高粱米不同溶劑提取物的抗氧化活性研究

劉 禹 段江蓮 李為琴 張梅慶 琚裕杰

(山西師范大學食品科學與工程系1，臨汾 041004)(臨汾市堯都區(qū)教育局2，臨汾 041004)

高粱(Sorghum bicolor(L.)Moench)屬禾本科高粱屬一年生草本植物，具有光合效率高、抗逆性強、雜種優(yōu)勢突出、用途廣泛等特點［1］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，高粱中除含有豐富的單寧多酚成分外，還含有酚酸、原花青素、類黃酮等多種酚類化合物［2－3］，這些化合物具有較好的抗氧化活性［2，4］。劉睿等［5］對高粱外種皮的原花青素進行了分離、純化和抗氧化方面的研究，發(fā)現(xiàn)不同提取劑對高粱原花青素的提取率有較大的差異;王華等［6］研究了高粱籽粒的甲醇和水提取物的抗氧化活性;張國濤等［7］研究了不同果皮顏色高粱甲醇提取物的抗氧化活性。這些研究主要以高粱甲醇、乙醇、水提取物為主，并未全面反映高粱籽粒不同溶劑提取物的抗氧化活性。研究結果表明，由于提取溶劑的不同，會導致研究結果上存在一定的差異［5，8－9］。本試驗研究了甲醇、80% 甲醇、乙醇、80%乙醇、丙酮、80%丙酮、正己烷、乙酸乙酯、水等不同極性的溶劑對高粱植物化學成分含量及其抗氧化活性的影響，旨在為建立一種有效評價高粱抗氧化能力的方法及高粱米的綜合開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料、試劑

脫皮高粱米:農(nóng)貿(mào)批發(fā)市場;沒食子酸(GA)、蘆丁、1，1－苯基 －2－苦肼基自由基(DPPH)、2，2－聯(lián)氮－3－乙苯－二噻唑－6磺酸(ABTS)、水溶性維生素E(Trolox):sigma公司;Fe3+－三吡啶三吖嗪(TPTZ):Fluka公司;福林酚試劑:西安舟鼎國生物技術有限責任公司;其他藥品和試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

TU－1900紫外分光光度計:北京普析通用有限公司;5840R冷凍離心機:Gene公司;SC－5A超級恒溫槽:上海比朗儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品制備

將高梁米粉碎，過40目篩。準確稱取高粱米粉末2.0 g，放入錐形瓶中。按1∶20料液比分別加入甲醇、80%甲醇、乙醇、80%乙醇、丙酮、80%丙酮、正己烷、乙酸乙酯、水，在30℃水浴振蕩器中浸提1 h。然后在4℃、6 000 r/min的條件下離心15 min，取上清液用真空旋轉蒸發(fā)儀蒸干，用甲醇定容到10 mL，制備所得樣品在4℃冰箱中保存，用于樣品分析和測定。

1.3.2 多酚含量測定

多酚含量測定采用Folin－Ciocalteu測定法［10］。取0.1 mL樣品提取液于試管中，加入2.8 mL蒸餾水和0.1 mL 1.0 mol/L Folin－Ciocalteu 試劑，混合均勻，靜止8 min后加入2 mL 7.5% 碳酸鈉溶液，搖勻，混合液密封室溫下置于避光處，2 h后于765 nm波長測定吸光值，平行測定3次，以甲醇做空白，沒食子酸做標準曲線，建立的回歸方程為:y=0.002 8x+0.003 5(0 ～200 μg/mL，R2=0.998 9)，式中:y為吸光度值，x為沒食子酸濃度(μg/mL)。不同提取物中多酚含量以每克干燥樣品中所含的相當于沒食子酸的量進行計算。

1.3.3 總黃酮含量測定

精確量取1 mL樣品提取液于10 mL的容量瓶中，先加入0.3 mL的5%亞硝酸鈉溶液，搖勻靜置6 min，再加入0.3 mL的10%的硝酸鋁溶液，搖勻靜置6 min，然后加4 mL 4%的氫氧化鈉溶液，分別用蒸餾水稀釋至刻度，靜置15～20 min，在波長510 nm下測定吸光值，平行測定3次，以蒸餾水作為空白，蘆丁做標準曲線，建立的回歸方程為:y=0.011 6x+0.015 1(0～64 μg/mL，R2=0.997 5)，式中:y為吸光度值，x為蘆丁濃度(μg/mL)。不同提取物中總黃酮含量以每克干燥樣品中所含的相當于蘆丁的含量進行計算。

1.3.4 DPPH 自由基清除能力測定［10］

取0.5 mL適當濃度樣品溶液和4.5 mL 60 μmol/L的DPPH甲醇溶液，充分混勻后于室溫下密封避光靜置30 min，以甲醇做空白，于517 nm下測吸光值。DPPH自由基清除率計算公式如下:DPPH清除率=100% ×(A0－A1)/A0，式中:A0為對照管的吸光度值;A1為樣品管的吸光度值。以Trolox做標準曲線，建立的回歸方程為:y=0.717 3x－1.96(0～140 μmol，R2=0.999 8)，式中:y為清除率;x為 Trolox的濃度(μmol)。樣品對DPPH自由基的清除能力以每克樣品相當于Trolox的微摩爾數(shù)來表示。

1.3.5 ABTS 自由基清除能力測定［11］

使用前將濃度為7 mmol/L的ABTS溶液與2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液混合，室溫避光放置16～24 h，制得ABTS+自由基溶液。用甲醇稀釋，制得在734 nm處吸光度為0.700±0.050的應用液。移取50 μL樣品溶液，加入1.9 mL的ABTS+應用液，混合，室溫下避光反應6 min，立即測定其在734 nm處吸光度。ABTS自由基清除率計算公式為:ABTS+清除率=(A0－A1)/A0×100%，式中:A0為空白管的吸光度值，A1為樣品管的吸光度值。以Trolox做標準曲線，ABTS自由基清除能力以每克樣品相當于Trolox的微摩爾數(shù)表示。

1.3.6 鐵還原能力(FRAP)測定［11］

取0.1 mL提取液，加入3.1 mL蒸餾水和新鮮配置的預熱37℃的1.8 mL TPTZ工作液(由Ph3.6的300 mmol/L醋酸鹽緩沖液，10 mmol/L溶解在40 mmol/L HCl中的TPTZ溶液，20 mmol/L氯化鐵溶液按10∶1∶1體積比混合組成)，混勻后在37℃條件下水浴反應30 min，593 nm處測定吸光度。以FeSO4為標準，樣品的鐵還原能力以每克樣品相當于FeSO4的毫摩爾數(shù)表示。建立的回歸方程:y=0.000 3x－0.008 4(100～100 0 μmol/L，R2=0.996 2)，式中:y為吸光度值;x為FeSO4的濃度(μmol)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗所得數(shù)據(jù)采用Excel處理、DPS統(tǒng)計軟件進行單因子方差分析和線性回歸分析，以平均值±標準差來表示。

2 結果與分析

2.1 高粱米不同溶劑提取物中總多酚及黃酮含量

高粱米不同溶劑提取物中總多酚及黃酮的含量測定結果見表1。由表1可以看出，用不同組成的溶劑提取高粱米多酚和黃酮物質時，其得率均存在顯著性差異。高粱不同溶劑提取液中的總酚含量范圍1.30～6.49 mg GA/g。其中80%丙酮與80%甲醇提取液中總酚含量較高，分別為6.49 mg GA/g和6.15 mg GA/g，其次多酚含量由高到低依次為80%乙醇＞丙酮＞甲醇＞乙醇＞蒸餾水＞乙酸乙酯＞正己烷，正己烷提取液中的總酚含量最低(1.30 mg GA/g)，大約是80%丙酮提取液總酚含量的1/5。高粱不同溶劑提取液中的總黃酮含量范圍9.6～61.2 mg/100 g。其中80%丙酮提取液中總黃酮含量最高，為61.2 mg/100 g，其次黃酮含量由高到低依次為:丙酮＞80%乙醇＞80%甲醇＞乙醇＞甲醇＞蒸餾水＞乙酸乙酯＞正己烷，正己烷提取液的黃酮含量最低，為9.6 mg/100 g。這些結果說明不同提取劑由于極性、分散性等性質的差異對多酚、黃酮等植物化學成分的提取具有選擇性，80%丙酮能有效地提取高粱米中的植物化學成分。Zielinski等［12］也報道80%丙酮是一種從谷物中提取多酚和黃酮成分的有效提取劑，這支持了目前的研究結果。

表1 高粱米不同溶劑提取物中總多酚及黃酮含量

2.2 不同提取物對DPPH自由基的清除能力

高粱米不同溶劑提取物對DPPH自由基的清除能力的研究結果見表2。

表2 高粱米不同溶劑提取物的抗氧化能力

由表2可以看出，不同溶劑提取的高粱米提取物清除DPPH自由基能力存在顯著性差異，其中以體積分數(shù)80%丙酮的清除率最高，為0.74μmol Trolox/g，說明80%丙酮對高粱米中具有降低羥自由基、烷自由基或過氧化物自由基有效濃度及打斷脂質過氧化鏈作用的成分提取效果較好。其次為體積分數(shù)80%甲醇和80%乙醇(二者無顯著性差異)，甲醇、丙酮、乙醇、蒸餾水提取物清除DPPH自由基的能力均明顯低于80%甲醇和80%乙醇(P＜0.05)，但它們相互之間無顯著性差異(P＞0.05);乙酸乙酯和正己烷提取物清除DPPH自由基的效果最差，清除能力分別為 0.09、0.07 μmol Trolox/g。

2.3 多酚、黃酮含量與抗氧化活性的相關性分析

高粱米不同溶劑提取物中多酚、黃酮含量與抗氧化活性的相關性分析結果見表3。由表3可以看出，高粱米提取物多酚含量與抗氧化能力具有極顯著的高度正相關性(P＜0.01，0.843甘共苦9＜r＜0.951 3);黃酮含量與清除DPPH自由基能力也具有極顯著的高度正相關性(P ＜0.01，r=0.807 8)，與清除ABTS自由基能力和鐵還原能力沒有顯著的相關性(P ＞0.05，r=0.526 5、0.548 9)。

2.4 不同提取物對ABTS自由基的清除能力

高粱米不同溶劑提取物對ABTS自由基的清除能力的研究結果見表2。由表2可以看出，與DPPH試驗結果不同，80%丙酮、80%甲醇和80%乙醇的提取物清除 ABTS自由基的能力較強(4.20～4.52 μmol Trolox/g)，這可能是由于三種提取液的多酚等有效成分構成對ABTS自由基有良好的選擇性;其次清除ABTS自由基能力由高到低依次為蒸餾水＞甲醇＞乙醇＞丙酮＞正己烷＞乙酸乙酯，其中正己烷和乙酸乙酯提取物的清除能力分別為0.51μmol Trolox/g和0.49 μmol Trolox/g，遠遠低于其他溶劑提取物。楊紅葉等［13］在研究苦蕎提取液抗氧化性能的試驗中也得到了相似的結果。

2.5 不同提取物的鐵還原能力

高粱米不同溶劑提取物的鐵還原能力測定結果見表2。由表2可以看出，80%丙酮提取物的鐵還原能力最強(6.12μmol Fe(Ⅱ)/g)，還原能力強弱順序依次為80%乙醇＞80%甲醇＞甲醇＞水＞乙醇＞乙酸乙酯＞丙酮＞正己烷，正己烷提取物的鐵還原能力最弱，為2.21μmol Fe(Ⅱ)/g。從3個抗氧化試驗結果來看，80%丙酮、80%甲醇和80%乙醇的提取物表現(xiàn)出較高的抗氧化能力，正己烷提取物的抗氧化能力最弱，而其他溶劑提取物由于試驗體系的差異而表現(xiàn)出不同的抗氧化能力。這些不同提取物抗氧化能力的差異主要來自于不同溶劑導致的高粱提取物中抗氧化物質的量和種類所存在的差異。

表3 多酚、黃酮含量與各抗氧化活性的相關性

3 結論

試驗結果表明，不同溶劑對高粱米提取物中的多酚、黃酮含量及其抗氧化活性有顯著性的影響。80%丙酮提取物中的多酚、黃酮含量最高，分別為6.49 mg GA/g 和 61.2 mg/100 g，其表現(xiàn)出較好的抗氧化能力，清除 DPPH、ABTS自由基的能力分別為0.74、4.52 μmol Trolox/g，鐵還 原 能 力 為 6.12 μmol Fe(Ⅱ)/g;其次80%甲醇和80%乙醇高粱提取物也具有較好的抗氧化能力，正己烷提取物中的多酚、黃酮含量較低，抗氧化能力較差。相關性分析表明，提取物中的多酚、黃酮含量與其抗氧化能力有較高的相關性，說明不同提取物抗氧化能力的差異主要來源于提取物中抗氧化物質的量的差異。因此，從試驗結果上來看，80%丙酮是提取高粱米抗氧化物質的有效溶劑，但從安全和環(huán)保方面考慮，在實際應用中建議采用80%甲醇和80%乙醇提取高粱米抗氧化物質更為合適。

［1］程慶軍，張福耀，趙威軍，等.高淀粉高粱種質篩選及其研究利用［J］.中國農(nóng)學通報，2010，26(11):103 －106

［2］Dykes L，Rooney L W.Sorghum and millet phenols and antioxidants［J］.Journal of Cereal Science，2006，44:236 －251

［3］劉敏軒，王贅文，韓建國.高梁籽粒中多酚類物質的傅立葉變換近紅外光譜分析［J］.分析化學，2009，37(9):1275－1280

［4］Lee SM，Pan B S.Effect of dietary sorghum distillery residue on hematological characteristics of cultured grey mullet(Mugil cephalus)－an animal model for prescreening antioxidant and blood thinning activities［J］.Journal of Food Biochemistry，2003，27(1):1 －18

［5］劉睿，謝筆鈞，潘思軼，等.高粱種子外種皮中原花青素提取、純化及其抗氧化活性的研究［J］.中國糧油學報，2003，18(4):43 －48

［6］王華，姚亞平，王畢妮，等.高粱籽粒提取物抗氧化活性的研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2007，33(10):123 －127

［7］張國濤，王華.不同果皮顏色高粱抗氧化活性研究［J］.應用化工，2011，40(7):1201 －1204

［8］Zhou K，Yu L.Effects of extraction solvent on wheat bran antioxidant activity estimation［J］.Lebensmittel－ Wissenschaft und － Technologie － Food Science and Technology，2004，37:717－721

［9］Li W，Wei C，White P J，et al.High － amylose corn exhibits better antioxidant activity than typical and waxy genotypes［J］.Journal of Agricultural Food Chemistry，2007，55(2):291－298

［10］Xu JG，Tian C R，Hu Q P，et al.Dynamic changes in phenolic compounds and antioxidant activity in oats(Avena nuda L.)during steeping and germination［J］.Journal of Agricultural Food Chemistry，2009，57:10392 －10398

［11］Hu Q，Xu J.Profiles of carotenoids，anthocyanins，phenolics，and antioxidant activity of selected color waxy corn grains during maturation［J］.Journal of Agricultural Food Chemistry，2011，59:2026 －2033

［12］Zielinski H，Kozlowska H.Antioxidant activity and total phenolics in selected cereal grains and their different morpholo－ gical fractions［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2000，48:2008 －2016

［13］楊紅葉，柴巖，黃忠民，等.溶劑與提取方式對苦蕎提取液抗氧化性能的影響［J］.中國食品學報，2011，11(1):28－34.