發(fā)酵法制備D乳酸研究進(jìn)展

李曉姝，高大成，王領(lǐng)民，張霖，樊亞超

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發(fā)酵法制備D乳酸研究進(jìn)展

李曉姝，高大成，王領(lǐng)民，張霖，樊亞超

（中國石油化工股份有限公司撫順石油化工研究院，遼寧撫順113001）

D乳酸作為一種重要的有機(jī)酸，在許多領(lǐng)域都得到了廣泛應(yīng)用，以D-乳酸為單體合成的聚乳酸材料因其優(yōu)異的性能亦展現(xiàn)出良好的市場前景。而微生物發(fā)酵法合成D-乳酸在經(jīng)濟(jì)效益和環(huán)境效益等方面具有著顯著的優(yōu)勢。綜述了生物法制備D乳酸的最新進(jìn)展，同時(shí)指出高產(chǎn)穩(wěn)定菌株的獲得以及與其性能適應(yīng)的發(fā)酵工藝的開發(fā)，是提高發(fā)酵法D乳酸生產(chǎn)競爭力的關(guān)鍵所在。

D-乳酸；發(fā)酵；應(yīng)用

乳酸在自然界中分布廣泛，存在于多種植物、動(dòng)物和微生物中，是生物體的常見代謝產(chǎn)物之一。乳酸是自然界中最小的手性分子，且常為DL混合型，是公認(rèn)的三大有機(jī)酸之一。由于人和動(dòng)物體內(nèi)只含有L-乳酸脫氫酶，僅能對(duì)L-乳酸進(jìn)行代謝，因此L-乳酸制備工業(yè)較早得以開發(fā)和發(fā)展。近年來，隨著D-乳酸在農(nóng)藥、醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，D乳酸的開發(fā)開始受到廣泛關(guān)注。

D乳酸的制備方法有化學(xué)拆分法、微生物酶法拆分和微生物發(fā)酵法[1,2]?；瘜W(xué)法合成乳酸的途徑通常有丙酸氯化水解法、乙醛氫氰酸法和丙烯-N2O4法等，得到的乳酸全部是外消旋DL-乳酸[3]。因此，通過化學(xué)合成法想要得到D-乳酸還需要進(jìn)行一系列的化學(xué)拆分和分離步驟。其中，化學(xué)拆分時(shí)使用的拆分劑價(jià)格昂貴，同時(shí)后續(xù)的分離過程還存在難度大，毒性大，污染嚴(yán)重等問題。

微生物酶法拆分是利用脂肪酶選擇性，可對(duì)酯類化合物的多種反應(yīng)進(jìn)行催化。當(dāng)脂肪酶與混旋的乳酸酯反應(yīng)時(shí)，脂肪酶可以選擇性水解L-乳酸酯，而未被水解的D乳酸酯通過萃取和化學(xué)水解可以得到D-乳酸[4]。然而，該方法的工藝復(fù)雜，生產(chǎn)成本較高。相對(duì)地，微生物發(fā)酵法制備D-乳酸的生產(chǎn)成本較低，并能直接合成高光學(xué)純度的D-乳酸，是工業(yè)上最具前景的生產(chǎn)方式。本文就近年來生物法合成D乳酸的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。

1 D-乳酸的應(yīng)用及市場

1.1 D-乳酸在合成及化學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用

D-乳酸可以作為多種手性物質(zhì)的合成前體，也是重要的手性中間體及有機(jī)合成原料，在醫(yī)藥、農(nóng)藥、化妝品等許多化工領(lǐng)域的手性合成中有著廣泛的應(yīng)用[5]。D-乳酸是制備芳氧丙酸類除草劑的光學(xué)活性前體，芳氧丙酸類除草劑是最早實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的一類旋光性除草劑，近年來在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣[6]。以高光學(xué)純度D-乳酸和甲醇酯化合成的D-乳酸甲酯可用來合成多種手性化合物，可作為重要的醫(yī)藥中間體[7]。

1.2 D-乳酸在聚乳酸材料方面的應(yīng)用

聚乳酸作為一種生物基高分子材料，具有著諸多優(yōu)良特性，其良好的耐熱性、阻燃性和透明性，以及獨(dú)特的生物相容性等，在許多領(lǐng)域都有廣泛應(yīng)用[8]。聚乳酸塑料以優(yōu)異的生物可降解性、熱塑性、安全性等而被公認(rèn)為是取代傳統(tǒng)塑料的理想材料之一。聚乳酸材料在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域可以用作疫苗佐劑、骨內(nèi)固定物等。由于聚D-乳酸（PDLA）材料不被人體利用，只能被人體內(nèi)微生物所分解，因此可以被用作藥物緩釋技術(shù)等[9]。

根據(jù)立體化學(xué)組成的不同，聚乳酸又分為聚左旋乳酸（PLLA）、聚右旋乳酸（PDLA）和聚消旋乳酸（PDLLA），三種聚合物的性能也不盡相同[10]。PLLA和PDLA具有結(jié)晶性，PDLLA是非晶性的。而聚乳酸材料結(jié)構(gòu)中各異構(gòu)體含量的不同，會(huì)導(dǎo)致材料降解速率、強(qiáng)度等性能的差異[11]。

1.3 D-乳酸的市場與生產(chǎn)現(xiàn)狀

資料顯示2014年全球乳酸市場約35~40萬t，年增長率達(dá)10%。國內(nèi)乳酸市場約7~8萬 t，年出口量4~5萬t。雖然目前的國內(nèi)產(chǎn)能已超過傳統(tǒng)乳酸市場的消化量，但許多新廠仍在建設(shè)[12]。2014年，山東金玉米引進(jìn)中科院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所乳酸技術(shù)，開始新建2 000 t規(guī)模的D-乳酸生產(chǎn)線[13]；紹興新寧采用上海新立公司的技術(shù)籌建規(guī)模為2000 t的D-乳酸工廠。這些新建項(xiàng)目均以合成下游聚乳酸產(chǎn)品為目標(biāo)，而獲得高光學(xué)純度的乳酸單體是聚乳酸聚合工業(yè)的前提要求。目前，大多數(shù)廠家采用發(fā)酵法制備L-乳酸（光學(xué)純度96%~99%），而D-乳酸（光學(xué)純度大于99%）只有普拉克及日本武蔵野能以工業(yè)規(guī)模提供市場。

近幾年，隨著高光學(xué)純度D型及L型聚乳酸材料合成技術(shù)的突破以及材料在耐熱、力學(xué)等多項(xiàng)性能上的提高，聚乳酸材料廣受關(guān)注，應(yīng)用領(lǐng)域已大為拓展。2014年，全球聚乳酸市場約11~12萬t，且每年以20%~30%的增幅上漲。預(yù)計(jì)到2020年，全球聚乳酸市場可達(dá)30~50萬t[12]。聚乳酸塑料在安全環(huán)保方面的優(yōu)勢是傳統(tǒng)塑料無法比擬的，僅我國若能逐步限制傳統(tǒng)一次性產(chǎn)品的生產(chǎn)使用，將會(huì)大大擴(kuò)充國內(nèi)的乳酸和聚乳酸市場容量。目前，全球聚乳酸主要由NatureWorks公司年產(chǎn)15萬t規(guī)模的工廠供應(yīng)。其他聚乳酸生產(chǎn)企業(yè)產(chǎn)量相較太小，成本價(jià)格受規(guī)模效應(yīng)影響偏高，因而難以影響市場。中糧、普拉克、海正等公司，均計(jì)劃新增產(chǎn)能，以滿足聚乳酸市場需求[14]。

2 發(fā)酵法制備D乳酸的研究進(jìn)展

2.1 微生物合成乳酸的發(fā)酵類型

微生物發(fā)酵生產(chǎn)D乳酸是利用糖類等物質(zhì)作為碳源，加上氮源及其他營養(yǎng)元素，通過某些種類微生物來合成D乳酸。按照產(chǎn)D乳酸細(xì)菌的代謝途徑及產(chǎn)物的不同，可將乳酸發(fā)酵分為三種類型，即：同型乳酸發(fā)酵、異型乳酸發(fā)酵和混合酸型發(fā)酵。同型乳酸發(fā)酵是指經(jīng)EMP途徑生成的丙酮酸在乳酸脫氫酶（LDH）作用下轉(zhuǎn)化成乳酸，乳酸是葡萄糖的唯一代謝產(chǎn)物，但由于發(fā)酵過程中必然伴隨著一系列的微生物生理活動(dòng)，因此轉(zhuǎn)化率無法達(dá)到理論上的100%[15]。異型乳酸發(fā)酵[16]是指發(fā)酵過程中葡萄糖代謝除生產(chǎn)乳酸外，還有CO2、乙醇等其他代謝產(chǎn)物。葡萄糖代謝合成乳酸的理論轉(zhuǎn)化率不同菌種差別較大，但轉(zhuǎn)化率均在60%以下。混合酸發(fā)酵[17]是同型發(fā)酵微生物在特殊情況下進(jìn)行的一種發(fā)酵方式，當(dāng)葡萄糖濃度受限、溫度較低或pH 值改變，同型發(fā)酵的微生物則進(jìn)行混合酸型發(fā)酵?；旌纤岚l(fā)酵仍然經(jīng)過EMP途徑，但代謝途徑發(fā)生改變，生成的代謝副產(chǎn)物以小分子有機(jī)酸為主。

2.2 D乳酸發(fā)酵菌種

2.2.1 D乳酸生產(chǎn)菌株的選育與改造

當(dāng)前，國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注較多的D-乳酸生產(chǎn)菌種是芽孢乳桿菌屬和乳桿菌屬。這兩類菌屬的發(fā)酵同屬于同型發(fā)酵，即以葡萄糖為碳源，經(jīng)EMP途徑生成丙酮酸，再由D-乳酸脫氫酶（LDH）作用下轉(zhuǎn)化為D-乳酸。芽孢乳桿菌屬和乳桿菌屬的菌株還具有發(fā)酵所需能耗少，產(chǎn)物濃度高，適宜規(guī)?；l(fā)酵合成D-乳酸的特點(diǎn)。

丁子建等[18]采用微氧發(fā)酵芽孢乳桿菌（Sporola ctobacillus sp.），發(fā)酵72 h產(chǎn)物D-乳酸濃度達(dá)到41 g/L，葡萄糖轉(zhuǎn)化率達(dá)到68%，產(chǎn)物光學(xué)純度96%。付衛(wèi)明[19]采用紫外線與硫酸二乙酯復(fù)合誘變S. inulinus BME126，D-乳酸產(chǎn)量相比出發(fā)菌株提高了45%。Xu等[20]通過氮離子束誘變了一株野生型芽孢乳桿菌，得到的突變株Sporolactoba cillus sp. Y2-8發(fā)酵，產(chǎn)物D-乳酸達(dá)到122 g/L，產(chǎn)量相比出發(fā)菌株提高了199%，葡萄糖摩爾轉(zhuǎn)化率162%。鄭輝杰[21]采用紫外線和硫酸二乙酯誘變結(jié)合pH梯度篩選，所選出發(fā)菌株為菊糖芽孢乳桿菌SP-BME126，篩選得到了遺傳穩(wěn)定性優(yōu)良的菌株。

2.2.2 D乳酸生產(chǎn)菌株的基因工程構(gòu)建

近年來，利用基因工程技術(shù)進(jìn)行菌株改造得到了迅速的發(fā)展，基因構(gòu)建技術(shù)定向性強(qiáng)，可對(duì)菌種進(jìn)行定向構(gòu)建。

大腸埃希菌是最常用的工程菌之一，為模式菌株，目前該菌株的基因組序列已經(jīng)全部測出。常用于基因工程領(lǐng)域中基因克隆和載體構(gòu)建。孟武等[22]克隆了大腸埃希菌E.coli W3110中4個(gè)代謝木糖關(guān)鍵基因：木糖異構(gòu)酶基因（xylA）、木酮糖激酶基因（xylB）、轉(zhuǎn)酮醇酶基因（tktA）和轉(zhuǎn)醛醇酶基因（talA），并構(gòu)建出含低氧啟動(dòng)子基因Pugb的加強(qiáng)型木糖表達(dá)載體，將該載體轉(zhuǎn)化到E.coli W3110中，該菌株為甲酸乙醇基因缺失的突變株。構(gòu)建組成型代謝木糖基因表達(dá)載體后，菌株W3110獲得了代謝木糖合成D-乳酸的能力，E.coli W3110突變株中質(zhì)粒的表達(dá)，強(qiáng)化了重組菌代謝木糖的能力，該菌株代謝木糖生成的D-乳酸光學(xué)純度達(dá)99%以上，產(chǎn)量相比出發(fā)菌株提高了10%。胡媛等[23]利用枯草芽孢桿菌的基因組DNA作為模板，擴(kuò)增得到葡萄糖脫氫酶基因（gdh），將其與表達(dá)載體pETduet-1連接，構(gòu)建出pETduet-GDH。以粘質(zhì)沙雷氏菌的基因組DNA為模板，擴(kuò)增得到乳酸脫氫酶基因（ldh），與pETduet-GDH連接得到pETduet-LG，轉(zhuǎn)化進(jìn)入菌株E.coli BL21進(jìn)行共表達(dá)。該重組大腸埃希菌可還原丙酮酸合成D-乳酸，底物的轉(zhuǎn)化率可達(dá)86.5%，D-乳酸濃度17.3 g/L。

此外，研究人員亦開展了其他類型菌株的基因構(gòu)建以生成D-乳酸。Okino等[24]先將谷氨酸棒桿菌的L-乳酸脫氫酶基因（L-ldh）敲除，再向該菌株中轉(zhuǎn)入大腸埃希菌的D-乳酸脫氫酶基因，構(gòu)建出具有合成D-乳酸能力的谷氨酸棒桿菌。利用該菌株發(fā)酵D-乳酸的產(chǎn)量達(dá)120 g/L，產(chǎn)物光學(xué)純度大于99.9%。

2.3 發(fā)酵工藝

2.3.1 D乳酸發(fā)酵原料的選擇

乳酸細(xì)菌合成D-乳酸的產(chǎn)量較高，但由于菌株自身合成氨基酸及B族維生素的能力較差[25]，生長所需的營養(yǎng)條件復(fù)雜，造成發(fā)酵成本較高，且不能有效利用木質(zhì)纖維素基質(zhì)和戊糖中的糖類。為了降低發(fā)酵成本，同時(shí)也為契合發(fā)酵原料不與人爭糧的戰(zhàn)略要求，研究者們開始了新型D-乳酸發(fā)酵原料的探索。

Calabia等[26]利用菌株L delbrueckii JCM 1148，分別以13%（w/v）蔗糖汁、13%（w/v）蔗糖蜜、10%（w/v）甜菜汁為原料，在pH 6.40條件下發(fā)酵72 h，D-乳酸的產(chǎn)量最高達(dá)到120 g/L，產(chǎn)物光學(xué)純度最高達(dá)98.3%。Remedios等[27]選用菌株Lactobacillus coryniformis，以纖維素為底物發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸。發(fā)酵前先用纖維素酶水解原料纖維素，水解溫度45 ℃，水解pH為4.8。在適宜的發(fā)酵條件，即溫度在39 ℃，pH為6時(shí)，產(chǎn)物D-乳酸最高生產(chǎn)強(qiáng)度為1.32 g/L/h，得率為82%。文獻(xiàn)[28]報(bào)道了以菌株Lactobacillus coryniformis ATCC 25600，采用廢紙板為原料發(fā)酵合成D-乳酸，D-乳酸終產(chǎn)量為23.4 g/L。

2.3.2 新型發(fā)酵工藝

同步糖化發(fā)酵（SSF）是指糖化過程與發(fā)酵過程同時(shí)進(jìn)行的發(fā)酵工藝，一方面可以避免過高的葡萄糖濃度對(duì)酶活和D-乳酸合成的抑制，另一方面可以提高設(shè)備利用率和縮短發(fā)酵周期。同步糖化發(fā)酵過程中使用的糖化酶種類主要取決于原料，這些水解酶包括纖維素酶、淀粉酶、菊粉酶等。姚日生等[29]考察了吐溫80對(duì)稻草同步糖化發(fā)酵產(chǎn)乳酸中的作用。發(fā)現(xiàn)同等水解程度下，吐溫80的加入可顯著降低酶加量，將0.2 g/g的吐溫80添加到酶用量10FPU/g體系時(shí)，水解120 h后的糖產(chǎn)率為292.2 mg/g，比未加吐溫80的體系糖產(chǎn)率增加11%。葉志隆[30]使用餐廚垃圾進(jìn)行同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)乳酸，采用二階響應(yīng)面法對(duì)蛋白酶等的投入量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)蛋白酶加量與乳酸產(chǎn)量呈顯著正相關(guān)。Takaaki Tanaka等[31]考察了米糠為原料（濃度100 g/L），以菌株L.delbrueckii IFO 3202，同步糖化法發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸，發(fā)現(xiàn)當(dāng)pH在6.0~6.8時(shí)會(huì)產(chǎn)生外消旋乳酸，控制體系的pH在5.0，發(fā)酵溫度37 ℃，發(fā)酵36 h后產(chǎn)D-乳酸28 g/L，產(chǎn)物的光學(xué)純度95%。

固定化發(fā)酵可重復(fù)利用菌體細(xì)胞，使得發(fā)酵過程在高細(xì)胞濃度下連續(xù)進(jìn)行。專利[32]以纖維作為固定材料，將芽孢乳桿菌在固定化反應(yīng)體系中發(fā)酵，菌體的固定化過程結(jié)束后，可進(jìn)行多批次的反復(fù)發(fā)酵。產(chǎn)物乳酸濃度可達(dá)到140 g/L以上，生產(chǎn)強(qiáng)度最高達(dá)1.72 g/L/h，D-乳酸光學(xué)純度為99.12%。原位分離技術(shù)（ISPR），可以通過將發(fā)酵體系中的代謝產(chǎn)物及時(shí)移除，降低高產(chǎn)物濃度對(duì)細(xì)菌生長和產(chǎn)物合成的抑制作用。Danner等[33]設(shè)計(jì)出了超濾膜生物反應(yīng)器（MBR）與單極電滲析箱（ED）耦合的MBR-ED操作系統(tǒng)，采用可以利用戊糖和己糖的嗜熱脂肪芽孢桿菌BS 119連續(xù)發(fā)酵合成乳酸。產(chǎn)物乳酸的終濃度達(dá)到115 g/L，運(yùn)行1 052 h時(shí)測定，未發(fā)現(xiàn)有微生物污染，該操作系統(tǒng)可降低高BOD廢水的排放，同時(shí)可降低能耗，具有很高的環(huán)境效益。

3 結(jié)論與展望

隨著D-乳酸應(yīng)用領(lǐng)域的不斷拓廣，尤其是以D-乳酸為原料的聚乳酸材料性能的不斷提高和廣泛應(yīng)用，D-乳酸的合成越來越受到關(guān)注。生物法合成D-乳酸具有生產(chǎn)成本低，產(chǎn)品光學(xué)純度高，合成路線綠色友好的特點(diǎn)，是最具前景的生產(chǎn)方式。高光學(xué)純度D-乳酸產(chǎn)品的高效合成，很大程度上取決于生產(chǎn)菌種的性能。一直以來，研究者們對(duì)傳統(tǒng)的乳酸發(fā)酵菌株開展了大量研究，由于菌種自身對(duì)于某些營養(yǎng)物質(zhì)的合成缺陷，往往生產(chǎn)時(shí)的培養(yǎng)基組分復(fù)雜，對(duì)發(fā)酵成本的影響較大。近年來，隨著基因工程科學(xué)的發(fā)展，基因工程育種技術(shù)開始吸引國內(nèi)外學(xué)者的目光。利用基因工程技術(shù)可以對(duì)傳統(tǒng)生產(chǎn)菌種進(jìn)行改造，使其在轉(zhuǎn)化率和底物耐受性等方面得到提高；同時(shí)應(yīng)用于大腸桿菌及其他D-乳酸生產(chǎn)菌株的基因改造在某些方面也開始顯現(xiàn)出優(yōu)越性。由于產(chǎn)物在微生物機(jī)體中的合成是多步酶促反應(yīng)協(xié)同作用的結(jié)果，因此，對(duì)于D-乳酸產(chǎn)生菌的改造應(yīng)基于較為全面的菌種基因組序列信息，在多水平下，開展全面的代謝網(wǎng)絡(luò)分析，以便實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)菌株的定向、有效構(gòu)建。

為了提高D-乳酸產(chǎn)率，學(xué)者們圍繞D-乳酸生產(chǎn)過程開發(fā)了許多新的發(fā)酵技術(shù)，如同步糖化法、固定化發(fā)酵技術(shù)、連續(xù)化發(fā)酵和原位分離技術(shù)等。新型發(fā)酵技術(shù)的開發(fā)，對(duì)于提高設(shè)備利用效率，減少產(chǎn)物抑制，實(shí)現(xiàn)連續(xù)化發(fā)酵等具有著重要意義。D-乳酸的高效合成需要穩(wěn)定高產(chǎn)的菌株，需要與菌種的性能和特性相適應(yīng)的高效乳酸發(fā)酵工藝，同時(shí)還需開發(fā)出高效低能耗的分離提取工藝，才能在成本和產(chǎn)品純度上使生物法D-乳酸生產(chǎn)更具有競爭性。

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Research Progress in Preparation of D-lactic Acid by Fermentation

（Fushun Research Institute of Petroleum and Petrochemicals，SINOPEC，Liaoning Fushun 113001，China）

As an important organic acid，D-lactic acid is widely used in a lot of fields. PLA materials which are synthesized from D-lactic acid also show good market prospects because of their excellent performance. Synthesizing D-lactic acid via the biological way has significant advantages, such as good economic benefit and good environmental benefit. In this paper, the latest development of biological production of D-lactic acid was introduced．It's pointed that obtaining high yield and stable strains and developing corresponding fermentation process is the key point to improve the competitiveness of D-lactic acid production by biological method.

D-lactic acid; Fermentation; Application

TQ 201

A

1671-0460（2017）08-1659-04

2017-04-14

李曉姝（1984-），女，遼寧撫順人，工程師，碩士，2013年畢業(yè)于遼寧石油化工大學(xué)化學(xué)工程與技術(shù)專業(yè)，從事微生物化學(xué)品研發(fā)工作。E-mail：lixiaoshu.fshy@sinopec.com。