甘蔗基因克隆的研究進(jìn)展

譚秦亮+潘成列+周全光+朱鵬錦+歐克緯+李穆

摘 要：甘蔗是我國(guó)當(dāng)前主要的糖料作物，蔗糖業(yè)發(fā)展是廣西的主要經(jīng)濟(jì)發(fā)展方向，對(duì)保障廣西經(jīng)濟(jì)及農(nóng)民生活水平具有重大的戰(zhàn)略意義。隨著基因工程技術(shù)的帶動(dòng)，甘蔗抗旱基因克隆對(duì)選育抗旱甘蔗品種及定向改良具有重要作用?，F(xiàn)從甘蔗抗旱功能基因和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因兩個(gè)方面全面進(jìn)行研究總結(jié)，以期為甘蔗抗旱育種的基因克隆研究提供參考。

關(guān)鍵詞：甘蔗 抗旱育種 基因克隆 研究進(jìn)展

甘蔗（Saccharum officinarum L.）屬于禾本科甘蔗屬C4植物，主要生長(zhǎng)在熱帶、亞熱帶地區(qū)，為一年生或多年生草本植物，如今是我國(guó)主要的糖料作物。蔗糖業(yè)發(fā)展是廣西的主要經(jīng)濟(jì)發(fā)展方向，對(duì)保障廣西經(jīng)濟(jì)及農(nóng)民生活水平具有重大的戰(zhàn)略意義。然而隨著全球氣候的惡化，極端天氣的頻繁出現(xiàn)，缺水干旱正嚴(yán)重危害著廣西的甘蔗生產(chǎn)與發(fā)展。甘蔗屬于無(wú)性繁殖的多倍體植物，具有遺傳背景復(fù)雜、基因組龐大等特點(diǎn)，同時(shí)又缺乏優(yōu)異農(nóng)藝性狀的育種親本，對(duì)利用表現(xiàn)性狀進(jìn)行傳統(tǒng)抗逆性遺傳育種的研究造成諸多困難，因此如何選育高產(chǎn)高糖抗逆性強(qiáng)的甘蔗新品種成為現(xiàn)階段甘蔗育種的關(guān)鍵轉(zhuǎn)折點(diǎn)。

近年來(lái)，隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，利用分子生物技術(shù)對(duì)甘蔗品種進(jìn)行遺傳性狀改良已成為甘蔗育種的熱門研究。選育抗旱甘蔗品種對(duì)甘蔗產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展甚為重要，而通過(guò)基因改良提高甘蔗抗旱性是目前比較熱門的研究方向。了解與分析近年來(lái)對(duì)甘蔗抗旱基因克隆的相關(guān)研究現(xiàn)狀，有助于為下一步研究把握方向，為進(jìn)一步挖掘出更多重要抗旱基因用于甘蔗品種改良打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

1 甘蔗滲透調(diào)節(jié)相關(guān)基因的研究

甘蔗是一種對(duì)水分和熱量要求比較高的植物，在甘蔗的生理代謝、營(yíng)養(yǎng)吸收和物質(zhì)轉(zhuǎn)化等過(guò)程中均少不了水分的參與，因此水分是維持甘蔗正常生長(zhǎng)發(fā)育的重要物質(zhì)。當(dāng)甘蔗受到干旱脅迫時(shí)，苗期蔗苗的萌芽、中期蔗株的分蘗、伸長(zhǎng)以及后期甘蔗糖分的積累等不同生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程均會(huì)受到限制，從而使甘蔗體內(nèi)發(fā)生一系列的生理生化反應(yīng)，如滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)變化、活性氧增加、光合作用受抑制等，是影響甘蔗產(chǎn)量和品質(zhì)最主要的非生物脅迫因素。大量研究發(fā)現(xiàn)干旱脅迫時(shí)甘蔗體內(nèi)會(huì)積累大量的代謝物質(zhì)，并通過(guò)自身的調(diào)節(jié)功能維持細(xì)胞內(nèi)外的物質(zhì)平衡和滲透壓平衡。這些滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)分為2類：一類是游離小分子有機(jī)物質(zhì)，主要包括脯氨酸、甜菜堿、可溶性糖、氨基酸等；另一類是外界進(jìn)入植物體內(nèi)的無(wú)機(jī)離子，主要有K+、CL-、Ca2+、Mg2+、Na+等。

脯氨酸是一種小分子的滲透物質(zhì)，在正常生理pH范圍內(nèi)不帶靜電荷，對(duì)植物無(wú)毒害作用。在細(xì)胞含水量很低時(shí)脯氨酸仍能提供足夠的自由水，從而維持細(xì)胞的正?；顒?dòng)，因此脯氨酸被認(rèn)為是與抗旱性密切相關(guān)的植物滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。在干旱脅迫時(shí)為了提高植物的抗旱性，植物細(xì)胞內(nèi)會(huì)積累大量游離脯氨酸，從而增加植物對(duì)水分脅迫和滲透脅迫的抗性[1]。至今已從水稻、擬南芥、黑麥、大豆、番茄等植物中成功克隆出了多個(gè)脯氨酸合成酶或與之相關(guān)的基因，研究證明。1-吡咯琳-5-羧酸合成酶（P5CS）與脯氨酸脫氫酶（ProDH）都是脯氨酸合成的主要酶類。Molinari等[2]將脯氨酸合成酶基因（P5CS）導(dǎo)入甘蔗體內(nèi)中，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因甘蔗在干旱情況下誘導(dǎo)脯氨酸大量積累，在干旱12 d后轉(zhuǎn)基因植株的生物量明顯提高。黃城梅[3]采用同源克隆與RT-PCR方法從甘蔗中成功克隆到Sc-P5CS基因，建立反義植物表達(dá)載體后轉(zhuǎn)入煙草，進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)入Sc-P5CS基因的煙草植物矮小、葉片變黃，猜測(cè)這與抑制了脯氨酸的合成有很大的關(guān)系。

海藻糖能夠有效的保護(hù)植物體內(nèi)細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，因此甘蔗在受到干旱脅迫時(shí)海藻糖可以有效防止細(xì)胞失水，從而使甘蔗具有更強(qiáng)的抗旱、抗寒能力。Li等[4]在水稻中克隆并轉(zhuǎn)基因海藻糖-6-磷酸合成酶基因OsTPS1，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不僅可以使一些與干旱脅迫相關(guān)的基因上調(diào)表達(dá)，而且在誘導(dǎo)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株中，海藻糖和脯氨酸的濃度明顯高于普通植株。Zhang[5]等將海藻糖合成酶基因轉(zhuǎn)入甘蔗，通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)基因甘蔗體內(nèi)一系列生理指標(biāo)的測(cè)量，轉(zhuǎn)基因植株能夠合成和積累海藻糖并明顯提高了甘蔗的抗旱性。

2 甘蔗抗氧化防御類相關(guān)基因的研究

當(dāng)植物受到干旱脅迫時(shí)活性氧產(chǎn)生的速率會(huì)隨著脅迫的加大而遞增，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的活性氧代謝失去平衡，而過(guò)剩的活性氧將在細(xì)胞內(nèi)誘發(fā)自由基連鎖反應(yīng)，然后產(chǎn)生H2O2、O2-、OH- 等更多的自由基和活性氧，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)大量積累活性氧類物質(zhì)時(shí)就會(huì)對(duì)細(xì)胞造成一定的傷害，主要表現(xiàn)為[6-8]：①加快細(xì)胞膜脂過(guò)氧化，從而損傷甚至瓦解維持植物細(xì)胞區(qū)域化的膜系統(tǒng)；②活性氧攻擊核酸堿基，破壞核酸結(jié)構(gòu)，使變異產(chǎn)生并積累；③活性氧與色氨酸殘基或者酶蛋白的巰基發(fā)生反應(yīng)使酶失活；④活性氧對(duì)DNA復(fù)制過(guò)程的傷害，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的合成受到破壞。超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GPX）及過(guò)氧化物酶（POD）是植物體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)的主要作用酶，在植物受到干旱脅迫時(shí)會(huì)激活這一類的氧化酶基因過(guò)量表達(dá)，然后快速提高植物清除活性氧的能力，增強(qiáng)相關(guān)蛋白復(fù)合體及膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。

2.1 超氧化物歧化酶（SOD）

SOD是一類廣泛存在于植物細(xì)胞內(nèi)的金屬酶，是膜脂過(guò)氧化防御系統(tǒng)的關(guān)鍵保護(hù)酶，也是抵御活性氧傷害的第一道防線。它能催化活性氧發(fā)生歧化反應(yīng)生成H2O2和O2，其他酶類負(fù)責(zé)把H2O2分解為H2O，從而避免植物受到傷害[9]。由于定位與結(jié)合的金屬離子的不同，可以將SOD分為以下3種[10-11]：主要存在于葉綠體和細(xì)胞質(zhì)中的Cu/Zn-SOD；主要存在于線粒體的Mn-SOD；主要存在于葉綠體的Fe-SOD。隨著人們對(duì)SOD的不斷研究與深入，已經(jīng)在水稻[12]、小麥[13]、甘蔗[14]、擬南芥[15]等很多植物中對(duì)其克隆成功。

王盛等[14]在甘蔗中成功克隆得Cu/Zn-SOD，對(duì)其進(jìn)行各種逆境脅迫后定量分析，結(jié)果表明該基因的表達(dá)受到干旱、低溫、高鹽及氧化脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)，且主要存在于甘蔗葉片中，與該基因定位于植物地上綠色部位的推測(cè)完全一致。

Que等[11]成功克隆到甘蔗Mn-SOD基因的全長(zhǎng)，進(jìn)行黑穗病菌脅迫后發(fā)現(xiàn)該基因受到甘蔗黑穗病菌脅迫的強(qiáng)烈誘導(dǎo)，推測(cè)該基因具有清除多余氧自由基和抗病的功能。 Galune[16]對(duì)番茄進(jìn)行干旱脅迫后分析Cu/Zn-SODs的變化，結(jié)果顯示干旱脅迫可以誘導(dǎo)Cu/Zn-SODs，而且是番茄對(duì)干旱脅迫的重要響應(yīng)途徑。Lyudmila等[17]對(duì)抗性和感性小麥品種進(jìn)行長(zhǎng)期干旱脅迫研究，并對(duì)小麥體內(nèi)的抗氧化酶進(jìn)行實(shí)時(shí)定量分析，結(jié)果隨著小麥的生長(zhǎng)正常未受脅迫的小麥中Cu/Zn-SOD和Fe-SOD的活性均明顯下降，且Fe-SOD逐漸消失，而受到干旱脅迫后的小麥Fe-SOD和Mn-SOD的活性均不斷增加，尤其是在感性品種中表現(xiàn)更為明顯。由此推測(cè)，不同植物中的SOD同工酶在受到干旱脅迫時(shí)活性變化與表現(xiàn)不盡一致。

2.2 抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）

APX是植物體內(nèi)防御氧化脅迫和自身活性氧代謝的重要抗氧化酶類，主要存在于細(xì)胞的葉綠體、線粒體和胞質(zhì)中，是一種由卟啉與肽鏈構(gòu)成的血紅蛋白。APX是抗壞血酸—谷胱甘肽循環(huán)（ASA-GSH循環(huán)）途徑的關(guān)鍵作用酶，利用其提供的電子將H2O2還原催化轉(zhuǎn)化為H2O。根據(jù)APX存在位置的不同可以有以下4種：①存在于細(xì)胞質(zhì)的cAPX；②存在于類囊體的tAPX；③存在于微體膜的mAPX；④存在于葉綠體基質(zhì)的sAPX。

近年來(lái)，有關(guān)APX的研究主要集中在逆境脅迫下活性的變化或轉(zhuǎn)錄水平基因克隆等方面，已有擬南芥（Arabidopsis thaliana）、大麥（Hordeum vulgare）、甘蔗（Saccharum officinarum）棉花（Gossypium spp.）、水稻（Oryza sativa）、西紅柿（Lycopersicon esculentum）、馬鈴薯（Solanum tuberosum）等多種植物的APX基因被成功克隆和深入研究。王竹青等[18]結(jié)合電子克隆技術(shù)和RT-PCR等方法克隆到甘蔗APX基因，該基因全長(zhǎng)1171bp編碼345個(gè)氨基酸，并對(duì)其進(jìn)行ABA、PEG、NaCl等逆境脅迫，結(jié)果均呈上調(diào)表達(dá)。克隆百合APX基因并將其導(dǎo)入擬南芥，結(jié)果發(fā)現(xiàn)擬南芥植株APX酶活性和耐鹽性均顯著提高[19]。有研究發(fā)現(xiàn)APX基因的過(guò)量表達(dá)，可明顯提高轉(zhuǎn)基因植株的抗旱抗氧化等抗逆境脅迫能力，并可以有效保護(hù)膜系統(tǒng)遭受活性氧的侵害，從而提高轉(zhuǎn)基因植物的抗逆性和耐受性。過(guò)表達(dá)APX的轉(zhuǎn)基因煙草在受到氧化脅迫和除草劑脅迫時(shí)tAPX活性比野生型的提高了37倍，不僅有效地提高了轉(zhuǎn)基因煙草的抗氧化脅迫能力，而且增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)除草劑誘導(dǎo)和氧化脅迫誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的抗性[20-21]。鹽脅迫耐受型和敏感型不同基因型的黑麥草[22]，在試驗(yàn)處理4 d后耐受型植株葉片中SOD和 APX的活性明顯提高，而在敏感型的植株葉片中MDA、H2O2的含量明顯增加，APX等抗氧化酶的活性均低于對(duì)照組。同樣的情況在水稻中也有所發(fā)現(xiàn)[23]，高鹽脅迫水稻幼苗葉片，隨后葉片中的SOD、APX、CAT等抗氧化酶的活性不斷升高，因此在植物受到各種非生物脅迫時(shí)APX在植物抵御逆境脅迫時(shí)起到了重要的作用。

3 甘蔗ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)研究

3.1 ABA生物合成途徑中的關(guān)鍵酶

近年來(lái)，許多研究表明[24-25]，C40的類胡蘿卜素間接途徑是高等植物體內(nèi)ABA的主要生物合成途徑。該途徑以C40的類胡蘿卜素為前體，再由類胡蘿卜素裂解成C15的化合物黃質(zhì)醛（XAN），最終通過(guò)氧化裂解轉(zhuǎn)化成ABA[25]。在此途徑中9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶（NCED）是催化裂解類胡蘿卜素前體的關(guān)鍵酶，研究表明ABA合成的類胡蘿卜素前體的含量可比ABA含量高出上百倍，可稱為“類胡蘿卜素前體庫(kù)”，因此NCED被認(rèn)為是ABA生物合成中最重要的限速酶。植物NCED基因是一個(gè)只在特定組織表達(dá)的多基因家族，其cDNA已在擬南芥[26-27]、甘蔗[28]、大麥[29]、花生[30]、馬鈴薯[31]等植物上被克隆到。轉(zhuǎn)基因植物中NCED基因的過(guò)量表達(dá)能引起ABA的積累和耐旱性的增加，過(guò)量表達(dá)甘蔗SoNCED、番茄LeNCED3、擬南芥AtNCED3、豆類PvNCED1均可以使轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)ABA含量的增加，并且顯著提高了轉(zhuǎn)基因植株的耐干旱的能力[26，28，32-33]。

在擬南芥中，NCED基因是一個(gè)多基因家族共有9個(gè)成員，其中5個(gè)基因在 ABA生物合成中有功能活性[34]。在這5個(gè)基因中，AtNCED3被認(rèn)為是響應(yīng)干旱脅迫的，在葉片中起著主要作用[37]。研究發(fā)現(xiàn)在擬南芥中，AtNCED3的表達(dá)受到干旱脅迫的上調(diào)，過(guò)量表達(dá)AtNCED3的植物積累ABA，并表現(xiàn)出蒸騰作用減弱的現(xiàn)象，耐旱力增強(qiáng)[35]。李長(zhǎng)寧等[28，36]運(yùn)用RT-PCR及RACE-PCR技術(shù)克隆出甘蔗SoNCED基因，并擴(kuò)增出SoNCED基因的開(kāi)放閱讀框，大小為1827 bp，編碼608個(gè)氨基酸。在不同脅迫時(shí)進(jìn)行甘蔗葉片實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析，該基因在干旱、低溫、高鹽等條件的處理下均能誘導(dǎo)表達(dá)。SoNCED基因的表達(dá)量在不同脅迫處理后到達(dá)峰值時(shí)間雖有差異，但都有明顯的上調(diào)表達(dá)。同時(shí)在甘蔗葉片和根系中發(fā)現(xiàn)SoNCED基因表達(dá)量均能隨著活性氧產(chǎn)生速率的升高而顯著上升，并與ABA含量的增長(zhǎng)呈協(xié)同關(guān)系，因此推測(cè)SoNCED基因參與了甘蔗葉片和根系內(nèi)源ABA合成的調(diào)控。對(duì)玉米、柑橘等作物進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)[37-39]，NCED基因的表達(dá)均可被不同逆境脅迫誘導(dǎo)，且表達(dá)量與ABA含量有著協(xié)同效應(yīng)，過(guò)表達(dá)該基因能明顯提高轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)源ABA的含量和耐脅迫能力。

3.2 甘蔗ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因

通過(guò)對(duì)ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究發(fā)現(xiàn)[40-45]，植物細(xì)胞在受到逆境誘導(dǎo)時(shí)可以合成內(nèi)源ABA，ABA與其受體PYR1結(jié)合后再與PP2C結(jié)合形成三元復(fù)合體，從而抑制了PP2C的活性 ，使受PP2C抑制的SnRK2s激酶處于活性狀態(tài)，SnRK2s激酶能磷酸化ABA響應(yīng)元件的結(jié)合蛋白或結(jié)合因子，然后激活A(yù)BA應(yīng)答基因的表達(dá)，從而調(diào)控植物的生理反應(yīng)和生長(zhǎng)發(fā)育。SnRK2s是該途徑中關(guān)鍵的調(diào)控酶基因，它的激活在植物響應(yīng)滲透逆境脅迫時(shí)發(fā)揮著重要的作用。

譚秦亮等[46]利用RT-PCR和RACE-PCR技術(shù)，克隆出編碼甘蔗SnRK2蛋白的基因SoSnRK2，并對(duì)該基因進(jìn)行了原核表達(dá)及蛋白純化的分析，在ABA、干旱、低溫等外源脅迫處理下發(fā)現(xiàn)在甘蔗葉片中該基因均上調(diào)表達(dá)，推測(cè)該基因參與調(diào)控干旱、高鹽和低溫等脅迫過(guò)程，在甘蔗抗逆境脅迫中起重要作用。小麥的TaSnRK2.3基因被克隆后轉(zhuǎn)擬南芥，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因擬南芥上調(diào)表達(dá)，不僅能夠改善根系生長(zhǎng)，而且能夠顯著提升耐旱、耐鹽、和抗凍結(jié)能力[47]。

4 結(jié)語(yǔ)

關(guān)于甘蔗抗旱的生理生化研究已有很多，但是在基因工程方面的研究還處于初級(jí)階段。尤其與水稻、玉米等作物相比，甘蔗中基因的克隆只是局限在同源克隆和電子克隆技術(shù)上。因此，在這方面的研究應(yīng)該著重于基因的功能分析，在獲得一些抗旱相關(guān)基因后對(duì)它們進(jìn)行更深入的調(diào)控機(jī)制分析，進(jìn)而加強(qiáng)多基因間的聯(lián)合轉(zhuǎn)化及研究。以后在該方面的研究可以偏向于選擇調(diào)控抗旱信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的基因上，然后構(gòu)建多個(gè)抗旱基因的表達(dá)載體，進(jìn)行甘蔗轉(zhuǎn)化研究甘蔗的綜合性狀表現(xiàn)。希望通過(guò)對(duì)這方面的研究總結(jié)，可以為甘蔗的基因工程育種奠定理論基礎(chǔ)并提供技術(shù)儲(chǔ)備。

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