天山云杉成熟與未成熟合子胚的胚性愈傷組織誘導(dǎo)及增殖研究

伊麗米努爾，李宏

(新疆林業(yè)科學(xué)院造林治沙研究所，烏魯木齊 830063)

天山云杉成熟與未成熟合子胚的胚性愈傷組織誘導(dǎo)及增殖研究

伊麗米努爾，李宏

(新疆林業(yè)科學(xué)院造林治沙研究所，烏魯木齊 830063)

【目的】研究天山云杉成熟與未成熟合子胚的胚性愈傷組織誘導(dǎo)及增殖條件技術(shù)，對(duì)該樹種的胚胎發(fā)生機(jī)理和建立相關(guān)的快繁技術(shù)體系奠定了基礎(chǔ)?！痉椒ā恳詭呷楹筒粠呷榈奈闯墒旌献优呒俺墒旌献优邽橥庵搀w，在不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度的DCR培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。對(duì)不同生長(zhǎng)時(shí)期合子胚的胚性愈傷組織誘導(dǎo)率和增殖量進(jìn)行研究?！窘Y(jié)果】(1)添加不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑(2,4-D、6-BA、TDZ)濃度組合的DCR培養(yǎng)基上誘導(dǎo)成熟合子胚時(shí)，20 μM 2,4-D和5 μM 6-BA為最佳組合濃度，胚性愈傷組織誘導(dǎo)率最高，為55%。(2)對(duì)不同采樣時(shí)間的三種合子胚胚性愈傷組織誘導(dǎo)率進(jìn)行分析表明，帶胚乳的未成熟合子胚(6月)為32.6%，成熟合子胚(9月)為60.6%，不帶胚乳的未成熟合子胚(7月)為83.1%，7月為天山云杉胚性愈傷組織誘導(dǎo)的最佳采摘期。(3)胚性愈傷組織在不同5種培養(yǎng)基上增殖培養(yǎng)表明，培養(yǎng)基之間增殖量差異顯著(P<0.05)。BM2和SH培養(yǎng)基的增殖效果明顯優(yōu)于MSG，1/2DCR，DCR，以SH的綜合增殖效果最好，其增殖量為4.55 g，增殖率為600%。(4)5種個(gè)體胚性愈傷組織在SH培養(yǎng)基上增殖培養(yǎng)表明，個(gè)體之間增殖量變化不明顯(P>0.05)?！窘Y(jié)論】建立了天山云杉胚性愈傷組織發(fā)生技術(shù)平臺(tái)，為天山云杉遺傳改良種質(zhì)創(chuàng)新、縮短育種周期奠定了研究基礎(chǔ)。

天山云杉；培養(yǎng)基；生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑；胚性愈傷組織

0 引 言

【研究意義】天山云杉(PiceaschrenkianaFisch. et Mey.)屬松科云杉屬，為中亞和亞洲中部山地特有種，在中國(guó)僅分布于天山，是新疆山區(qū)最重要的森林樹種之一，面積約52.84×104hm2，占全疆天然有林地總面積44.9%[1-2]，是新疆山地森林中分布最廣、蓄積量最大、經(jīng)營(yíng)活動(dòng)最多、用途最廣、材質(zhì)優(yōu)良的主要用材樹種，對(duì)天山的水源涵養(yǎng)、水土保護(hù)、林區(qū)生態(tài)系統(tǒng)的形成和維護(hù)發(fā)揮著不可替代的作用[3]。研究天山云杉胚性愈傷組織發(fā)生及增殖培養(yǎng)技術(shù)，對(duì)該樹種的胚胎發(fā)生機(jī)理和建立相關(guān)的快繁技術(shù)體系等具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】由于天山云杉分布區(qū)人類活動(dòng)頻繁及不合理的經(jīng)營(yíng)管理和林牧矛盾等因素造成天山云杉林生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)嚴(yán)重受損，導(dǎo)致了天山云杉林的衰退[4]。天然更新不良或天然更新困難等問題的出現(xiàn)已成為長(zhǎng)期困惑林業(yè)工作者的一大難題。云杉樹種生長(zhǎng)較慢，種子成熟率很低，繁殖和品種選育有很大困難[5]。從種子萌發(fā)到長(zhǎng)成可以移栽的小苗，又需經(jīng)過4～5a，所以通過自然繁殖進(jìn)行育種和選擇優(yōu)良基因型效率太低。采用嫁接、扦插等營(yíng)養(yǎng)繁殖的方法既消耗大量的時(shí)間和勞動(dòng)力，又受季節(jié)的限制。體細(xì)胞胚發(fā)生是指在離體條件下植物的體細(xì)胞通過與合子胚發(fā)生相類似的途徑發(fā)育成新個(gè)體的過程[6-8]。植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生不僅可作為其繁育的重要手段，而且也是研究胚胎發(fā)育過程的一種重要模式系統(tǒng)[9-11]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前天山云杉主要通過有性繁殖產(chǎn)生后代，無性繁殖一直受到各國(guó)林業(yè)決策部門的重視與林木育種工作者以及森林經(jīng)營(yíng)者的特別關(guān)注，尤其是現(xiàn)代生物技術(shù)的蓬勃發(fā)展，如植物組織培養(yǎng)及體細(xì)胞胚胎發(fā)生技術(shù)，具有繁殖效率高、周期短、不受自然條件制約、穩(wěn)定和選育優(yōu)良品種，對(duì)造林工程具有重大意義等特點(diǎn)[12-14]?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以帶胚乳和不帶胚乳的未成熟合子胚及成熟合子胚為外植體，研究天山云杉胚性愈傷組織誘導(dǎo)及增殖的完整發(fā)育過程，并對(duì)影響天山云杉胚性愈傷組織誘導(dǎo)的因素如種子采摘期和培養(yǎng)基及生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑等進(jìn)行研究，建立天山云杉胚性愈傷組織誘導(dǎo)和增殖的技術(shù)平臺(tái)，為天山云杉遺傳改良種質(zhì)創(chuàng)新、縮短育種周期奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

采樣地點(diǎn)為新疆烏魯木齊市水西溝。采樣時(shí)間為：分別于2013年6月26日采集天山云杉球果(帶胚乳的未成熟合子胚)、7月25日采集天山云杉球果(即不帶胚乳的未成熟合子胚)、9月10日采集成熟種子(即成熟合子胚)作為材料。

1.1.3 材料不同發(fā)育階段的合子胚的形態(tài)結(jié)構(gòu)

合子胚的不同發(fā)育期是培養(yǎng)物誘導(dǎo)的一個(gè)重要因素。圖1

a、b：成熟種子；c、d：成熟合子胚；e-g：未成熟球果；h-j：未成熟種子；k-l：未成熟合子胚；規(guī)格：1 mm(b，c，d，i，j)；100 μm (k,l)

a、b：mature seeds; c、d：mature zygotic embryos；e-g：immature cones；h-j：immature seeds；k-l：immature zygotic embryos；Standard: 1mm(b，c，d，i，j)；100 μm (k，l)

圖1 天山云杉種子及其成熟與未成熟合子胚
Fig.1 The seeds and mature and immature zygotic embryos ofP.schrenkiana

1.2 方 法

1.2.1 天山云杉胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基及制備

試驗(yàn)選用的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為DCR[15]培養(yǎng)基。制備時(shí)，每升添加30 000 mg蔗糖+不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度組合，pH值5.8±0.02，添加3 000 mg/L Gelrite(卡拉膠)為固化劑。在121℃，2×107Pa的壓力下進(jìn)行15 min高壓滅菌，高壓滅菌后，培養(yǎng)基溫度冷卻到60℃時(shí)，添加700 mg過濾滅菌的谷氨酰胺。6種誘導(dǎo)培養(yǎng)基篩選天山云杉胚性愈傷組織誘導(dǎo)的最佳生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度組合。以DCR1培養(yǎng)基作為對(duì)照。表1

表1 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度組合的DCR誘導(dǎo)培養(yǎng)基
Table 1 DCR induction medium with different growth regulator concentrations

DCR：培養(yǎng)基DCR：Medium生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑類型Differentgrowthregulator生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑比例GrowthregulatorratioDCR10μM2，4-D0μM6-BA0DCR210μM2，4-D5μM6-BA2：1DCR320μM2，4-D5μM6-BA4：1DCR420μM2，4-D10μM6-BA2：1DCR540μM2，4-D10μM6-BA4：1DCR620μM2，4-D10μMTDZ2：1

1.2.2 天山云杉胚性愈傷組織增殖培養(yǎng)基制備

采用DCR、1/2DCR、SH、BM2和MSG 5種不同的增殖培養(yǎng)基，5種培養(yǎng)基均添加生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑1.10 mg/L 2,4-D和0.44 mg/L 6-BA。

1.2.3 消毒與接種

1.2.3.1 種子

將種子用質(zhì)量百分濃度為0.2%的HgCl2溶液消毒5 min后，用無菌水沖洗3次，接種備用；在超凈工作臺(tái)上用消毒攝子和解刮刀縱裂種子，分離合子胚，將合子胚接種于各種培養(yǎng)基上，觀察胚性愈傷組織的誘導(dǎo)情況。

1.2.3.2 球果

將球果用質(zhì)量百分濃度為0.2%的HgCl2溶液消毒10 min后，用無菌水沖洗3次。在超凈工作臺(tái)上用消毒攝子和解刮刀從球果中剝?nèi)ノ闯墒旆N子，從側(cè)部劃開種殼，取出種仁，劃破內(nèi)種皮，挑開胚乳，將6月采集的未成熟合子胚同胚乳一起和7月采集的未成熟合子胚及9月的成熟合子胚接種于各種培養(yǎng)基上。

1.2.3.3 接種方法與條件

3種合子胚在每培養(yǎng)皿接種4個(gè)，重復(fù)15次，在溫度23～25℃下暗培養(yǎng)4～10周。

1.2.3.4 增殖繼代培養(yǎng)

每15～20 d增殖繼代一次。

1.2.3.5 增殖量

每皿增殖培養(yǎng)基上接種0.65 mg胚性愈傷組織(分成4塊接種到增殖培養(yǎng)基上)進(jìn)行培養(yǎng)，重復(fù)5次。胚性愈傷組織的增殖過程在溫度為(23±2)℃下暗培養(yǎng)與誘導(dǎo)階段相同，分別為0，7，14，21，28，35，42，49，56 d后稱增殖量，并統(tǒng)計(jì)胚性愈傷組織增殖情況。

1.2.3.6 指標(biāo)測(cè)定

污染率(%)=污染外植體數(shù)量/接種外植體總量×100%；

愈傷組織誘導(dǎo)率(%)=產(chǎn)生胚性愈傷組織的外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)×100%。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

用Excel 2003和prism 5.0 分析軟件進(jìn)行差異顯著性分析及多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種合子胚對(duì)胚性愈傷組織的誘導(dǎo)過程

不同發(fā)育階段的3種合子胚分別接種到DCR3培養(yǎng)基上誘導(dǎo)。分不同發(fā)育階段觀察記錄產(chǎn)生愈傷組織的數(shù)量、色澤和質(zhì)地，辨別其為胚性愈傷還是非胚性愈傷組織。研究表明，培養(yǎng)5個(gè)星期后合子胚開始形成愈傷組織(圖2c)，培養(yǎng)10個(gè)星期后生長(zhǎng)迅速的白色絲狀透明的胚性愈傷組織(圖2d，h，i)和堅(jiān)硬的顆粒狀黃褐色非愈傷組織(圖2n，o)，隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)后褐化死亡。一般愈傷組織分成2大類：胚性愈傷組織和非胚性愈傷組織。胚性愈傷組織通過發(fā)育可以分化，可以形成苗木。而非胚性愈傷組織不能分化，不能形成苗木。圖2

a-d：帶胚乳的未成熟合子胚(未完全形成合子胚)；a：接種第1 d；b：培養(yǎng)2個(gè)星期；c：5個(gè)星期后種胚開始形成愈傷組織；d，h，i：培養(yǎng)10個(gè)星期后生長(zhǎng)迅速的白色絲狀透明的胚性愈傷組織；e：分離合子胚后的胚乳；f：不帶胚乳的未成熟合子胚(合子胚胎發(fā)育階段I)；g：成熟合子胚(合子胚胎發(fā)育階段III)；j-m：顯微鏡放大后胚性愈傷組織；n，o：黃褐色非胚性愈傷組織；p：非胚性愈傷組織和胚性愈傷組織；E：胚發(fā)育階段I；S：胚根；比例尺：1 mm(a-i)；0.5mm (j, k, l, m)；3 mm (n-p)

a-d: immature zygotic embryos(ZE) without endosperm younger than Phase I; a: freshly prepared; b: after 2 Weeks of culture; c: after 5 weeks with beginning SE; d, h, i: after 10 weeks with advanced development of SE; e: open ZE with endosperm; f: isolated ZE Phase I; g: isolated ZE Phase III; j-m: Details of SE; n, o：callus formation in isolated ZE; p: Callus formation and SE; E: Phase I with embryo; S: Suspensor; Scale bar: 1 mm (a-i); 0,5 mm (j, k, l, m); 3 mm (n-p)

圖2 天山云杉胚性愈傷組織誘導(dǎo)的顯微下觀察
Fig.2 Observation Microscopy of induced somatic embryogenesis (SE) ofP.Schrenkiana

2.2 6種誘導(dǎo)培養(yǎng)基對(duì)成熟合子胚胚性愈傷組織誘導(dǎo)

天山云杉成熟合子胚在6種培養(yǎng)基上誘導(dǎo)培養(yǎng)。研究表明，在DCR6和DCR3培養(yǎng)基上誘導(dǎo)率較高，分別為45%和55%。在DCR5和DCR4培養(yǎng)基的誘導(dǎo)率較低，分別為35%、32.5%。在DCR2培養(yǎng)基上誘導(dǎo)率最小為18%。通過方差分析的結(jié)果表示，DCR6和DCR3比其他培養(yǎng)基之間差異顯著(P<0.05)。表現(xiàn)出生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度組合的優(yōu)勢(shì)。其他培養(yǎng)基之間的差異不顯著(P>0.05)。6種培養(yǎng)基誘導(dǎo)率的高低排序?yàn)镈CR3> DCR6> DCR5> DCR4> DCR2> DCR1。圖3

2.3 不同發(fā)育階段的合子胚在DCR3上的誘導(dǎo)

不同發(fā)育階段的3種合子胚分別在DCR3培養(yǎng)基上誘導(dǎo)培養(yǎng)。產(chǎn)生的胚性愈傷組織總數(shù)占接種外植體總數(shù)的百分率來表征天山云杉3種合子胚誘導(dǎo)胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率，研究表明，7月采集的合子胚誘導(dǎo)率最高為為83.1%，9月采集的合子胚誘導(dǎo)率為60.6%，6月采集的合子胚誘導(dǎo)率最底為32.6%；通過非胚性愈傷組織統(tǒng)計(jì)結(jié)果表示，6月采集的合子胚誘導(dǎo)率為10.6%、7月采集的合子胚誘導(dǎo)率為6.8%和9月采集的合子胚誘導(dǎo)率為40%。誘導(dǎo)過程中每天統(tǒng)計(jì)污染率表明，9月10日采集的合子胚污染率最高，達(dá)36.5%，其他2種合子胚的污染率為5%。表3

對(duì)胚性愈傷組織誘導(dǎo)率進(jìn)行方差分析，結(jié)果表示，不同發(fā)育階段的合子胚對(duì)胚性愈傷組織的誘導(dǎo)呈顯著性差異 (P<0.05)。7月采集誘導(dǎo)胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率高、非胚性愈傷組織率低、質(zhì)量好、污染少、增殖力強(qiáng)比其他2種合子胚。

2.4 增殖培養(yǎng)基對(duì)胚性愈傷組織增殖

將胚性愈傷組織接種于5種不同培養(yǎng)基上增殖培養(yǎng)，研究表明，5種培養(yǎng)基其增殖量與增殖率表現(xiàn)出不一樣的變化，試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果表示，BM2和SH培養(yǎng)基的增殖量高于其他培養(yǎng)基，分別為5.74 g和為4.55 g，增殖率達(dá)到782.7%和600%。其他3種培養(yǎng)基(MSG、DCR、1/2DCR)的增殖率低，分別為3.41 g、2.69 g、2.61 g，增殖率達(dá)到424.4%、313.2%、301.5%。通過原始統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析、顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果表示，BM2和SH培養(yǎng)基的增殖量顯著差異(P<0.05)。其他3種培養(yǎng)基之間無顯著差異(P>0.05)。增殖量的高低排序?yàn)锽M>SH>MSG>DCR>1/2DCR。BM2和SH培養(yǎng)基的增殖效果明顯優(yōu)于其他3個(gè)培養(yǎng)基。雖然BM2培養(yǎng)基的增殖效果最好，但其繼代一次后褐化現(xiàn)象嚴(yán)重。SH培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)后能夠保持較好的胚性，褐化現(xiàn)象較少。在SH培養(yǎng)基中谷氨酰胺含量比BM培養(yǎng)基的一半，谷氨酰胺是一種特殊的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，可能影響SH培養(yǎng)基的增殖率。圖4

注：相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同字母表示差異顯著(P<0.05)

Note: same letter indicate no significant difference(P>0.05), difference letter indicate significant difference(P<0.05)

圖3 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度組合下天山云杉胚性愈傷組織誘導(dǎo)率變化
Fig.3 Effects of different combinations of growth regulator concentrations on the induction rate of somatic embryogenesis ofP.Schrenkiana
表3 天山云杉種子(含球果)不同采種期的合子胚誘導(dǎo)產(chǎn)生胚性愈傷組織狀況
Table 3 Induction of SE inP.schrenkianawith different collection time

采集日期AcquisitionDate接種數(shù)(個(gè))Numberofvaccination污染死亡數(shù)(個(gè))Pollutiondeaths剩余數(shù)(個(gè))Remaininggrains污染死亡率(%)Pollutionmortality無反應(yīng)數(shù)(個(gè))Numberofnoreactions非胚性愈傷數(shù)(個(gè))Non-embryogenicnumber胚性愈傷數(shù)(個(gè))Embryogenicnumber胚性愈傷組織誘導(dǎo)率(%)Embryogeniccallusinductionrate201362620010190510820623262013725200101905191315883120139102007312236506067530

2.5 不同天山云杉個(gè)體胚性愈傷組織在增殖培養(yǎng)基上增殖變化

選取了5個(gè)天山云杉個(gè)體胚性愈傷組織(T6，T7，T36，T43，T48)，接種在SH培養(yǎng)基上觀察增殖情況(圖5B)。研究表明，5種不同個(gè)體胚性愈傷組織增殖量變化不明顯(圖5A)，5種個(gè)體的增殖量分別為4.63 g、4.56 g、4.50 g、4.11 g、4.09 g。高低排序?yàn)門6>T36>T48>T43>T7。通過方差分析結(jié)果表示，各個(gè)體之間增殖量無顯著性差異(P>0.05)。圖5

注：相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同字母表示差異顯著(P<0.05)

Note: same letter indicate no significant difference(P>0.05), difference letter indicate significant difference(P<0.05)

圖4 誘導(dǎo)天山云杉胚性愈傷組織增殖的最適培養(yǎng)基選擇
Fig.4 Selection of the optimum medium for inducing somatic embryogenesis proliferation ofP.schrenkiana

注：圖5B中：a、b：增殖培養(yǎng)基的胚性愈傷組織；c：胚性胚柄團(tuán)的顯微結(jié)構(gòu)觀察；d：胚性愈傷組織的顯微結(jié)構(gòu)觀察, 比例尺：10 mm(a，b)；100 μm (g，d)

Note:
Fig. 5B: a，b: somatic embryogenesis Proliferation medium; c: microstructure of embryonic suspensor group; d: microstructure of somatic embryogenesis, Scale bar: 10 mm (a, b); 100 μm (g, d)

圖5 不同基因型胚性愈傷組織在SH培養(yǎng)基上的增殖情況
Fig.5 Proliferation of different somatic embryogenesis in SH

3 討 論

植物體胚發(fā)生是植物界普遍存在的一種現(xiàn)象，在快速繁殖、人工種子、種質(zhì)資源保存、突變體的誘變和篩選、植物基因工程等許多方面有廣闊的應(yīng)用前景和巨大的潛在經(jīng)濟(jì)價(jià)值[16-18]。自從1958年在胡蘿卜組織培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)了一種與胚相似的結(jié)構(gòu)以來，目前能離體再生的植物達(dá)1 000多種，并有逐年上升的趨勢(shì)，說明在植物界體細(xì)胞胚胎發(fā)生是一種較為普遍的現(xiàn)象[19]。通過體細(xì)胞胚胎發(fā)育途徑實(shí)現(xiàn)植株再生不僅可以解決無性繁殖的問題，對(duì)于生物技術(shù)在云杉屬中的具體應(yīng)用及其樹種的品質(zhì)改良也具有十分重要的意義。在天山云杉體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程中，經(jīng)由組織培養(yǎng)方法誘導(dǎo)愈傷組織，并由愈傷組織獲得體細(xì)胞胚胎，是目前人工種子研究和生物技術(shù)中廣泛應(yīng)用的手段之一[20-22]。

不同濃度的2,4-D、6-BA和TDZ組合對(duì)誘導(dǎo)胚發(fā)生愈傷組織的效率也不同[23]，因此，確定天山云杉胚性愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度至關(guān)重要。添加不同濃度的2,4-D和6-BA或TDZ的DCR培養(yǎng)基上誘導(dǎo)成熟合子胚時(shí)，20 μM 2,4-D 和5 μM 6-BA為最佳生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度組合，胚性愈傷組織誘導(dǎo)率最高，達(dá)到55%。這與孫敬爽等[24]研究的北美藍(lán)云杉體細(xì)胞胚胎發(fā)生的生長(zhǎng)素濃度相比濃度較低，進(jìn)一步說明不同種類的云杉體細(xì)胞胚胎發(fā)育的需要的生長(zhǎng)素濃度不同。不同發(fā)育階段的3種合子胚分別在DCR3(20 μM 2,4-D和5μM 6-BA)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)培養(yǎng)表明，帶胚乳的未成熟合子胚(6月26日)為32.6%，成熟合子胚(9月10日)為60.6%，不帶胚乳的未成熟合子胚(7月25日)為83.1%。不同發(fā)育階段的合子胚對(duì)胚性愈傷組織的誘導(dǎo)呈顯著性差異，6月采集的合子胚在誘導(dǎo)過程中，54%的合子胚沒有反應(yīng)，誘導(dǎo)率低于7月采集的合子胚。而9月采集的合子胚污染率和非胚性愈傷組織率高，分別為36.5%和30%，誘導(dǎo)率低于7月采集的合子胚。7月采集的合子胚污染率低，誘導(dǎo)率高，增殖力強(qiáng)，胚性愈傷組織誘導(dǎo)的最佳采摘期。這與Carneros[25]，等得到的結(jié)論一致。為今后體細(xì)胞胚胎發(fā)育研究奠定了基礎(chǔ)。通過天山云杉種子成熟的不同發(fā)育階段(帶胚乳的未成熟合子胚，不帶胚乳的未成熟合子胚，成熟合子胚)的胚性愈傷組織的誘導(dǎo)是完全可能的；天山云杉胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率的高低與種子采摘時(shí)間密切相關(guān)。

供試的5種培養(yǎng)基對(duì)胚性愈傷組織的增殖效果不同，BM2和SH培養(yǎng)基的增殖效果明顯優(yōu)于MSG，1/2DCR，DCR。其中BM2培養(yǎng)基的胚性愈傷組織增殖效果最為明顯，其增質(zhì)量達(dá)到5.74 g，但BM2增殖的胚性愈傷組織增殖效果最好，但其繼代一次后易褐化。不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基上的不同胚性愈傷組織的增長(zhǎng)量表明，BM2增殖培養(yǎng)基上的不同胚性愈傷組織的增殖量最高，其次是SH培養(yǎng)基，愈傷組織增殖量為4.55 g，增殖率達(dá)到600%。由于以SH為基本培養(yǎng)基進(jìn)行增殖培養(yǎng)的胚性愈傷組織在繼代培養(yǎng)后能夠較好的保持胚性，且繼代后褐化現(xiàn)象較少。獲得良好增殖的胚性愈傷組織，外觀顏色呈現(xiàn)淡黃色，增殖培養(yǎng)1～2個(gè)月后，有的愈傷組織會(huì)出現(xiàn)一些褐變，因此，為提高胚性愈傷的增殖倍數(shù)，如何延長(zhǎng)增殖培養(yǎng)時(shí)間以及如何促進(jìn)和提高增殖培養(yǎng)的倍數(shù)，則是其后的研究需要進(jìn)一步深入的研究課題。這與Klimaszewska[26]等研究結(jié)論一致。

研究對(duì)影響天山云杉胚性愈傷組織誘導(dǎo)的因素如種子采種期、培養(yǎng)基和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑等進(jìn)行探討，并建立了天山云杉胚性愈傷組織發(fā)生技術(shù)平臺(tái)。天山云杉胚性愈傷組織的誘導(dǎo)與增殖的可行性，為研究天山云杉遺傳改良種質(zhì)創(chuàng)新和縮短育種周期奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

4.1 以天山云杉成熟合子胚誘導(dǎo)胚性愈傷組織，DCR作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加20 μM 2,4-D和5 μM 6-BA(4:1)為最佳培養(yǎng)基，胚性愈傷組織誘導(dǎo)率最高，達(dá)到55%。

4.2 3種不同發(fā)育階段的合子胚在DCR3培養(yǎng)基中，7月25日采集的未成熟合子胚的誘導(dǎo)率最高，達(dá)到83.1%，為胚性愈傷組織誘導(dǎo)的最佳外植體。

4.3 在BM2、SH、MSG、1/2DCR、DCR 5種培養(yǎng)基中，SH是增殖胚性愈傷組織的綜合增殖效果最佳，增殖量從0.65 mg提高到4.55 g，增殖率為600%。

4.4 不同個(gè)體胚性愈傷組織在SH培養(yǎng)基上增殖培養(yǎng)，表明個(gè)體之間增殖量變化不明顯。

References)

[1] 王燕, 趙士洞. 天山云杉林生物量和生產(chǎn)力的研究[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào), 1999,10(4):389-391.

WANG Yan, ZHAO Shi-dong. (1999). Biomass and net productivity of Picea schrenkiana var. tianshanica forest [J].ChineseJournalofAppliedEcology, 10(4):389-391. (in Chinese)

[2] 羅明, 龐峻峰, 李敘勇, 等. 新疆天山云杉林區(qū)森林土壤微生物學(xué)特性及酶活性[J]. 生態(tài)學(xué)雜志, 1997,16(1):26-30.

LUO Ming, PANG Jun-feng, LI Xu-yong, et al. (1997). Microbiological Characteristics and Enzymes Activity of the Forest Soil in Picea schrenkiana var. tianshanican in Xinjiang [J].ChineseJournalofEcology, 16(1):26-30. (in Chinese)

[3] 宋于洋, 趙自玉, 楊振安, 等. 天山云杉種群數(shù)量動(dòng)態(tài)研究[J]. 南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版, 2009,33(1):64-68.

SONG Yu-yang, ZHAO Zi-yu, YANG Zhen-an, et al. (2009). Population quantity and structure dynamics of plant population ofPiceaschrenkiana[J].JournalofNanjingForestryUniversity, 33(1):64-68. (in Chinese)

[4] 張毓?jié)? 白志強(qiáng). 新疆天山云杉森林生態(tài)系統(tǒng)定位研究的初步設(shè)想[J]. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué), 2003,40(4):224-226.

ZHANG Yu-tao, BAI Zhi-qiang. (2003). Initial ideas Xinjiang Tianshan Spruce Forest Ecosystem Research [J].AgriculturalSciences, 40(4):224-226. (in Chinese)

[5] 劉萍, 張震, 劉雙成. 天山云杉林凋落物組成及營(yíng)養(yǎng)成分研究[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2014,(3):114-116.

LIU Ping, ZHANG Zhen, LIU Shuang-cheng, et al. (2014). Compositions and nutrients in the forest litter of Picea Schrenkiana [J].JournalofSouthChinaAgriculturalUniversity, (3):114-116. (in Chinese)

[6] 白玉娥，曾超，彭鵬，等. 沙地云杉胚性愈傷組織誘導(dǎo)[J]. 分子植物育種, 2015,(6):1 363-1 368.

BAI Yu-e, ZENG Chao, PENG Peng, et al. (2015). Factors Influencing the Initiation of Embryogenic Callus inPiceamongolica[J].MolecularPlantBreeding, (6):1,363-1,368. (in Chinese)

[7] 潘曉, 徐春香, 陳厚彬. 植物體細(xì)胞胚發(fā)生的研究進(jìn)展[J]. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2009,(10):103-107.

PAN Xiao, XU Chun-xiang, CHEN Hou-bin. (2009). Research Advances in Plant Somatic Embryogenesis [J].ActaAgriculturaeJiangxi, (10):103-107. (in Chinese)

[8] 閆紅舟. 植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生的研究進(jìn)展[J]. 河北農(nóng)業(yè)科學(xué), 2008,12(3):4-5.

YAN Hong-zhou. (2008), Research Advances in Plant Somatic Embryogenesis [J].JournalofHebeiAgriculturalSciences, 12(3):4-5. (in Chinese)

[9] 楊摸華，張冬林，李志輝，等，馬尾松幼胚體細(xì)胞胚胎發(fā)生研究[J]. 植物生理學(xué)報(bào)，2011，47(9):904-912.

YANG Mo-hua, ZHANG Dong-lin, LI Zhi-hui, et al. (2011). Somatic Embryogenesis with Immature Embryos of Masson Pine (PinusmassonianaLamb.) [J].PlantPhysiologyJournal, 47(9):904-912. (in Chinese)

[10] Arnold, S. V., Sabala, I., Bozhkov, P., Dyachok, J., & Filonova, L. (2002). Developmental pathways of somatic embryogenesis.PlantCell,TissueandOrganCulture(PCTOC) , 69(3):233-249.

[11] Stasolla, C., & Yeung, E. C. (2003). Recent advances in conifer somatic embryogenesis: improving somatic embryo quality.PlantCell,TissueandOrganCulture(PCTOC) , 74(1):15-35.

[12] 袁玉江, ESPER, Jan. 新疆天山西部三個(gè)云杉上樹線樹輪最大密度年表的研制、相關(guān)性及其氣候信號(hào)分析[J]. 干旱區(qū)地理, 2008, 31(4):560-566.

YUAN Y J, ESPER, Jan. (2008). Development, correlation and climate signal analysis of three spruce chronologies of tree-ring maximum density from upper tree line in the western Tianshan Mountains of Xinjiang [J].AridLandGeography, 31(4):560-566. (in Chinese)

[13] 陳志穎，阮曉，張玉竹，等. 3,4-二羥基苯乙酮脅迫對(duì)天山云杉種子萌發(fā)過程中內(nèi)源植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑含量變化的影響[J]. 植物生態(tài)學(xué)報(bào), 2013,37(12):1 114-1 122.

CHEN Zhi-ying, RUAN Xiao, ZHANG Yu-zhu, et al. (2013). Effects of 3,4-dihydroxy acetop Henone stress on changes in the content of endogenous plant hormones during seed germination inPiceaschrenkianassp.tianschanica[J].ChineseJournalofPlantEcology, 37(12): 1,114-1,122. (in Chinese)

[14] Ishii, Y., Takamura, T., Goi, M., & Tanaka, M. (1998). Callus induction and somatic embryogenesis of phalaenopsis. Plant Cell Reports, 17(6):446-450.

[15] Gupta, P. K., & Durzan, D. J. (1985). Shoot multiplication from mature trees of douglas-fir (pseudotsuga menziesii) and sugar pine (pinus lambertiana).PlantCellReports, 4(4):177-179.

[16] 張海峰. 雜種落葉松胚性愈傷組織誘導(dǎo)的研究[J]. 林業(yè)科技, 2016, 41(2):9-12.

ZHANG Hai-feng. (2016). Study on the Induction of Embryogenic Callus of Hybrid Larchs [J].ForestryScienceandTechnology, 41(2):9-12. (in Chinese)

[17] Fowke, L., & Hakman, I. (1991). Somatic embryogenesis in conifers.CanadianJournalofBotany, 69(69):1,873-1,899.

[18] Li, X., Krasnyanski, S. F., & Korban, S. S. (2002). Somatic embryogenesis, secondary somatic embryogenesis, and shoot organogenesis in rosa.JournalofPlantPhysiology, 159(3):313-319.

[19] 汪小雄, 盧龍斗, 郝懷慶, 等. 松杉類植物體細(xì)胞胚發(fā)育機(jī)理的研究進(jìn)展[J]. 西北植物學(xué)報(bào), 2006, 26(9): 1 965-1 972.

WANG Xiao-xiong, LU Long-dou, HAO Huai-qing, et al. (2006). Research Advances about Developmental Mechanism of Somatic Embryos in Conifers [J].ActaBotanicaBoreali-OccidentaliaSinica, 26(9):1,965-1,972. (in Chinese)

[20] 楊金玲, 桂耀林, 郭仲琛. 云杉屬樹種的體細(xì)胞胚胎發(fā)生[J]. 植物學(xué)報(bào), 1999,(1):59-66.

YANG Jin-ling, GUI Yao-lin, GUO Zhong-chen. (1999). Somatic embryogenesis of picea species [J].ChineseBulletinofBotany, (1):59-66. (in Chinese)

[21] 陳芳，陳少瑜，吳濤，等. 麗江云杉體細(xì)胞胚胎發(fā)生[J]. 林業(yè)科學(xué), 2010,46(8):162-167.

CHEN Fan, CHEN Shao-yu, WU Tao, et al. (2010). Somatic Embryogenesis ofPicealikiangensis[J].ScientiaSilvaeSinicae, 46(8):162-167. (in Chinese)

[22] 宋躍, 張含國(guó), 李淑娟, 等. 落葉松胚性愈傷組織誘導(dǎo)與未成熟胚形態(tài)的關(guān)系[J]. 東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2016, 44(4): 25-30.

SONG Yao, ZHANG Han-guo, LI Shu-juan, et al. (2016). Relationship between the Induction of Embryogenic Callus of Larch and the Morphology of Immature Embryos [J].JournalofNortheastForestryUniversity, 44(4):25-30. (in Chinese)

[23] 黃健秋, 衛(wèi)志明. 針葉樹體鈿胞胚胎發(fā)生的研究進(jìn)展[J]. 植物生理學(xué)通訊, 1995, 31(2): 85-90.

HUANG Jian-qiu, WEI Zhi-ming. (1995). Review on somatic embryogenesis of coniferous tree [J].PlantPhysiologyJournal, 31(2): 85--90. (in Chinese)

[24] 孫敬爽, 賈桂霞. 北美藍(lán)云杉體細(xì)胞胚發(fā)生技術(shù)研究[J]. 北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2010, 32(1): 44-51.

SUN Jing-shuang, JIA Gui-xia. (2010). Somatic embryogenesis of Picea pungens Engelmann [J].JournalofBeijingForestryUniversity, 32(1):44-51. (in Chinese)

[25] Carneros, E., Celestino, C., Klimaszewska, K., Park, Y. S., Toribio, M., & Bonga, J. M. (2009). Plant regeneration in stone pine (pinus pinea l.) by somatic embryogenesis.PlantCell,TissueandOrganCulture(PCTOC) , 98(2):165-178.

[26] Klimaszewska, K., Trontin J-F, T., Becward, M. R., Devillard, C., Y.-S, P., & M.-A, L. W. (2007). Recent progress in somatic embryogenesis of four pinus spp.TreeandForestryScienceandBiotechnology, (1):11-25.

Supported by:Supported by Natural Science Fund of Xinjiang Uygur Autonomous Region"Related research on the somatic embryogenesis of Picea schrenkiana"(2013211A036)

Study on the Induction and Proliferation of Somatic Embryogenesis from the Mature and Immature Zygote Embryos ofPiceaschrenkiana

Yiliminuer，LI Hong,

(ResearchInstituteofAfforestationandDesertificationPreventionandControl,XinjiangAcademyofForestrySciences，Urumqi830063,China)

【Objective】 To study the induction and proliferation of somatic embryogenesis from the mature and immature zygote embryos ofPiceaschrenkiana, which might have great significance for the understanding of the mechanism of embryonic development and the establishment of rapid propagation system.【Method】Immature embryo and mature embryo were used as explants to induce culture in DCR medium with different growth regulator concentrations. The induction rates of zygotic embryos in different growth stages and its proliferation were studied using immature zygotic embryos with endosperm, immature zygotic embryos without endosperm and mature embryos as explants.【Result】(1) When DCR medium added with different concentrations of 2,4-D and 6-BA was used to induce mature zygotic embryos, the combination of 20 μM 2,4-D and 5 μM 6-BA was the best and somatic embryogenesis induction rate was the highest, up to 55%. (2) The induction rate of three zygotic embryos of somatic embryogenesis collected in different periods showed that the immature zygotic embryos with endosperm (June) was up to 32.6%, the mature zygotic embryos (September) was up to 60.6%, Immature embryo without endosperm (July) was 83.1%, which indicated that July was the best picking period ofP.schrenkianacones. (3) The somatic embryogenesis in the five different proliferation medium showed the the proliferation rate was significant (P< 0.05). The proliferation results of somatic embryogenesis in different proliferation medium showed that the effect of BM2 and SH were better than the MSG, 1/2DCR, DCR, and the comprehensive proliferation effect of SH was the best. The proliferation rate was 4.55 g and the rate was up 600%.) (4) The five different somatic embryogenesis in SH proliferation medium showed that the difference between somatic embryogenesis was not significant (P> 0.05).【Conclusion】This study has established the somatic embryogenesis technology platform ofP.schrenkianafor the first time, which has provided a scientific basis for the genetic improvement of germplasm and shortened the breeding cycle ofP.Schrenkiana.

Piceaschrenkiana; culture media; plant growth regulator; somatic embryogenesis

10.6048/j.issn.1001-4330.2017.02.008

2016-11-23

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金項(xiàng)目“天山云杉體細(xì)胞胚胎發(fā)育的相關(guān)研究”(2013211A036)

伊麗米努爾(1964-)，女，塔城人，副研究員，博士，研究方向?yàn)槟婢成砩鷳B(tài)、良種選育等，(E-mail)1045230278@qq.com

李宏(1962-)，男，伊犁人，研究員，博士，研究方向?yàn)樯峙嘤龋?E-mail)1900284827@qq.com

S791.18

A

1001-4330(2017)02-0262-10