玉米赤霉烯酮生物降解研究進(jìn)展

史 競(jìng) 汪 洋 鞠 星 賓石玉 張曉琳

（廣西師范大學(xué)1，桂林 541004）

（國(guó)家糧食局科學(xué)研究院2，北京 100037）

自1961年英國(guó)科學(xué)家分離到了第一種真菌毒素——黃曲霉毒素以來，真菌毒素危害所造成的損失已引起人們的高度重視［1］。據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織估算，全球每年約有25%的農(nóng)產(chǎn)品受到真菌毒素的污染，2%的農(nóng)產(chǎn)品因污染嚴(yán)重而失去營(yíng)養(yǎng)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，造成數(shù)百億美元的經(jīng)濟(jì)損失［2］。玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）又稱F－2毒素，是世界上污染范圍最廣的一種鐮刀菌毒素，在歐洲、非洲、亞洲、北美洲、南美洲以及大洋洲等世界各地的谷物以及農(nóng)副產(chǎn)品中都檢測(cè)到ZEN的存在［3］。

目前降解真菌毒素的方法主要包括：物理法、化學(xué)法以及生物法。傳統(tǒng)的物理和化學(xué)方法雖然能部分清除真菌毒素，但是這些方法具有破壞營(yíng)養(yǎng)、去毒不徹底及成本高等缺陷，實(shí)際應(yīng)用具有一定的局限性［4］。而生物學(xué)方法具有反應(yīng)條件溫和、無化學(xué)試劑殘留等優(yōu)點(diǎn)，日益被科學(xué)界所關(guān)注［5］。

1 玉米赤霉烯酮結(jié)構(gòu)及生物毒性

玉米赤霉烯酮是由禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）、黃色鐮刀菌（Fusarium culmorum）、克地鐮刀菌（Fusarium crookwellense）等多種鐮刀菌產(chǎn)生并釋放到環(huán)境中的真菌毒素［6］。1962年Stob從感染了禾谷鐮刀菌的玉米中首次分離到玉米赤霉烯酮。1966年Urry用經(jīng)典化學(xué)［7］、核磁共振和質(zhì)譜技術(shù)確定了玉米赤霉烯酮的化學(xué)結(jié)構(gòu)并正式確定其化學(xué)名稱為：6－（10－羥基－6－氧代－反式－1－十－碳烯）－β－雷鎖酸－內(nèi)酯。分子式為C18H22O5，白色晶體，不溶于水。分子結(jié)構(gòu)式如下：

圖1 玉米赤霉烯酮的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

在對(duì)小鼠、大鼠和豚鼠的急性毒性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ZEN的急性毒性相對(duì)較低（LD50＞2 000～20 000 mg／kg b.w.）［8］。ZEN的毒性主要表現(xiàn)為慢性毒性，包括對(duì)生殖系統(tǒng)的毒性以及基因毒性和內(nèi)分泌系統(tǒng)的影響。ZEN在1～3 mg／kg時(shí)即能刺激雌激素受體轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致繁殖障礙［9］；有研究表明在懷孕期間攝入ZEN過量會(huì)降低胚胎存活率［10］。若懷孕母豬食用一定量的ZEN則會(huì)出現(xiàn)流產(chǎn)，嚴(yán)重會(huì)產(chǎn)生畸形胎、死胎。ZEN攝入后會(huì)減少黃體生成素（LH）、孕激素分泌和子宮組織形態(tài)的改變，這些變化可能會(huì)影響子宮的功能［11］。

2 玉米赤霉烯酮生物降解研究

由于玉米赤霉烯酮的毒性，2002年世界衛(wèi)生組織（WHO）和聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織（FAO）已經(jīng)將解決ZEN毒性作為全世界的當(dāng)務(wù)之急［12］。已有研究指出一些高溫、輻照、吸附作用及氧化劑處理已污染的作物能有效減少ZEN濃度，但這些物理、化學(xué)方法的最大不足之處是：去毒效果有限，并可能造成重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)丟失，容易造成二次污染，并且成本較高［13］，所以生物方法逐漸成為脫毒研究的重點(diǎn)。

早在20世紀(jì)80年代El－Sharkawy和Abul－Hajj發(fā)表了一系列關(guān)于真菌和放線菌轉(zhuǎn)化ZEN的重要文章。他們?cè)谖恼轮忻枋隽朔种χ槊梗═hamnidium elegans）和班尼毛霉（Mucor bainieri）可將 ZEN轉(zhuǎn)化為一種無雌激素效應(yīng)的產(chǎn)物：ZEN－4－O－βglucoside［14］。另外由龜裂鏈霉菌（Streptomyces rimosus）和班尼小克銀漢霉（Cunninghamella bainieri）轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物 8＇－h(huán)ydroxy－zearalenone和 2，4－dimethoxyzearalenone都未表現(xiàn)出雌激素毒性［15］。最值得注意的是，他們從150種真菌中篩選出了一株粉紅黏帚霉（Gliocladium roseum，異名：粉紅螺旋聚孢霉：Clonostachys rosea）NRRL 1859能將ZEN降解成一種雌激素作用遠(yuǎn)小于ZEN的降解產(chǎn)物。

Kakeya等［16］和 Takahashi等［17］篩選到了一株粉紅螺旋聚孢霉（Clonostachys rosea）IFO7063可以將ZEN完全轉(zhuǎn)化為沒有雌激素活性的代謝產(chǎn)物，并依據(jù)降解酶氨基酸序列設(shè)計(jì)引物克隆了降解酶基因zhd101。Utermark等［18］利用插入失活試驗(yàn)證明了zhd101編碼的堿性乳糖水解酶ZHD101是降解ZEN的功能性蛋白質(zhì)。Takahashi等［19－20］進(jìn)一步將zhd101轉(zhuǎn)化釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），在早期研究發(fā)現(xiàn)：雖然含有zhd101基因的重組酵母能夠消除液體培養(yǎng)基中2μg／mL的ZEN，但將ZEN轉(zhuǎn)化成一部分β－ZOL（β－玉米赤霉烯醇，與α－ZOL一樣同為ZEN的衍生物）保留在培養(yǎng)基中。在之后的研究中他們利用含有酵母偏愛密碼子的zhd101基因轉(zhuǎn)化酵母，使該基因表達(dá)水平增加大約20倍，結(jié)果表明：含有酵母偏愛密碼子的zhd101轉(zhuǎn)基因酵母能完全降解培養(yǎng)基中2μg／mL的ZEN，并沒有任何β－ZEN積累。研究還發(fā)現(xiàn)ZHD101蛋白能夠降解ZEN、α和β－ZOL，但是降解效率不同。他們還將zhd101與增強(qiáng)綠色熒光蛋白基因（egfp）融合，形成egfp：：zhd101，實(shí)驗(yàn)證明egfp：：zhd101表達(dá)產(chǎn)物 EGFP：：ZHD101與 ZHD101酶特性相近［19］。具有熒光的融合蛋白EGFP：：ZHD101的成功表達(dá)，為后期的轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)奠定了基礎(chǔ)。

另有一些國(guó)外報(bào)道也發(fā)現(xiàn)了一些對(duì)玉米赤霉烯酮有轉(zhuǎn)化、降解作用的細(xì)菌和真菌。Abdulla等［21］報(bào)道，惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）能完全降解玉米赤霉烯酮，研究發(fā)現(xiàn)編碼ZEN降解酶的基因位于質(zhì)粒pZEA－1上，這個(gè)ZEN降解酶的最適pH和溫度分別為 pH 7～8和30～37℃。Molna等［22］發(fā)現(xiàn)，解毒毛孢酵母（Trichosporon mycotoxinivorans）能成功地將1 mg／L ZEN降解成CO2或無熒光、無紫外吸收的物質(zhì)，且代謝物中沒有檢測(cè)到α－ZOL、β－ZOL的存在。Varga等［23］報(bào)道了一些根霉菌（Rhizopus stolonifer，Rhizopus oryzae，Rhizopus microsporus）也能降解玉米赤霉烯酮。

國(guó)內(nèi)近幾年在玉米赤霉烯酮降解菌株篩選和基因克隆方面也取得了一些研究進(jìn)展。中南大學(xué)分離獲得了一株藤黃微球菌，發(fā)現(xiàn)該菌在含有0.05 mol／L MnCl2、初始 pH為 7.0的 LB培養(yǎng)基中，37℃，180 r／min，連續(xù)培養(yǎng)120 h，能降解99%的ZEN毒素（ZEN初始濃度為 2μg／mL）［24］。程波財(cái)?shù)龋?5］從粉紅螺旋聚孢霉中克隆到與zhd 101高度同源的基因ZEN－jjm，并進(jìn)行原核表達(dá)得到ZEN降解酶。劉海燕等［26］從粉紅黏帚霉中獲得了與zhd101有11個(gè)堿基差異的基因zlhy－6，并在畢赤酵母中成功表達(dá)，HPLC檢測(cè)經(jīng)由zlhy－6基因表達(dá)的降解酶處理ZEN后沒有殘留，證明該降解酶對(duì)ZEN具有良好的降解能力。Yu等［27－29］報(bào)道了一種不動(dòng)桿菌（Acinetobacter sp．）產(chǎn)生的胞外抗氧化酶可以降解ZEN，并克隆了這個(gè)酶的基因，研究發(fā)現(xiàn)，這種酶的最適pH和溫度分別為pH 9.0和70℃。

3玉米赤霉烯酮降解基因的應(yīng)用

目前為止，已被克隆的ZEN降解酶基因不多，zhd101作為研究最多的一個(gè)降解酶基因被應(yīng)用于植物轉(zhuǎn)基因，分別成功轉(zhuǎn)化了水稻和玉米。

Takahashi等［19］報(bào)道將egfp：：zhd101基因轉(zhuǎn)化水稻胚盾片組織，在低pH液體培養(yǎng)條件下，轉(zhuǎn)化細(xì)胞表現(xiàn)出了良好的熒光強(qiáng)度和ZEN降解能力，這個(gè)結(jié)果為轉(zhuǎn)基因植物可以轉(zhuǎn)化被污染谷物中的ZEN提供了理論依據(jù)。Higa A等［30－31］將egfp：：zhd101轉(zhuǎn)化水稻，融合基因能夠在轉(zhuǎn)基因植株T0葉片有效表達(dá)；當(dāng) T1葉片提取蛋白與 ZEN共同培育時(shí)，HPLC檢測(cè)ZEN含量顯著減少；而且在轉(zhuǎn)基因T2種子內(nèi)也檢測(cè)到ZEN降解酶活性。Igawa T等［32］報(bào)道將玉米赤霉烯酮降解基因egfp：：zhd101通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)在玉米中得到了表達(dá)，而且可以高效降解玉米赤霉烯酮。與非轉(zhuǎn)基因玉米相比，zhd101轉(zhuǎn)基因玉米植株的籽粒具有顯著降解ZEN毒素的功能。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株無論是在種子發(fā)育過程中還是在種子貯存過程中，都表現(xiàn)出對(duì)玉米赤霉烯酮的降解作用。

4 展望

真菌毒素的脫毒技術(shù)研究是保障我國(guó)糧食及飼料質(zhì)量安全的一項(xiàng)重要而緊迫的任務(wù)。自從1966年發(fā)現(xiàn)ZEN以來，歐美和日本等國(guó)家對(duì)ZEN的研究從未間斷過，并且受到越來越多的研究者重視，主要涉及ZEN的合成、降解、檢測(cè)、毒理和防治措施等方面，近年來研究進(jìn)展很快。

生物方法主要有微生物吸附和微生物降解。由于物理化學(xué)方法在應(yīng)用上的弊端，生物降解ZEN已成為研究熱點(diǎn)。目前玉米赤霉烯酮的生物降解技術(shù)研究尚存在許多不足之處：對(duì)于降解機(jī)理和降解代謝途徑的研究不夠深入，降解菌株存在降解能力不穩(wěn)定和退化等問題。未來通過生物方法減少ZEN的危害主要將集中在以下幾個(gè)研究方向：（1）深入研究ZEN生物合成途徑，尤其有必要摸清ZEN在田間條件下怎樣被合成，從而導(dǎo)致糧食污染，以從根源阻斷ZEN污染；（2）篩選能將ZEN轉(zhuǎn)化為無毒產(chǎn)物的微生物，直接應(yīng)用于谷物脫毒或?qū)ふ椅⑸镏衂EN降解基因；（3）利用微生物基因工程，將ZEN降解酶基因（如zhd101）轉(zhuǎn)化大腸桿菌、酵母或其它微生物，大量生產(chǎn)ZEN降解酶，應(yīng)用于被ZEN污染的谷物脫毒，或添加到飼料中飼養(yǎng)家畜，使其在動(dòng)物胃腸道降解飼料中的ZEN；（4）利用植物基因工程，將ZEN降解酶基因轉(zhuǎn)化禾谷類作物，使轉(zhuǎn)基因種子直接降解ZEN?？傊?，隨著人們對(duì)食品安全的日益關(guān)注，ZEN生物降解研究必將受到廣泛重視。

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