途徑工程及Tn5轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)突變提高大腸桿菌丙酮酸生產(chǎn)

史曉榮，劉俊，彭彥峰，李林，王文科，王欽宏

1 山西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 臨汾 041004

2 中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所 中國(guó)科學(xué)院系統(tǒng)微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300308

丙酮酸是生物代謝過(guò)程中承上啟下的關(guān)鍵中間產(chǎn)物，同時(shí)它為糖酵解途徑和三羧酸循環(huán)提供原料，并且為生物的各項(xiàng)生命活動(dòng)提供必需的能量，此外，它還廣泛應(yīng)用于食品、農(nóng)藥、生化等工業(yè)中[1-3]。隨著我們對(duì)丙酮酸需求量的不斷增加，如何找到一種環(huán)保、可持續(xù)的大量獲得丙酮酸的方法顯得尤為重要。

生產(chǎn)丙酮酸的方法主要有化學(xué)合成法、酶轉(zhuǎn)化法和微生物發(fā)酵法 3種[4-5]，由于發(fā)酵法具有產(chǎn)品純度高、成本低、轉(zhuǎn)化率高、對(duì)環(huán)境污染小等優(yōu)點(diǎn)，已成為國(guó)內(nèi)外最受青睞的生產(chǎn)方法。對(duì)生物發(fā)酵法來(lái)講，尋找合適的發(fā)酵工程菌是最關(guān)鍵的，自然界中有很多的微生物可以合成丙酮酸，如球擬酵母、假絲酵母、釀酒酵母、腸桿菌屬等。通過(guò)代謝工程手段有效地改造上述微生物的代謝途徑，可以獲得優(yōu)良高產(chǎn)菌株。沈冬錢(qián)等[2]敲除大腸桿菌lpdA基因后，突變菌可以在以不同糖為碳源下積累丙酮酸，得率都達(dá)到了0.8 g丙酮酸/g糖以上。Zhu等[6]在大腸桿菌中敲除多個(gè)丙酮酸副產(chǎn)物基因，經(jīng)發(fā)酵優(yōu)化后，發(fā)酵罐分批補(bǔ)料44 h產(chǎn)丙酮酸90 g/L，得率0.68 g丙酮酸/g葡萄糖。Causey等[7]構(gòu)建了1株大腸桿菌TC44，敲除了丙酮酸代謝途徑中生成副產(chǎn)物的基因，它在以葡糖糖作為唯一碳源的礦物鹽培養(yǎng)基中發(fā)酵43 h，丙酮酸的產(chǎn)量52 g/L，葡萄糖轉(zhuǎn)換成丙酮酸的轉(zhuǎn)化率為 0.75 g丙酮酸/g葡萄糖。于瑩等[8]在谷氨酸棒桿菌中敲除了丙酮酸支流代謝途徑基因，利用4.5%的葡萄糖復(fù)合培養(yǎng)基，工程菌經(jīng)搖瓶發(fā)酵48 h，丙酮酸的濃度達(dá)到14.6 g/L，比野生菌提高了 32.5倍。Kawata等[9]發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)鹽單胞菌Halomonassp. KM-1時(shí)，當(dāng)培養(yǎng)基中硝酸鈉的濃度增加時(shí)，導(dǎo)致丙酮酸的分泌增強(qiáng)，培養(yǎng)48 h，野生型Halomonassp. KM-1可以產(chǎn)生63.3 g/L丙酮酸。Kamzolova等[10]在食腺嘌呤節(jié)孢酵母Blastobotrys adeninivorans發(fā)酵中限制硫胺素來(lái)干擾硫胺素依賴的丙酮酸脫氫酶功能，可以產(chǎn)生43.2 g/L的丙酮酸。目前積累丙酮酸代謝產(chǎn)物主要集中于副產(chǎn)物代謝相關(guān)基因的改造和優(yōu)化發(fā)酵條件[11-12]。由于進(jìn)一步改造的靶點(diǎn)基因不明確，通過(guò)誘變是一種方法。

基于傳統(tǒng)誘變的方法，難以對(duì)發(fā)生有效突變的菌株進(jìn)行快速基因位點(diǎn)定位，無(wú)法精確地發(fā)現(xiàn)控制菌株高產(chǎn)的關(guān)鍵基因。而利用Tn5轉(zhuǎn)座子來(lái)構(gòu)建載體進(jìn)行隨機(jī)突變則不然，它通常被用于發(fā)現(xiàn)特定功能的未知基因[13]，能夠保證單基因插入突變來(lái)進(jìn)行全基因改造，而且沒(méi)有大量的無(wú)效突變背景干擾，能夠進(jìn)行基因組水平的隨機(jī)插入。Wang等[14]利用Tn5轉(zhuǎn)座子插入誘變用于構(gòu)建運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌中的較高耐鹽性菌株，誘變產(chǎn)生 200個(gè)運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的突變體，篩選到耐鹽性比野生型高達(dá)2%的突變菌株ZMT2，并且找到himA基因，該基因的破壞在響應(yīng)耐鹽中起著重要的作用。因此我們把這種方法應(yīng)用到菌株的遺傳改造過(guò)程中，為工程菌提供有效的改造靶點(diǎn)[15]。

本研究中我們以大腸桿菌 MG1655為出發(fā)菌株，通過(guò)基因操作得到積累丙酮酸的菌株KLPP，進(jìn)一步利用Tn5轉(zhuǎn)座子[16–17]對(duì)KLPP進(jìn)行了基因組水平的隨機(jī)插入，構(gòu)建了1個(gè)突變體文庫(kù)，與高通量篩選方法相結(jié)合，通過(guò)對(duì)文庫(kù)的兩輪篩選得到了丙酮酸產(chǎn)量穩(wěn)定提高的突變體，再對(duì)轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)進(jìn)行定位，找出了可能影響丙酮酸積累的基因靶點(diǎn)，為構(gòu)建更高效的產(chǎn)丙酮酸大腸桿菌提供指導(dǎo)。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1　菌株和質(zhì)粒

E. coliK12 substr. MG 1655是構(gòu)建產(chǎn)丙酮酸大腸桿菌的出發(fā)菌株。本研究所用菌株和質(zhì)粒如表1所示。

1.1.2　主要試劑

氨芐青霉素、氯霉素、硫酸卡那霉素購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；質(zhì)粒小量快速提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Axygen公司；DNA回收試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)公司；TransStart Fast Pfu DNA聚合酶、DNA marker、pEASY-Blunt Zero Cloning Kit試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、T4多聚核苷酸激酶購(gòu)自NEB公司；二硝基苯肼購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為分析純?cè)噭?/p>

1.1.3　培養(yǎng)基

每升LB培養(yǎng)基包括10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物和10 g氯化鈉 (固體LB加入1.5%的瓊脂粉)；發(fā)酵培養(yǎng)基為M9培養(yǎng)基，其1 L組成為：85.5 g Na2HPO4·12H2O，15 g KH2PO4，2.5 g NaCl，5 g NH4Cl，2 mmol MgSO4，0.1 mol CaCl2。氨芐青霉素、硫酸卡那霉素、氯霉素終濃度分別為 100、50、34 μg/mL。

表1　本研究的菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.2　方法

1.2.1　目標(biāo)基因敲除

采用基于重復(fù)引物和同源重組的方法進(jìn)行大腸桿菌相關(guān)基因的敲除[18]。使用這種方法，只需要一步轉(zhuǎn)化，基因敲除后沒(méi)有抗性基因或者其他序列存在于染色體上。基因敲除過(guò)程以ldhA的敲除為例說(shuō)明。引物設(shè)計(jì)用于 PCR擴(kuò)增cat-sacB序列，正向引物Sens-ldhA-CS包含ldhA的50 bp上游序列和50 bp的下游序列，之后是cat-sacB的擴(kuò)增序列 (5?-TCCTGGTGTCCCTGTT GATA-3?)；反向引物Anti-ldhA-CS包含ldhA的50 bp下游序列，之后是cat-sacB的擴(kuò)增序列(5?-ATAGATACATCAGAGCTTTTACGAG-3?) 。擴(kuò)增后DNA片段經(jīng)過(guò)膠回收后電擊轉(zhuǎn)化到含有pKD46的感受態(tài)細(xì)胞。使用CmR篩選克隆，并進(jìn)一步使用引物Sens-ldhA-yz和CS-yz進(jìn)行PCR驗(yàn)證。正確的克隆接入含有10%葡萄糖的LB培養(yǎng)基中通過(guò)胞內(nèi)重組以消除cat-sacB基因。使用氯霉素抗性和引物 Sens-ldhA-yz、Anti-ldhA-yz檢測(cè)cat-sacB的消除。本研究使用引物見(jiàn)表2。

表2　本研究所用引物Table 2 Primers used in this study

1.2.2　突變文庫(kù)的建立

將pUT Mini-Tn5 Cm質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到大腸桿菌S17-1λpir中，涂布于含有氯霉素的平板，然后于37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，挑選正確克隆。以含有 pUT Mini-Tn5 Cm 大腸桿菌 S17-1λpir為供體，受體為 KLPP菌株 (帶有卡那霉素抗性)。這兩種細(xì)菌分別在含氯霉素和卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min條件下培養(yǎng)5 h。將兩株菌株在 5000×g條件下離心 2 min以后，用10 mmol/L MgSO4溶液重新懸浮并離心，重復(fù)洗滌3次，并最終用MgSO4懸浮并調(diào)整到合適的濃度后將二者混合。在含有0.1 mol/L檸檬酸鈉的LB平板中心放置一張0.45 μm的無(wú)菌濾膜，將上述混合菌液添加至無(wú)菌濾膜上，放置于超凈臺(tái)中，吹干后于37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 h。

將濾膜上的菌苔刮下，并用少量無(wú)菌水進(jìn)行清洗，涂布于含有卡那霉素和氯霉素的平板上進(jìn)行選擇培養(yǎng)。

1.2.3　高通量篩選及檢測(cè)方法

丙酮酸在酸性條件下與 2,4-二硝基苯肼發(fā)生縮合反應(yīng)形成丙酮酸二硝基苯腙。二硝基苯腙在堿性條件下呈現(xiàn)紅色，可在520 nm處比色后靈敏地反映出丙酮酸的含量[19]。

配置6.25 g/L 的丙酮酸母液，再稀釋成0、0.625、1.250、1.875、2.5、3.125、3.75、5 g/L的溶液，取40 μL不同稀釋度丙酮酸溶液、40 μL 0.033%的二硝基苯肼、40 μL 2.81 mol/L NaOH混合，靜置反應(yīng)10 min，利用Molecular Device Spectra Max M2 酶標(biāo)儀在520 nm的波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。每個(gè)梯度設(shè)置3個(gè)平行。酶標(biāo)儀可以直接測(cè)定0?140 mg/L濃度范圍內(nèi)的丙酮酸，并呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為：y=0.005x–0.007，R2=0.993，用該法測(cè)出的發(fā)酵丙酮酸濃度與HPLC測(cè)定濃度一致，說(shuō)明菌體及發(fā)酵液其他成分不對(duì)丙酮酸測(cè)定形成干擾。

為了測(cè)定細(xì)胞產(chǎn)丙酮酸的能力，我們?cè)O(shè)計(jì)了以下篩選流程：1) 突變庫(kù)單克隆接種至96孔深孔板培養(yǎng)，搖床培養(yǎng)20 h；2) 菌體吹吸均勻后，先后加入40 μL菌液、40 μL 0.033%的二硝基苯肼和40 μL 2.81 mol/L NaOH進(jìn)行顯色反應(yīng)，測(cè)定反應(yīng)液的OD520值；3) 根據(jù)丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出發(fā)酵液中丙酮酸的濃度，最后根據(jù)突變菌株與對(duì)照菌株丙酮酸的濃度比篩選出丙酮酸產(chǎn)量提高的菌株。

1.2.4　菌株的發(fā)酵評(píng)價(jià)

將最終篩選到的菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵驗(yàn)證。首先將保存于?80 ℃的突變菌在加有氯霉素和卡那抗生素的平板劃線，培養(yǎng)過(guò)夜，挑取單菌落到含有3 mL LB的試管中，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)12 h，測(cè)OD600值，保證起始OD一致，按相應(yīng)比例接種到15 mL搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中 (100 mL搖瓶)，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)24 h。取1 mL發(fā)酵液12000×g下離心10 min，將上清液稀釋10倍后利用 HPLC (高效液相色譜儀) 檢測(cè)丙酮酸的含量，確定丙酮酸產(chǎn)量明顯提高的菌株，對(duì)高產(chǎn)丙酮酸的菌株進(jìn)行3輪發(fā)酵重復(fù)實(shí)驗(yàn)，每輪3個(gè)平行。

發(fā)酵罐使用上海保興BioTech-5BG全自動(dòng)5 L發(fā)酵系統(tǒng)，裝2 L發(fā)酵液。挑單克隆到裝有3 mL LB試管 37 ℃培養(yǎng)OD600至 3.0，轉(zhuǎn)接到裝量200 mL LB的1 L搖瓶，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜后，以10%接種量轉(zhuǎn)接入發(fā)酵罐，發(fā)酵罐 pH控制在6.5，通氣量1 vvm，控制溶氧不低于30%。

1.2.5　利用HPLC對(duì)丙酮酸產(chǎn)量進(jìn)行測(cè)定

丙酮酸產(chǎn)量利用高效液相色譜儀 (HPLC system 1260 Infinity Series, Agilent Technologies)測(cè)定。所用色譜柱為Aminex HPX-87H色譜柱，流動(dòng)相為5 mmol/L硫酸溶液，流速為0.6 mL/min，柱溫是63 ℃；檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，檢測(cè)時(shí)間為30 min。

1.2.6　全基因組重測(cè)序確定Tn5插入位置

將篩選到的突變菌株經(jīng)過(guò)培養(yǎng)離心后，去掉上清液，將菌體送至廣州基迪奧生物科技有限公司進(jìn)行全基因組重測(cè)序，基因組重測(cè)序后獲得原始數(shù)據(jù)，經(jīng)過(guò)過(guò)濾去污染、比對(duì)參考基因組，來(lái)確定轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)。

2　結(jié)果與分析

2.1　積累丙酮酸菌株的構(gòu)建

在有氧代謝途徑中，丙酮酸會(huì)經(jīng)過(guò)丙酮酸脫氫酶PDH作用進(jìn)一步脫羧反應(yīng)生成CO2和乙酰輔酶A，大部分乙酰輔酶A會(huì)進(jìn)入TCA循環(huán)，但仍有大量乙酰輔酶 A會(huì)直接代謝為乙酸。有研究通過(guò)敲除PDH編碼基因或者硫辛酸編碼基因降低PDH活性來(lái)積累大量的丙酮酸[4-5]，然而，需要添加乙酸或者硫辛酸維持細(xì)胞生長(zhǎng)。本研究中，PDH活性保留，而由丙酮酸代謝到乙酸和乳酸的途徑被阻斷。

本研究中乳酸產(chǎn)生途徑基因ldhA被敲除，得到菌株KL01 (ΔldhA)。進(jìn)一步敲除乙酸途徑，在大腸桿菌中，乙酸生成途徑主要有兩個(gè)：一是經(jīng)由乙酰輔酶 A由磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶 (pta) 和乙酸激酶 (ackA) 作用生成乙酸，二是被丙酮酸氧化酶 (poxB) 直接氧化生成乙酸。在大腸桿菌基因組上ackA和pta是相鄰的基因，因此可以同時(shí)敲除，得到菌株KLP01 (ΔldhA，ΔackA-pta)。進(jìn)一步敲除poxB基因得到KLPP (ΔldhA,ΔackA-pta，ΔpoxB) 菌株，即本研究進(jìn)行高通量篩選的出發(fā)菌株。野生型MG1655發(fā)酵未檢測(cè)到丙酮酸積累，KLPP菌株搖瓶發(fā)酵丙酮酸可以達(dá)到3 g/L，5 L發(fā)酵罐發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)到45 g/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)到0.55 g丙酮酸/g葡萄糖。

2.2　突變體篩選結(jié)果

將進(jìn)行結(jié)合轉(zhuǎn)移后的菌液稀釋至合適濃度涂布于氯霉素和卡那霉素雙抗性篩選平板生長(zhǎng)，得到每個(gè)平板有 100個(gè)左右的單菌落的專(zhuān)座插入突變庫(kù)用于后續(xù)篩選。我們總共篩選了7197個(gè)克隆。

第一輪篩選：以KLPP為出發(fā)菌株，基于轉(zhuǎn)座子突變的方法篩選到了 7197個(gè)突變體 (圖1A)，以突變菌株和出發(fā)菌株中丙酮酸濃度的比值評(píng)價(jià)菌株。在7197個(gè)樣本中，篩選到的突變菌株與KLPP的丙酮酸比值大于8%的共有661個(gè)，占文庫(kù)的9%。

第二輪篩選：經(jīng)過(guò)第一輪的篩選后，得到了661個(gè)突變菌株 (圖1B)，我們選擇比值大于8%的菌株作為潛力菌株，通過(guò)96深孔板進(jìn)一步篩選到了50個(gè)菌株，經(jīng)過(guò)再次評(píng)價(jià)，篩選出了丙酮酸產(chǎn)量得到穩(wěn)定提高的6個(gè)菌株進(jìn)行后續(xù)評(píng)價(jià)。

2.3　突變菌株發(fā)酵能力分析

把上述篩選到的菌株接種于含 M9培養(yǎng)基的試管中進(jìn)行發(fā)酵評(píng)價(jià)，用HPLC對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行分析 (圖2)，發(fā)現(xiàn)這6株菌的丙酮酸產(chǎn)量確實(shí)得到了穩(wěn)定的提高。其中K5、K12、K13、K22、K30和K36丙酮酸產(chǎn)量分別提高了38%、31%、19%、28%、44%和14%。

2.4　突變體菌株轉(zhuǎn)座子插入位置的確定

通過(guò)對(duì) K5、K12、K13、K22、K30、K36六株菌進(jìn)行基因組重測(cè)序，經(jīng)過(guò)對(duì)數(shù)據(jù)的分析和與出發(fā)菌株基因組進(jìn)行對(duì)比，我們找到了五株菌的插入位點(diǎn)分別為intR基因、nanC基因 (K12和K13插入位點(diǎn)的基因是同一個(gè))、yagU基因、ydfJ基因 (表3)，K22的插入位點(diǎn)未找到。

圖1　突變菌株的丙酮酸濃度/出發(fā)菌株KLPP比值Fig. 1 The pyruvate concentration of the mutant strain/starting strain KLPP. (A) The ratio of pyruvate of 7197 mutant strains (Solid black line: OD520 is 1). (B)The ratio of pyruvate of 661 mutant strains (Solid black line: OD520 is 1).

圖2　不同突變菌株的丙酮酸產(chǎn)量Fig. 2 Production of pyruvate by different mutant strains.

2.5　突變株K30的發(fā)酵罐培養(yǎng)

為進(jìn)一步檢測(cè)篩選菌株的丙酮酸生產(chǎn)效果，我們選取搖瓶驗(yàn)證丙酮酸產(chǎn)量提高最多的菌株K30進(jìn)行了5 L發(fā)酵罐的分批補(bǔ)料發(fā)酵。結(jié)果如圖 3所示，發(fā)酵 47 h，丙酮酸產(chǎn)量可以積累到63 g/L，轉(zhuǎn)化率在50%，在放大到5 L發(fā)酵罐時(shí)發(fā)酵丙酮酸產(chǎn)量較出發(fā)菌株KLPP提升約40%。

表3　轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)的鑒定Table 3 Identification of the transposon insertion sites

圖3　K30分批補(bǔ)料發(fā)酵Fig. 3 Results of fed batch process using K30.

3　討論

我們首先以大腸桿菌MG1655出發(fā)，經(jīng)過(guò)敲除乙酸和乳酸積累的途徑，獲得了積累丙酮酸的菌株KLPP，此菌株在搖瓶發(fā)酵有3 g/L的水平，放大到5 L發(fā)酵罐時(shí)，丙酮酸產(chǎn)量可以達(dá)到45 g/L，搖瓶丙酮酸積累較低，主要原因是丙酮酸為酸性物質(zhì)，即使有緩沖體系存在，后期pH也下降至5左右，細(xì)胞停止生長(zhǎng)，因此我們后續(xù)高通量篩選的檢測(cè)時(shí)間控制在pH過(guò)低之前，以區(qū)別不同突變株的發(fā)酵能力。

為了提高丙酮酸的產(chǎn)量，并發(fā)現(xiàn)可能影響丙酮酸積累的基因，我們以KLPP為出發(fā)菌株，使用 Tn5轉(zhuǎn)座子突變的方法構(gòu)建了 1個(gè)突變體文庫(kù)，然后對(duì)突變庫(kù)進(jìn)行基于酶標(biāo)儀的快速篩選，成功地篩選到了丙酮酸產(chǎn)量穩(wěn)定提高的突變菌株。Tn5轉(zhuǎn)座插入為單插入突變，可以克服利用傳統(tǒng)誘變的方法難以對(duì)發(fā)生有效突變的菌株進(jìn)行快速基因位點(diǎn)定位的缺點(diǎn)。通過(guò)篩選得到丙酮酸產(chǎn)量提高的突變菌株，進(jìn)一步定位突變菌株的Tn5插入位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)了4個(gè)可能影響丙酮酸產(chǎn)量的基因nanC、yagU、ydfJ和intR。

其中nanC基因編碼N-乙酰神經(jīng)氨酸外膜通道蛋白[20]。nanC(yjhA) 是yjhATS操縱子中的第一個(gè)基因。有研究報(bào)道nanC基因編碼外膜特異性通道的KdgM家族的蛋白質(zhì)，nanC的表達(dá)是由N-乙酰神經(jīng)氨酸誘導(dǎo)，同時(shí)受N-乙酰葡萄糖胺調(diào)節(jié)[21]。大腸桿菌能夠使用N-乙酰神經(jīng)氨酸作為唯一的碳源生長(zhǎng)，當(dāng)缺失孔蛋白 OmpF和OmpC時(shí)，NanC是N-乙酰神經(jīng)氨酸進(jìn)入胞內(nèi)的唯一通道。但是nanC與丙酮酸產(chǎn)量提高的關(guān)系還不清楚，需要進(jìn)一步研究。

yagU編碼一種DUF1440家族內(nèi)膜酸抗性蛋白，在高度酸誘導(dǎo)時(shí)，大腸桿菌K-12 W3110中的yagU的表達(dá)量快速提高，當(dāng)yagU缺失時(shí)，細(xì)胞在高酸度下 (pH 2) 存活能力顯著降低，抗酸性降低3倍左右[22-23]。丙酮酸生產(chǎn)菌在快速積累丙酮酸時(shí)發(fā)酵液pH處于快速降低過(guò)程，在發(fā)酵末期時(shí)發(fā)酵pH低于5，細(xì)胞已基本不生長(zhǎng)。但仍不清楚酸抗性蛋白的缺失與促進(jìn)丙酮酸的積累是否有關(guān)。

在大腸桿菌的基因組注釋中ydfJ基因有多個(gè)注釋?zhuān)篗FS超家族 (Major facilitator superfamily)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[24]，一種可能的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，噬菌體或原噬菌體相關(guān)基因；Tang等[25]研究發(fā)現(xiàn)ydfJ與哺乳動(dòng)物鉀通道基因亞基Kir6.1具有8.6%的同源性，與Kir6.2基因具有8.3%的同源性，將ydfJ在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)可以產(chǎn)生一個(gè)新的 K+通道。但是ydfJ基因的缺失與丙酮酸的積累是否相關(guān)還不清楚。

intR基因組注釋為Rac原噬菌體或整合酶，根據(jù)UniProt上的功能注釋?zhuān)琲ntR有助于噬菌體定點(diǎn)整合到宿主基因組上，在和切除酶(Excisionase) 共同作用時(shí)有助于原噬菌體從宿主基因組剪切下來(lái)。到目前為止還沒(méi)有文獻(xiàn)報(bào)道該基因的詳細(xì)功能。

我們用 Tn5轉(zhuǎn)座子突變庫(kù)篩選到的可能影響丙酮酸合成基因，根據(jù)文獻(xiàn)分析都沒(méi)有找到其與丙酮酸積累的關(guān)系，但是分析這幾個(gè)基因發(fā)現(xiàn)，4個(gè)基因中有3個(gè)明確與細(xì)胞膜相關(guān)，intR沒(méi)有研究確定是否與膜相關(guān)。這其中2個(gè)是與轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)，2個(gè)與原噬菌體相關(guān)。幾個(gè)基因功能比較集中，但是與丙酮酸積累的關(guān)系仍需進(jìn)一步研究。

K12和K13的Tn5轉(zhuǎn)座子插入位置相同，但產(chǎn)量有較明顯差異，通過(guò)進(jìn)一步分析兩株菌的基因組差異，發(fā)現(xiàn)K13相對(duì)K12在cpdB基因位置有點(diǎn)突變，cpdB基因是一個(gè)有647個(gè)氨基酸的環(huán)核苷酸磷酸二酯酶，其481位色氨酸密碼子TGG突變?yōu)榻K止密碼子TAG而提前終止，這可能是造成K12和K13菌株丙酮酸產(chǎn)量差異的原因，但并沒(méi)有報(bào)道發(fā)現(xiàn)cpdB和丙酮酸積累有關(guān)，還需要進(jìn)一步研究。

Tn5轉(zhuǎn)座子插入突變是一種早就認(rèn)識(shí)的遺傳學(xué)機(jī)制，通常被用于發(fā)現(xiàn)特定功能的未知基因，主要應(yīng)用于微生物遺傳學(xué)研究。我們把這種方法應(yīng)用到菌株的遺傳改造過(guò)程中，為高產(chǎn)菌株構(gòu)建尋找有效的靶點(diǎn)，相比于傳統(tǒng)的誘變，它沒(méi)有大量的無(wú)效突變背景干擾，將是代謝工程的一種有效策略。

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