肥大細(xì)胞響應(yīng)機(jī)械刺激與穴位敏化的生理基礎(chǔ)

顧金濤,楊洪偉,沈周鋒,丁光宏

1. 復(fù)旦大學(xué)上海市針灸效應(yīng)與穴位功能重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，航空航天系(上海，200433) 2. 上海市針灸經(jīng)絡(luò)研究中心(上海，201203)

肥大細(xì)胞響應(yīng)機(jī)械刺激與穴位敏化的生理基礎(chǔ)

顧金濤1,2,楊洪偉1,2,沈周鋒1,2,丁光宏1,2

1. 復(fù)旦大學(xué)上海市針灸效應(yīng)與穴位功能重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，航空航天系(上海，200433) 2. 上海市針灸經(jīng)絡(luò)研究中心(上海，201203)

該文對(duì)肥大細(xì)胞響應(yīng)機(jī)械刺激的有關(guān)文獻(xiàn)加以回顧總結(jié)與分析，發(fā)現(xiàn)肥大細(xì)胞響應(yīng)機(jī)械刺激與細(xì)胞外基質(zhì)、粘附因子和細(xì)胞骨架密切相關(guān)，為探討肥大細(xì)胞在針刺效應(yīng)和穴位敏化中的作用機(jī)制提供了新線索。

肥大細(xì)胞； 穴位敏化； 機(jī)械刺激； 細(xì)胞外基質(zhì)； 粘附因子； 細(xì)胞骨架

多年來(lái),國(guó)內(nèi)外學(xué)者在對(duì)經(jīng)絡(luò)本質(zhì)和原理的研究，主要從經(jīng)穴的組織形態(tài)、生理學(xué)、生物化學(xué)、物理學(xué)以及作用途徑等多方面多學(xué)科進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究和臨床研究。但各種還原論的假說(shuō)，無(wú)法解釋《靈柩·經(jīng)脈》中概括經(jīng)脈的功能“經(jīng)脈者，所以能決死生，處百病，調(diào)虛實(shí)，不可不通?！薄峨y經(jīng)》中將十二經(jīng)脈比作溝渠，奇經(jīng)八脈比作湖海，可通過(guò)針刺進(jìn)行調(diào)節(jié)。所以筆者認(rèn)為基于功能效用的中醫(yī)，經(jīng)脈應(yīng)該理解為所有脈管系統(tǒng)的總稱(chēng)，包括動(dòng)脈、靜脈、淋巴管以及部分神經(jīng)功能的集合。

1879年Ehrlich首先發(fā)現(xiàn)了肥大細(xì)胞，它廣泛地分布于界面組織，如皮膚及淋巴器官、呼吸系統(tǒng)、消化道和生殖系統(tǒng)各組織器官中，在小血管、毛細(xì)血管、淋巴管周?chē)?，在神?jīng)末梢、神經(jīng)叢處大量聚集[1]。肥大細(xì)胞的分布特性，可以概括為分布在脈管系統(tǒng)周?chē)?。許多研究顯示了肥大細(xì)胞在過(guò)敏、哮喘、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化及腫瘤等疾病中的作用[2]，提示肥大細(xì)胞在針灸經(jīng)脈治療體系中的作用。20世紀(jì)70年代，宋繼美[3]首先提出了肥大細(xì)胞與經(jīng)絡(luò)現(xiàn)象有關(guān)的假說(shuō)。隨后的研究發(fā)現(xiàn)了，經(jīng)脈循行線下肥大細(xì)胞數(shù)量較多[4]，穴位處血管密度較高[5]、肥大細(xì)胞數(shù)量較多[6]。肥大細(xì)胞釋放組胺等物質(zhì)，可以使血管通透性增加，因此經(jīng)穴處的肥大細(xì)胞就如江湖水閘對(duì)血液通透性進(jìn)行調(diào)節(jié)，與中醫(yī)古籍中針刺經(jīng)絡(luò)作用效果描述類(lèi)似?！鹅`樞·九針十二原》說(shuō)： “五臟有疾也，應(yīng)出十二原。”內(nèi)臟有病會(huì)在特定的經(jīng)穴處反映，與西醫(yī)牽涉痛相似?！鹅`樞·經(jīng)筋》中的“以痛為輸”以及《靈樞·背輸》中的“欲得而驗(yàn)之，按其處，應(yīng)在中而痛解，乃其腧也”，即阿是穴、以痛為腧的取穴方法，作為診斷治療的依據(jù)和方法。因此經(jīng)穴的功能是與臟腑狀態(tài)相關(guān)聯(lián)的，具有動(dòng)態(tài)特性[7]。有研究表明肥大細(xì)胞參與了穴位敏化過(guò)程[8]，疾病狀態(tài)下相關(guān)穴位處肥大細(xì)胞數(shù)量明顯增多，手針和電針刺激可以顯著調(diào)節(jié)穴位處肥大細(xì)胞的數(shù)量[9-10]，手針效果較電針更顯著[11-12]。

由于肥大細(xì)胞在神經(jīng)、免疫以及內(nèi)分泌系統(tǒng)中具有廣泛的聯(lián)系和作用，逐漸成為針刺以及經(jīng)穴特異性研究中的焦點(diǎn)。然而大部分研究集中于對(duì)化學(xué)刺激的響應(yīng)，鮮見(jiàn)系統(tǒng)對(duì)機(jī)械刺激(力學(xué)刺激)響應(yīng)的機(jī)理研究。本文著眼于肥大細(xì)胞對(duì)機(jī)械刺激的響應(yīng)，從細(xì)胞外基質(zhì)、粘附因子和細(xì)胞骨架三個(gè)方面，將與肥大細(xì)胞響應(yīng)機(jī)械刺激的有關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行整理與分析，冀能為肥大細(xì)胞針刺與穴位敏化機(jī)理以及相關(guān)疾病的研究提供新的視角和思路。

1 肥大細(xì)胞簡(jiǎn)介

1.1 肥大細(xì)胞的分化與成熟

一般認(rèn)為，全身各處的肥大細(xì)胞來(lái)源于CD34+骨髓前體細(xì)胞/造血祖細(xì)胞(Bone Marrow Precursor Cells/Hematopoietic Progenitor Cells)[13-14]，但有研究表明肥大細(xì)胞來(lái)源于腦而非骨髓[15]。肥大細(xì)胞以前體細(xì)胞的形式在血液中運(yùn)輸，到達(dá)組織后再分化成熟。成熟肥大細(xì)胞壽命長(zhǎng)達(dá)數(shù)月至數(shù)年，且在一定刺激下會(huì)增殖[16]。

成熟后的肥大細(xì)胞主要由兩種表型： 一種在人體被描述為 MCTC(等價(jià)于嚙齒類(lèi)動(dòng)物的CTMC,Connective Tissue or Serosal MCs)，其中含有類(lèi)胰蛋白酶(Tryptase)和糜蛋白酶(Chymase)，主要與皮膚有關(guān)； 另一種是 MCT(等價(jià)于嚙齒類(lèi)動(dòng)物的MMC,Mucosal MCs)，它只含有類(lèi)胰蛋白酶，在黏膜組織中占主導(dǎo)地位； 第三種MCC占比很小，主要在鼻腔及腸道粘膜[17]。

1.2 肥大細(xì)胞對(duì)刺激的反應(yīng)

肥大細(xì)胞通過(guò)不同的受體可以對(duì)廣泛的刺激做出反應(yīng)[18]。例如： 機(jī)械力、熱、光和放射線等物理性刺激[19-21]； IgE 、IgG、干擾素(Interferon,IFN)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(Nervegrowthfactor,NGF)、神經(jīng)肽、細(xì)菌、病毒以及藥物等的化學(xué)性刺激[17，22]。

肥大細(xì)胞對(duì)刺激反應(yīng)分為三個(gè)階段： ①快速反應(yīng)： 受到刺激后幾秒內(nèi)，釋放已經(jīng)存儲(chǔ)在顆粒中的介質(zhì)，如： 組胺、血清素(Serotonin,5-羥色胺)、肝素、蛋白酶、蛋白多糖、組織蛋白酶G抗體等[17]； ②釋放快速合成脂質(zhì)介質(zhì)： 包括花生四烯酸及活性代謝產(chǎn)物，如前列腺素D2(PGD2)，白三烯C4(LTC4)，血栓素，和血小板活化因子(PAF)[22]； ③釋放新合成的細(xì)胞因子和趨化因子： 細(xì)胞因子包括TNF-α，GM-CSF，SCF，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-8，IL-10，IL-13，IL-14，bF-GF，EGF，PDGF，VEGF，IFN-γ和趨化因子如(MIP)-1-α，I-309，(MCP)-1和lymphotactin[17]。

1.3 機(jī)械刺激引起肥大細(xì)胞響應(yīng)的過(guò)程

肥大細(xì)胞存在于組織中，肥大細(xì)胞響應(yīng)機(jī)械刺激首先是一個(gè)機(jī)械刺激(力學(xué)信號(hào))由外而內(nèi)傳遞的過(guò)程。機(jī)械刺激通過(guò)細(xì)胞外基質(zhì)(膠原蛋白)傳遞，機(jī)械刺激通過(guò)粘附因子(整合素、免疫球蛋白等)傳遞到細(xì)胞內(nèi)骨架(微管、微絲、中間纖維)，最終引起細(xì)胞響應(yīng)。

2 細(xì)胞外基質(zhì)在肥大細(xì)胞響應(yīng)機(jī)械刺激中的作用

2.1 肥大細(xì)胞與膠原纖維的相互作用

余曉佳等[24]研究發(fā)現(xiàn)Ⅰ型膠原在其響應(yīng)機(jī)械刺激中起到關(guān)鍵作用，用Ⅰ型膠原酶“足三里”穴位預(yù)處理破壞膠原纖維后，再手針針刺，針刺鎮(zhèn)痛效果被顯著抑制，同時(shí)肥大細(xì)胞脫顆粒率明顯降低。此外，研究表明肥大細(xì)胞具有促進(jìn)肺成纖維細(xì)胞增殖和分泌Ⅰ型膠原，肺成纖維細(xì)胞與肥大細(xì)胞直接接觸共培養(yǎng)，肺成纖維細(xì)胞數(shù)量以及Ⅰ型膠原含量明顯高于非接觸共育或肺成纖維細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)?；罨腂MMC分泌硫化肽白三烯(Sulfido-Peptide Leukotrienes)，而與纖維細(xì)胞共培養(yǎng)后，則轉(zhuǎn)為分泌前列腺素D。BMMC與纖維母細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)可增加表達(dá)，并能增強(qiáng)由活化引起的脫顆粒。RBL-2H3細(xì)胞與纖連蛋白粘附，增強(qiáng)介導(dǎo)的組胺釋放[25]，說(shuō)明纖連蛋白能夠調(diào)節(jié)肥大細(xì)胞脫顆粒的程度。

2.2 影響肥大細(xì)胞遷移募集的趨化因子

研究表明[26-27]，肥大細(xì)胞在各種疾病發(fā)生發(fā)展以及在針灸治療的過(guò)程中均會(huì)出現(xiàn)局部大量聚集，并釋放相關(guān)物質(zhì)參與反應(yīng)。雖然肥大細(xì)胞壽命長(zhǎng)達(dá)數(shù)月至數(shù)年，且成熟肥大細(xì)胞在一定刺激下會(huì)增殖[16]。但一些實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)[28]，局部增多的肥大細(xì)胞并非來(lái)源于增殖，而且肥大細(xì)胞可以在超敏反應(yīng)30 min內(nèi)快速募集[29]?？梢哉T導(dǎo)肥大細(xì)胞遷移募集的主要趨化因子有： 活化正常T 細(xì)胞表達(dá)及分泌的化學(xué)因子RANTES(Regulate upon Activation Normal T Cell Expressed and Secreted)，巨嗜細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及浸潤(rùn)白細(xì)胞等合成分泌的單核細(xì)胞趨化蛋白-1(Monocyte Chemoattractant Protein-1，MCP-1)，嗜酸性粒細(xì)胞選擇性的化學(xué)趨化劑Eotaxin，干細(xì)胞因子(Stem Cell Factor,SCF)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(Transforming Growth Factor,TGF)，激活素(Activin,ACT)，腫瘤壞死因子-A(Tumor Necrosis Factor-A,TNF-A)、白介素-4(Interleukin-4,IL-4)、白介素-8(IL-8)，組胺(Histamine)，C反應(yīng)蛋白(C-Reactive Protein,CRP)。

3 粘附因子在肥大細(xì)胞響應(yīng)機(jī)械刺激中的作用

3.1 整合素

整合素是跨膜異源二聚體，是細(xì)胞外基質(zhì)與細(xì)胞骨架的橋梁，是細(xì)胞內(nèi)外進(jìn)行信號(hào)交流的關(guān)鍵位點(diǎn)。α亞基的氨基端參與細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的黏附，β亞基的羧基端在細(xì)胞內(nèi)借助踝蛋白、α-輔肌動(dòng)蛋白等與肌動(dòng)蛋白纖維相連，形成整合素-細(xì)胞骨架復(fù)合物，并通過(guò)該復(fù)合物參與細(xì)胞骨架重排，介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[30]。肥大細(xì)胞表達(dá)α2β1、α3β1、α4β1、α5β1、αLβ2、αMβ2、αXβ2、αVβ2、α4β7等多種整合素蛋白，人與嚙齒類(lèi)動(dòng)物肥大細(xì)胞、以及不同部位肥大細(xì)胞表達(dá)的整合素不同[31]。具有炎性抑制性藥物如雷公藤紅素可以降低肥大細(xì)胞整合素的表達(dá)，達(dá)到抑制炎癥的作用[32]。

3.2 免疫球蛋白超家族

細(xì)胞間粘附分子(Intercellular Adhesion Molecule，ICAM)屬于免疫球蛋白超家族(Immunoglobulin Superfamily,IgSF)。此外有神經(jīng)細(xì)胞粘附分子(N-CAM)、血小板內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子(PE-CAM)、血管細(xì)胞粘附分子(V-CAM)。N-CAM&V-CAM介導(dǎo)非免疫細(xì)胞的粘附。肥大細(xì)胞表達(dá)ICAM-1、ICAM-2、LFA-2、LFA-3、c-kit[33]。肥大細(xì)胞釋放的促炎性因子TNF-α、IFN-γ、IL-6可使白血球和內(nèi)皮細(xì)胞粘附因子表達(dá)增加[34]。電針刺激大鼠“足三里”穴區(qū)，可使血管細(xì)胞間粘附因子表達(dá)增加[35]。這可能是由于肥大細(xì)胞釋放的物質(zhì)會(huì)引起皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞ICAM表達(dá)增加[36]，促進(jìn)肥大細(xì)胞前體在相關(guān)位置粘附。

3.3 選擇素

肥大細(xì)胞也表達(dá)選擇素-L(L-selectin)，在過(guò)敏反應(yīng)中，可通過(guò)注射L-selectin、ICAM-1或二者的單克隆抗體抑制肥大細(xì)胞的遷移聚集[29]。有研究表明，硫酸皮膚素(Dermatan sulfate,DS)可以通過(guò)L-選擇素和P-選擇素、趨化因子以及CD44的抑制，降低肥大細(xì)胞的脫顆粒率[37]。

4 細(xì)胞骨架在肥大細(xì)胞響應(yīng)機(jī)械刺激中的作用

4.1 肥大細(xì)胞脫顆粒中細(xì)胞骨架的變化

細(xì)胞骨架改變是肥大細(xì)胞脫顆粒的基礎(chǔ)。細(xì)胞骨架(微絲和微管)都會(huì)直接參與肥大細(xì)胞脫顆粒[38-39]。脫顆粒區(qū)域下，F(xiàn)-肌動(dòng)蛋白(F-actin)會(huì)消失[40]。參與IgE介導(dǎo)的肥大細(xì)胞活化的細(xì)胞骨架重排有兩種形式： 微絲解聚和微管聚合[41]。

4.2 微管

微管在體內(nèi)處于動(dòng)態(tài)平衡，微管的解聚與聚合受到微管蛋白異質(zhì)二聚體濃度、GTP分子濃度、溫度、pH值、鈣鎂離子以及相關(guān)蛋白濃度的調(diào)控。微管體外組裝與去組裝條件是： 在pH6.9，溫度37 ℃，沒(méi)有鈣離子，存在鎂離子，微管蛋白二聚體濃度達(dá)到1 mg/mL，GTP提供能量，微管可以自主裝； 當(dāng)溫度低于4 ℃或加入過(guò)量鈣離子，微管去組裝。此外相關(guān)的微管特異性藥物，如秋水仙堿(Colchicine)、長(zhǎng)春花新堿(Vinblastine)、諾考達(dá)唑(Nocodazole)能阻止微管結(jié)構(gòu)合成； 紫杉醇(Taxol)可以促進(jìn)微管裝配和保持穩(wěn)定。

有研究表明秋水仙堿、諾考達(dá)唑都能降低肥大細(xì)胞的脫顆粒率，相同的效果諾考達(dá)唑只需秋水仙堿十分之一的劑量[42]。小劑量秋水仙堿可以有效地控制痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎急性發(fā)作[43]。紫杉醇注射液可明顯促進(jìn)大鼠腹腔肥大細(xì)胞組胺的釋放，組胺的釋放與劑量成正比[44]。

4.3 微絲

細(xì)胞內(nèi)的微絲也處于動(dòng)態(tài)平衡，在體外存在鎂離子、高濃度鉀離子或鈉離子，富含ATP可以促進(jìn)肌動(dòng)蛋白組裝； 當(dāng)在高濃度鈣離子，低濃度鉀離子或鈉離子的條件下，微絲去組裝。細(xì)胞松弛素(Cytochalasin)，又稱(chēng)松胞菌素，可切斷微絲、阻止組裝。拉春庫(kù)林A(Latrunculin A)可以阻止G-actin聚集成F-actin。此外Mycalolide、Kabiramide C、Jaspisamide A、Swinholide A、Sphinxolides、Reidispongiolides都有抑制肌動(dòng)蛋白聚合形成微絲的能力[45]。維持微絲穩(wěn)定的藥物有： 鬼筆環(huán)肽(phalloidin)與F-肌動(dòng)蛋白(F-actin)強(qiáng)親和，可保持其穩(wěn)定，而不與G-肌動(dòng)蛋白單體結(jié)合，可用于F-肌動(dòng)蛋白熒光標(biāo)記。Amphidinolides抑制微絲的解聚，可以增強(qiáng)鬼筆環(huán)肽與F-肌動(dòng)蛋白的結(jié)合能力。

有研究表明[46]，肌動(dòng)蛋白纖維能夠傳遞和聚集外力從而激活MCs。汪麗娜等[47]使用細(xì)胞松弛素B斷裂細(xì)胞骨架后，發(fā)現(xiàn)激活張力激活性(stretch-activated,SA)離子通道所需的壓力降低。細(xì)胞松弛素B能增加包被補(bǔ)體的酵母多糖誘導(dǎo)的肥大細(xì)胞組胺的釋放[48]。拉春庫(kù)林、細(xì)胞松弛素D能增加肥大細(xì)胞受到刺激后脫顆粒率[49]。有研究發(fā)現(xiàn)[50]拉春庫(kù)林B、細(xì)胞松弛素D、Jasplakinolinde能降低過(guò)敏原刺激肥大細(xì)胞IFN-γ的基因表達(dá)水平。

5 總結(jié)與展望

肥大細(xì)胞作為免疫細(xì)胞在過(guò)敏反應(yīng)和炎性疾病中發(fā)揮重要作用已被人熟知，隨著研究的深入，新近關(guān)于肥大細(xì)胞在腦功能[51]、腫瘤轉(zhuǎn)移、組織纖維化[21]、針灸鎮(zhèn)痛、經(jīng)穴特異性等領(lǐng)域作用的研究，加深了對(duì)肥大細(xì)胞功能和響應(yīng)認(rèn)識(shí)。

本文從力學(xué)的視角回顧肥大細(xì)胞響應(yīng)機(jī)械刺激的有關(guān)文獻(xiàn)，明確細(xì)胞外基質(zhì)、粘附因子、細(xì)胞骨架對(duì)肥大細(xì)胞響應(yīng)機(jī)械刺激密切相關(guān)。破壞膠原纖維、纖連蛋白，降低肥大細(xì)胞粘附因子，促使微絲聚合和微管解聚，具有降低肥大細(xì)胞脫顆粒率的作用?？刂凭植垦軆?nèi)皮細(xì)胞粘附因子的表達(dá)，減少局部肥大細(xì)胞的遷移。通過(guò)以上力學(xué)視角，提供了控制肥大細(xì)胞響應(yīng)的方法和途徑，提示了控制或減輕由肥大細(xì)胞引起的過(guò)敏反應(yīng)治療藥物選擇思路。

針對(duì)宏觀病證的中國(guó)傳統(tǒng)中醫(yī)藥、針對(duì)微觀機(jī)理的西方醫(yī)藥以及新興的海洋生物制藥在肥大細(xì)胞響應(yīng)機(jī)械刺激的變化方面具有相似的效果，提示相關(guān)的比較研究可以加深對(duì)傳統(tǒng)中醫(yī)藥作用機(jī)理的認(rèn)識(shí)，為醫(yī)務(wù)工作者以及相關(guān)研究人員提供了更加廣闊的藥物選擇。

肥大細(xì)胞響應(yīng)機(jī)械刺激的研究，將有助于理解傳統(tǒng)中醫(yī)針灸(機(jī)械刺激)的作用機(jī)理，提升針灸的治療效果。針刺作用后，肥大細(xì)胞脫顆粒率升高，其釋放的物質(zhì)又可使穴區(qū)局部血管通透性增加，一定程度上揭示針刺效用機(jī)理。肥大細(xì)胞響應(yīng)機(jī)械刺激生理基礎(chǔ)，提示了針刺效果差異的微觀基礎(chǔ)。肥大細(xì)胞在疾病發(fā)生發(fā)展以及在針灸治療的過(guò)程中數(shù)量以及敏感性的變化，可以成為理解和認(rèn)識(shí)經(jīng)穴特異性、穴位敏化研究的一個(gè)出發(fā)點(diǎn)。穴位敏化處的肥大細(xì)胞是否發(fā)生數(shù)量和敏感性的變化，以及肥大細(xì)胞是否是穴位敏化的關(guān)鍵因素還需要進(jìn)一步研究進(jìn)行驗(yàn)證，對(duì)這些有趣領(lǐng)域的探索，將為最終揭示穴位經(jīng)絡(luò)之謎提供科學(xué)基礎(chǔ)。

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Physiological Basis of Mast Cells in Acupuncture Effects and Acupoint Sonsitization

GU Jintao1,2,YANG Hongwei1,2,SHEN Zhoufeng1,2,DING Guanghong1,2

1. Fudan University Shanghai Key Laboratory for Acupuncture Mechanism and Acupoint Function,Department of Aerospace(Shanghai,200433) 2. Shanghai Research Center for Acupuncture and Meridians(Shanghai,201203)

This article reviews the development of researches on mast cells in response to mechanical stimuli,and the high correlations of extracellular matrix (ECM),adhesion molecules and cytoskeleton with mast cells in response to mechanical stimulation have been found,providing clues for the mechanisms of mast cells in acupuncture effects and sensitized acupoint.

mast cell,acupoint sonsitization,mechanical stimuli,ECM,adhesion factor,cytoskeleton

10.3969/j.issn.1674-1242.2017.01.003

國(guó)家973項(xiàng)目(2012CB518502)； 國(guó)家自然科學(xué)基金(81574053、81473750)； 國(guó)家自然科學(xué)基金重大項(xiàng)目(81590953)；上海市針灸機(jī)制與穴位功能重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(14DZ2260500)

沈國(guó)鋒，13110290003@fudan.edu.cn

R245

A

1674-1242(2017)01-0013-06

2017-01-19)