CRISPR/Cas9介導(dǎo)的高產(chǎn)谷胱甘肽原養(yǎng)型酵母工程菌的構(gòu)建

周文龍，唐亮，成凱，劉忞之，楊燕，王偉

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所 天然藥物活性物質(zhì)與功能國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)天然藥物生物合成重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050

谷胱甘肽 (Glutathione，GSH) 是細(xì)胞內(nèi)含量最多的非蛋白質(zhì)類巰基化合物，由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸經(jīng)過酶催化反應(yīng)合成[1]。GSH因其具有游離的巰基而具有很多生物活性，如抗氧化[2]、脫毒[3]、免疫調(diào)節(jié)[4]等。體內(nèi)GSH缺失與多種疾病有關(guān)，如夸休可爾癥、癲癇、阿爾茨海默病等[5]。因此，GSH被廣泛應(yīng)用于藥品、食品、化妝品等行業(yè)。目前，GSH在國(guó)內(nèi)主要用于藥物領(lǐng)域，作為肝病和癌癥治療后修復(fù)損傷的輔助用藥，在國(guó)外則以食品添加劑及保健品為主。GSH市場(chǎng)需求逐年增加，有人預(yù)測(cè)至2019年，全球GSH需求量將達(dá)200–300 t[6]。

目前，GSH生產(chǎn)的主要方法是酵母發(fā)酵法。由于野生型釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae和產(chǎn)朊假絲酵母Candida utilis細(xì)胞中 GSH含量高，因此，它們是GSH發(fā)酵生產(chǎn)的重要菌株。提高GSH產(chǎn)量的方法有提高細(xì)胞內(nèi)GSH含量、提高細(xì)胞生物量[7]、縮短菌株培養(yǎng)周期等。提高細(xì)胞內(nèi)GSH含量主要通過遺傳育種完成，目前主要有經(jīng)典篩選 (Classical selection)、遺傳工程育種等方法。提高細(xì)胞生物量主要通過優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基、優(yōu)化發(fā)酵工藝條件等途徑來實(shí)現(xiàn)[7]。菌株培養(yǎng)周期則與菌株所處環(huán)境和菌株自身遺傳背景密切相關(guān)。

Murata等分別在1981年和1983年克隆并測(cè)序了編碼GSH生物合成的兩個(gè)酶即γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶 (GSHⅠ) 和GSH合成酶 (GSHⅡ)的基因gshA和gshB[1]，之后科學(xué)家們又在一些革蘭氏陽(yáng)性菌中發(fā)現(xiàn)了能夠獨(dú)立完成 GSH生物合成的雙功能酶GshF (由gshF編碼)[8-9]。隨著參與GSH代謝酶的編碼基因不斷被分離和鑒定，科學(xué)家們利用多種遺傳工程策略提高模式微生物細(xì)胞內(nèi)GSH的產(chǎn)量，在這些遺傳操作過程中需要用到抗性或者營(yíng)養(yǎng)缺陷型等遺傳標(biāo)記篩選陽(yáng)性克隆。其中營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株為初級(jí)代謝途徑阻斷變異型，僅能在一些特定的培養(yǎng)基中正常生長(zhǎng)。

近年來，串聯(lián)間隔短回文重復(fù)序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR) 及 RNA 靶向內(nèi)切酶 Cas9(CRISPR-Cas9) 介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)發(fā)展迅速并得以廣泛應(yīng)用。該技術(shù)通過一段短的引導(dǎo)RNA (Guide RNA，gRNA) 識(shí)別特定的DNA序列，通過改變gRNA序列即可使Cas9定位到新的DNA序列。目前該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于多種生物如人、小鼠、斑馬魚等的基因編輯[10]。

本研究旨在通過在釀酒酵母中建立 CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)，回復(fù)突變工程菌株W303-1b/FGP為原養(yǎng)型菌株，使其能夠自主合成生命活動(dòng)中必需的小分子化合物，能在簡(jiǎn)單的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，方便大規(guī)模培養(yǎng)。

1　材料與方法

1.1　菌株與培養(yǎng)基

大腸桿菌Escherichia coliTrans1-T1 (TransGen公司) 用于重組DNA的擴(kuò)增與構(gòu)建。釀酒酵母工程菌株 W303-1b/FGP (MATα ade2-1 leu 2-3，112 his3-11，15 ura3-1 trp1-1) (表 1)[11]為出發(fā)菌株。

YPD培養(yǎng)基：酵母提取物10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L。

1.2　質(zhì)粒構(gòu)建與酵母轉(zhuǎn)化

1.2.1　Cas9表達(dá)載體的構(gòu)建

以質(zhì)粒pGADT7 (Clontech) 為基礎(chǔ)構(gòu)建含有編碼Cas9基因的表達(dá)載體，首先用以酵母基因組DNA為模板和引物PGK1_Sph/PGK1_Nde擴(kuò)增3-磷酸甘油酸激酶基因啟動(dòng)子 (PGK1)，此后用限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)SphⅠ和NdeⅠ定向亞克隆到質(zhì)粒 pGADT7中，即得到 pGAD-PGK1。由于編碼 Cas9的基因較長(zhǎng)，分 2步進(jìn)行亞克隆到質(zhì)粒pGAD-PGK1中。先用質(zhì)粒模板pX260 (Addgene)和引物X260_1/X260_2擴(kuò)增2.2 kb片段，用限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和EcoRⅠ亞克隆到 pGADPGK1；然后再用X260_2/X260_4擴(kuò)增1.8 kb片段，用限制性內(nèi)切酶SacⅠ和XhoⅠ亞克隆，即得到含有Cas9編碼框的質(zhì)粒pGAD-Cas9。為消除質(zhì)粒 pGAD-Cas9的篩選標(biāo)記leu2，利用引物GADT7_H3/GADT7_Nhe和質(zhì)粒pGAD-Cas9為模板擴(kuò)增ADH1終止子，再用相同的內(nèi)切酶Hind Ⅲ和NheⅠ置換相應(yīng)的 DNA區(qū)段，消除長(zhǎng)度為1.9 kb的篩選標(biāo)記Leu2基因，并保留原始終止子ADH1序列不變，最后利用引物Bla_Nhe/Bla_Not和pPIC6 (Invitrogen公司) 質(zhì)粒為模板擴(kuò)增含有殺稻瘟菌素 (Blasticidin) 抗性篩選標(biāo)記的基因片段，用限制性內(nèi)切酶NheⅠ和NotⅠ亞克隆到消除篩選標(biāo)記Leu2的pGAD-Cas9質(zhì)粒中，即獲得含有抗性篩選標(biāo)記 (Bla) 并組成型表達(dá)Cas9的表達(dá)載體pGAD-Cas9-Bla。

1.2.2　gRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)框的構(gòu)建

以DiCarlo等報(bào)道的方法[13]，利用引物 (表2)SNR_G1到SNR_G7和Ade_G1經(jīng)過連續(xù)PCR的方法獲得含有釀酒酵母 snoRNA SNR52啟動(dòng)子和一個(gè)靶向ade2的gRNA序列的295 bp DNA片段；同時(shí)以引物Ade_G2和SNR_G8到SNR_G9經(jīng)連續(xù)PCR方法獲得含有g(shù)RNA結(jié)構(gòu)片段和釀酒酵母SUP4終止子3′區(qū)的120 bp DNA片段；上述2個(gè)片段進(jìn)行DNA變性和退火補(bǔ)平反應(yīng)，再利用引物SNR_G1和SNR_G9進(jìn)行PCR擴(kuò)增，即得到能轉(zhuǎn)錄表達(dá)靶向ade2的gRNA結(jié)構(gòu)片段(gRNA (Ade))。最后將該片段進(jìn)行“TA”克隆到載體EZ-T (北京康潤(rùn)科技有限公司)，得到質(zhì)粒EZ-gRNA-Ade。其余靶向釀酒酵母ura3、leu2、trp1、his3基因的 gRNA表達(dá)框分別用引物Ura_G1、Leu_G1、Trp_G1、His_G1 與 M13+和引物 Ura_G2、Leu_G2、Trp_G2、His_G2 與 M13–為引物配對(duì)，以 EZ-gRNA-Ade為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，然后以上輪 PCR擴(kuò)增得到的 2個(gè)DNA片段進(jìn)行補(bǔ)平反應(yīng)，再以補(bǔ)平后的 DNA片段為模板，再利用引物 SNR_G1和 SNR_G9進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，即得到能轉(zhuǎn)錄表達(dá) gRNA的DNA 結(jié)構(gòu)片段，即 gRNA (Ura3)、gRNA (Leu2)、gRNA (Trp1)、gRNA (His3)。

表1　工程菌株W303-1b/FGP基因型Table 1 W303-1b/FGP genotype

表2　本實(shí)驗(yàn)所使用PCR擴(kuò)增引物Table 2 PCR primers used in this study

1.2.3　目的基因 DNA片段的擴(kuò)增、回復(fù)突變及陽(yáng)性克隆的鑒定

分別以野生型釀酒酵母S288C基因組DNA或含有目的基因的質(zhì)粒為模板，以Ade1/Ade2、Ura1/Ura2、Leu1/Leu2、Trp1/Trp2、His1/His2為引物對(duì)，利用PCR擴(kuò)增分別編碼ade2、ura3、1eu2(pGADT7)、trp1(pGBKT7) 和his3的目的基因片段，電泳定量觀察?；貜?fù)突變實(shí)驗(yàn)分為3個(gè)階段進(jìn)行：首先利用醋酸鋰法[14]將表達(dá)Cas9的質(zhì)粒載體pGAD-Cas9-Bla轉(zhuǎn)化W303-1b/FGP，用75 μg/mL殺稻瘟菌素進(jìn)行篩選；用轉(zhuǎn)錄表達(dá)gRNA (Ade2)、gRNA (Ura3) 的結(jié)構(gòu)DNA片段各1 μg和用于回復(fù)突變ade2、ura3所對(duì)應(yīng)的基因片段各5 μg共轉(zhuǎn)化表達(dá)Cas9的感受態(tài)細(xì)胞，用含有殺稻瘟菌素和不添加Ade和Ura 合成培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，獲得的陽(yáng)性克隆即為回復(fù)突變了ade2、ura3這2個(gè)基因的陽(yáng)性克隆；然后在此基礎(chǔ)上進(jìn)行第2次回復(fù)突變1eu2、trp1位點(diǎn)；最后回復(fù)突變his3位點(diǎn)，即獲得了回復(fù)突變5個(gè)營(yíng)養(yǎng)缺陷篩選標(biāo)記 (ade2、ura3、1eu2、trp1和his3) 的原養(yǎng)型工程菌W303-1b/FGPPT。

提取原養(yǎng)型工程菌W303-1b/FGPPT的基因組DNA，分別利用引物對(duì)Ade1/Ade2、URA1/URA2、Leu1/Leu2、Trp1/Trp2、His1/His2進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，然后純化PCR擴(kuò)增的DNA片段；為確?；貜?fù)突變位點(diǎn)測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性，分別合成測(cè)序引物 Ade3、Ura3、Leu3、Leu4、Trp3、His3進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，使得回復(fù)突變位于每個(gè)測(cè)序引物所測(cè)得的圖譜最準(zhǔn)確的150–600 bp之間。

1.3　釀酒酵母工程菌株搖瓶培養(yǎng)

挑取回復(fù)突變的工程菌株 3個(gè)陽(yáng)性克隆于20 mL YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃、250 r/mim培養(yǎng) 18–24 h作為種子液，轉(zhuǎn)接適當(dāng)體積種子至50 mL新鮮的YPD培養(yǎng)基中，使得培養(yǎng)液初始OD600為0.2，30 ℃、220 r/min條件下培養(yǎng)。

1.4　分析方法

1.4.1　細(xì)胞干重的測(cè)量

收集 5 mL菌液，滅菌雙蒸水漂洗 2次，100 ℃下烘干24 h。

1.4.2　濁度測(cè)量

將培養(yǎng)一段時(shí)間的培養(yǎng)液稀釋至適當(dāng)濃度，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定600 nm下的吸光度值 (OD600)。

1.4.3　細(xì)胞內(nèi)GSH的萃取

利用 40%乙醇萃取的方法萃取釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)的GSH[11]。

1.4.4　細(xì)胞內(nèi)GSH的產(chǎn)量

利用 4-(氨磺酰)-7-氟 2,1,3-苯并惡二唑 (ABDF) 衍生化法測(cè)定萃取液中GSH的濃度[15]。分析柱為YMC-Pack ODS-A 250 mm×4.6 mm。D.S-5 μm，30 nm。梯度洗脫條件為：0–14 min，8%B 相；15–18 min，8%–90% B 相；19–22 min，90% B 相；23–26 min，90%–8% B 相；27–30 min，8% B相；流速1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為390 nm，以GSH濃度與峰面積形成的曲線為標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5　原養(yǎng)型菌株GSH產(chǎn)量穩(wěn)定性分析

挑取3個(gè)原養(yǎng)型單克隆于10 mL液體WMVIII培養(yǎng)基[16]中，30 ℃、250 r/mim條件下培養(yǎng)至OD600為15–30，轉(zhuǎn)接至新鮮的10 mL液體WMVIII培養(yǎng)基中，并使初始OD600=0.5，再培養(yǎng)至OD600為15–30，重新轉(zhuǎn)接，共轉(zhuǎn)接20次，每轉(zhuǎn)接5次測(cè)定菌株GSH產(chǎn)量。

2　結(jié)果

2.1　CRISPR/Cas9系統(tǒng)的建立

目前文獻(xiàn)報(bào)道用于釀酒酵母的 CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)都是使用含有營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)記如ura3的質(zhì)粒載體[13,17]，與本研究所要獲得的原養(yǎng)型工程菌株相矛盾，于是以質(zhì)粒pGADT7為骨架，構(gòu)建了含有抗性篩選標(biāo)記Bla并使用轉(zhuǎn)錄活性較弱的啟動(dòng)子PGK1表達(dá)Cas9的質(zhì)粒載體 (圖1A)；gRNA的轉(zhuǎn)錄直接通過PCR方法構(gòu)建融合表達(dá)框。

2.2　原養(yǎng)型工程菌株的構(gòu)建

圖1　釀酒酵母原養(yǎng)型菌株構(gòu)建示意圖 (A：Cas9表達(dá)載體pGAD-Cas9-Bla示意圖；B：CRISPR/Cas9介導(dǎo)的釀酒酵母營(yíng)養(yǎng)缺陷型的回復(fù)突變)Fig. 1 Schematic diagram of the reversion of the auxotrophic strain. (A) Schematic diagram of pGAD-Cas9-Bla. (B)The reversion of the auxotrophic strain mediated by CRISPR/Cas9.

將質(zhì)粒pGAD-Cas9-Bla轉(zhuǎn)化進(jìn)入釀酒酵母工程菌株W303-1b/FGP中，將陽(yáng)性克隆命名為W303-1b/FGP/Cas9。然后，分 3次進(jìn)行原養(yǎng)型回復(fù)突變，依次是ade2和ura3、leu2和trp1、his3基因。其操作過程主要是把野生型的目的基因片段和轉(zhuǎn)錄合成靶向相應(yīng)基因的 gRNA結(jié)構(gòu) DNA片段按 5∶1的比例共轉(zhuǎn)化進(jìn)入菌株W303-1b/FGP/Cas9中，其中利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)同時(shí)進(jìn)行多個(gè)基因的編輯操作已得到實(shí)驗(yàn)證實(shí)[17-18]；利用不添加相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)因子的SC合成培養(yǎng)基進(jìn)行陽(yáng)性克隆篩選，最終獲得回復(fù)為原養(yǎng)型的工程菌株W303-1b/FGPPT，基本過程見圖1B。在正向選擇壓力下，獲得陽(yáng)性克隆率為 100%，利用 PCR方法擴(kuò)增陽(yáng)性克隆的靶基因DNA片段并測(cè)序驗(yàn)證 (圖2)。

圖2　釀酒酵母原養(yǎng)型菌株回復(fù)突變位點(diǎn)的測(cè)序結(jié)果 (▲：回復(fù)的突變位點(diǎn)；∨：回復(fù)的插入突變位點(diǎn)；△：缺失突變位點(diǎn). A：ade2-1 T190G，赭石突變位點(diǎn)的回復(fù)；B：ade2-1 G301A，Gly>Arg的回復(fù)突變；C：Leu2-3,112, T249插入的G缺失回復(fù)；D：Leu2-3,112, A792插入的G缺失回復(fù)；E：ura3-1 A701G, Glu>Gly的回復(fù)突變；F：trp1-1 T190G，琥珀突變位點(diǎn)的回復(fù)；G：his3-11,15 G208的缺失回復(fù)；H：his3-11,15 G319的缺失回復(fù))Fig. 2 The sequencing results of reverse allelic sites. ▲: reverse mutation. ∨: reverse insertion; △: reverse deletion.(A) ade2-1 T190G, reverse ochre mutation. (B) ade2-1 G301A, Gly>Arg reverse mutation. (C) Leu2-3,112, G249 reverse an insertion. (D) Leu2-3,112, G792 reverse an insertion. (E) ura3-1 A701G, Glu>Gly reverse mutation. (F)trp1-1 T190G, reverse amber mutation. (G) his3-11,15 G208 reverse deletion. (H) his3-11,15 G319 reverse deletion.

2.3　營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株與原養(yǎng)型菌株的培養(yǎng)周期

為觀察營(yíng)養(yǎng)缺陷型釀酒酵母工程菌株W303-1b/FGP與原養(yǎng)型工程菌株W303-1b/ FGPPTGSH產(chǎn)量及生物量的差別，將兩種菌株同時(shí)在YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在不同時(shí)間內(nèi)測(cè)定兩種菌株的細(xì)胞內(nèi)GSH產(chǎn)量及生物量。結(jié)果如圖3所示。由圖3A可知，營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株W303-1b/FGP與原養(yǎng)型工程菌株W303-1b/FGPPT的GSH最大產(chǎn)量均為216 mg/L左右。由圖3B可知，二者的最高生物量 (DCW) 為9.3 g/L。但是菌株W303-1b/FGP的生物量在培養(yǎng) 96 h時(shí)達(dá)到最大，而菌株W303-1b/FGPPT在培養(yǎng)48 h時(shí)即達(dá)到最大生物量。

2.4　原養(yǎng)型菌株的GSH產(chǎn)量穩(wěn)定性

為考察工程菌株回復(fù)為原養(yǎng)型后GSH產(chǎn)量的穩(wěn)定性，將菌株 W303-1b/FGPPT在無機(jī)鹽培養(yǎng)基 WMVIII中進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)，最初培養(yǎng)液OD600為 0.5，當(dāng)OD600達(dá)到 15–30時(shí)轉(zhuǎn)移至新鮮的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，每轉(zhuǎn)接 5次觀察一下菌株最大生物量及GSH產(chǎn)量是否發(fā)生變化，共轉(zhuǎn)接20次，結(jié)果如表3和圖4所示，連續(xù)培養(yǎng)過程中菌株 GSH產(chǎn)量與連續(xù)培養(yǎng)前的比較采用 T檢驗(yàn)，比較結(jié)果P>0.05，認(rèn)為沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。由表3和圖4的結(jié)果可知，菌株W303-1b/FGPPT在 WMVIII培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng) 100代后，菌株GSH產(chǎn)量沒有改變。

圖3　YPD培養(yǎng)基中工程菌株W303-1b/FGPPT和W303-1b/FGP的GSH產(chǎn)量 (A) 及生物量 (B) 隨時(shí)間的變化Fig. 3 GSH production (A) and cell growth (B) of W303-1b/FGPPT and W303-1b/FGP in YPD medium.

表3　原養(yǎng)型菌株連續(xù)培養(yǎng)100代GSH產(chǎn)量Table 3 GSH production of the prototrophic strain in 100 generations

圖4　工程菌株W303-1b/FGPPT合成GSH的穩(wěn)定性Fig. 4 The stability of GSH production of W303-1b/FGPPT strain.

3　討論

近年來，基因組編輯技術(shù)快速發(fā)展，其中CRISPR/Cas9技術(shù)因設(shè)計(jì)操作簡(jiǎn)便、編輯高效與通用性廣等優(yōu)點(diǎn)而備受關(guān)注[10]，在釀酒酵母中也同樣有文獻(xiàn)報(bào)道[13,17-19]。但這些研究都使用了酵母細(xì)胞自身的營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)記如trp1、leu2、ura3等，并且還使用了雙質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)或單個(gè)質(zhì)粒同時(shí)表達(dá)Cas9和gRNA；實(shí)驗(yàn)操作過程復(fù)雜，花費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)。盡管也有文獻(xiàn)報(bào)道一步多基因編輯的成功操作，但也需要構(gòu)建多個(gè)gRNA表達(dá)框串聯(lián)的質(zhì)粒表達(dá)載體[17-18]。本研究為簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)操作，首次成功地直接利用 gRNA融合表達(dá)框轉(zhuǎn)錄表達(dá)目的gRNA，同時(shí)還探索研究了 2個(gè)基因同時(shí)進(jìn)行基因編輯的可行性并在正向選擇壓力情況下獲得成功，這為更多基因座位的編輯提供實(shí)驗(yàn)借鑒。

2013年酵母產(chǎn)品的全球市場(chǎng)已達(dá)到58億美元，預(yù)計(jì)2019年將達(dá)到92億美元[20]，GSH就是其中一個(gè)具有廣泛使用范圍的產(chǎn)品。在大多數(shù)原核和真核細(xì)胞中，GSH是含量最豐富的非蛋白質(zhì)類巰基化合物，濃度可達(dá)0.2–10 mmol/L[21]。細(xì)胞內(nèi)還原型 GSH與氧化型谷胱甘肽 (GSSG)比例可達(dá)到30∶1–100∶1，形成氧化還原電勢(shì)為E0=–240 mV，此電勢(shì)對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)適宜的氧化還原狀態(tài)非常重要，如清除細(xì)胞內(nèi)多余的自由基和重金屬等[22]。因此，GSH可以用于治療GSH缺失的疾病以及化妝品行業(yè)。另外，含GSH豐富的酵母物質(zhì)因其特殊的kokimi風(fēng)味而被用于食品工業(yè)[23]。

目前生產(chǎn) GSH所用的菌株主要為釀酒酵母和產(chǎn)朊假絲酵母，其中產(chǎn)朊假絲酵母中GSH最高產(chǎn)量可達(dá) 2.45 g/L[24]。利用基因工程改造的微生物也有可能得到GSH產(chǎn)量極高的菌株，例如在大腸桿菌Escherichia coliJM109 (pTrc99A-gshF)中，GSH產(chǎn)量可達(dá)11.30 g/L[25]。為提高GSH產(chǎn)量，科學(xué)家們做了一系列研究，其中兩個(gè)主要的方法是提高生物量和細(xì)胞內(nèi)GSH含量[7]。

研究組前期獲得了組合表達(dá)3條GSH合成途徑的酵母工程菌 W303-1b/FGP[11]，但該工程菌株存在多個(gè)營(yíng)養(yǎng)缺陷型基因，難以實(shí)現(xiàn)在無機(jī)鹽培養(yǎng)基的發(fā)酵培養(yǎng)。為消除這些營(yíng)養(yǎng)缺陷型基因?qū)е碌膰?yán)重不足，利用CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)，將營(yíng)養(yǎng)缺陷型釀酒酵母菌株W303-1b/FGP回復(fù)為原養(yǎng)型W303-1b/FGPPT后，在搖瓶水平下達(dá)到GSH產(chǎn)量最高所需的時(shí)間由96 h縮短為48 h，發(fā)酵周期大大縮短，單位時(shí)間GSH產(chǎn)量提高1倍。

與營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株相比，原養(yǎng)型菌株一個(gè)很大的優(yōu)點(diǎn)是可以自身合成Trp等必需小分子，這就使得原養(yǎng)型菌株可以在簡(jiǎn)單的、化學(xué)成分確定的無機(jī)鹽培養(yǎng)基 (Chemical defined medium，CDM) 中正常生長(zhǎng)，而不需要額外添加昂貴的氨基酸。利用CDM進(jìn)行培養(yǎng)有從實(shí)驗(yàn)室搖瓶培養(yǎng)向規(guī)?；糯笊a(chǎn)轉(zhuǎn)化更快、過程再現(xiàn)強(qiáng)以及下游操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)[26]。

原養(yǎng)型菌株在 WMVIII培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)100代GSH產(chǎn)量不發(fā)生明顯變化，說明該菌株GSH生產(chǎn)能力穩(wěn)定，上游基因改造不會(huì)在長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)過程中發(fā)生丟失，有利于菌株更深入的工程改造和放大培養(yǎng)。

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