the inside of the cells.［Ch,3 fig.1 tab.20 ref.］

forest protection;Carya cathayensis canker;Botryosphaeria amyloliquefaciens subsp.plantarum; inhibitory mechanism;scanning electron microscopy（SEM）

S763.1；S664.1

A

2015-0756（2017）02-0326-06

10.11833/j.issn.2095-0756.2017.02.017

2016-04-18；

2016-05-23

浙江農(nóng)林大學(xué)農(nóng)林碳匯與生態(tài)環(huán)境修復(fù)研究中心預(yù)研基金項(xiàng)目（2013CB03）；浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（LZ16C1600002）

程敏，從事土壤生物與生物化學(xué)研究。E-mail：1071886021@qq.com。通信作者：徐秋芳，教授，博士，博士生導(dǎo)師，從事土壤生物學(xué)及森林生態(tài)學(xué)等研究。E-mail：xuqiufang@zafu.edu.cn