基于酶解后乙醇萃取香草蘭凈油的GC－MS分析

徐 飛 初 眾 谷風(fēng)林 譚樂和 盧少芳 趙建平

（中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所國家熱帶重要作物工程技術(shù)研究中心農(nóng)業(yè)部香辛飲料作物遺傳資源利用重點實驗室，萬寧 571533）

香草蘭（Vanilla planifolia Andrews）是熱帶多年生大型肉質(zhì)藤本攀援植物，素有“食品香料之王”的美譽，是我國重要的熱帶香薰作物之一［1］。原產(chǎn)于南美洲的墨西哥，現(xiàn)廣泛種植于南、北緯20°之間的熱帶地區(qū)，種植國家涉及馬達加斯加、科摩羅、留尼汪等國，總種植面積達3.3萬～3.5萬hm2。世界年總產(chǎn)量約2 500 t左右，總產(chǎn)值達100多億元，在世界熱帶農(nóng)業(yè)經(jīng)濟、國際貿(mào)易和人類生活中具有極其重要的作用。目前主要在海南、云南地區(qū)有加工，其加工需要經(jīng)過清洗、發(fā)酵、干燥、陳化達4～6月以上才能具有濃郁的香味，豆莢經(jīng)加工后的初產(chǎn)品香蘭莢，俗稱香蘭豆，含有250多種揮發(fā)性香氣成分。豆莢提取物為香草蘭凈油，具有沁人心脾的獨特香氣，廣泛應(yīng)用于調(diào)制高級香煙、名酒、各類糕點、化妝品等。此外，它還具有強心、補腦、健胃等藥效［2］。

香草蘭凈油中主要香氣成分為香蘭素，而目前在國內(nèi)外大部分食品、化妝品添加的為化學(xué)合成的香蘭素，化學(xué)合成的香蘭素大劑量可導(dǎo)致頭痛、惡心、嘔吐等癥狀，因此天然香蘭素的提取能較好的解決以上問題。傳統(tǒng)提取香草蘭凈油的方法主要有：溶劑浸提法、超臨界CO2萃取法、程序增壓萃取法等。但一般的有機溶劑浸提方法提取率較低，提取時間較長，而超臨界CO2萃取方法與程序增壓萃取法成本較高，因此本課題通過研究在不同的時間纖維素酶酶解作為預(yù)處理，結(jié)合溶劑萃取方法萃取香草蘭凈油，對所得的香草蘭凈油利用GC－MS分析其組分及其相對含量。為進一步制作香草蘭高級調(diào)味品、化妝品提供一定的數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

香草蘭由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所提供，采收成熟后的香草蘭豆莢經(jīng)殺青、發(fā)酵、干燥、陳化生香后低溫烘干，粉碎，過40目篩，得香草蘭干粉，備用。纖維素酶（Cellulase，綠色木酶，酶活力＞15 u／mg）：上海伯奧生物科技有限公司。

1.2 儀器和設(shè)備

7890AGC－5975CMS氣質(zhì)聯(lián)用儀：美國 Agilent公司；HS－100型自動進樣器：瑞士 CTC公司；Z36HK型超速冷凍離心機：德國 Hermle；IKAWERKE磁力攪拌器：德國IKA公司；RV10型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國IKA公司。

1.3 香草蘭凈油提取方法

根據(jù)文獻中報到的方法略作修改［3］，稱取香草蘭干粉10 g（含水率12.4%）置于錐形瓶中，加入50 mL 0.2 mol／L pH＝4.8醋酸－醋酸鈉緩沖溶液（其1 000 mL醋酸－醋酸鈉緩沖液中溶解酶量0.5 g）。酶解溫度保持在45℃，磁力攪拌下酶解，酶解一定時間后加入一定量的乙醇，攪拌浸提過夜。所得浸提液過濾后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，直到乙醇溶液不再蒸出得到褐色浸膏，加入70℃熱乙醇在－10℃以下冷凍3 h后過濾除去油樹脂，再次蒸發(fā)到無乙醇流出為止，收集得到凈油。所得凈油加入2 mL乙醇和4 mL正己烷溶解后加少量無水硫酸鈉除去水分，離心（6 000 r／min，15 min）。樣品進行 GC－MS分析。

1.4 香草蘭凈油成分的GC－MS分析方法

GC／MS條件：進樣口溫度是270℃；柱初始溫80℃，保持2 min，以10℃／min升溫至160℃，然后以5℃／min程序升溫到270℃，并保持50 min。載氣為氦氣；流量1.2 mL／min；不分流進樣，進樣量為1μL。毛細管柱：HP－5MS（Agilent19091S－433）30.0 m×250.0μm×0.25μm。質(zhì)譜條件：離子源為EI源模式，電子轟擊能量70 eV，離子源溫度為250℃，接口溫度280℃，掃描范圍：40～450 amu。色譜庫NIST08。積分開始時間為3.5 min，以避免溶劑峰。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酶解時間香草蘭凈油色譜圖

不同酶解時間條件下預(yù)處理后乙醇萃取香草蘭凈油色譜圖見圖1，由圖1可見，6 h酶解得到的化合物種類較多，且在不同的酶解時間下同一保留時間凈油中主要化學(xué)成分較為相似［4］。隨著時間的延長，其化合物種類逐漸的減少，可能由于在高溫下，易揮發(fā)性的香味物質(zhì)容易散失［5－6］，因此想要得到較多的化學(xué)物質(zhì)選擇合適的酶解時間比較關(guān)鍵。因為試驗是利用不同時間酶解后，再用乙醇萃取分級提純得到凈油，且植物中纖維質(zhì)量分數(shù)達14.7%，故選用纖維素酶酶解，酶解時間的不同直接關(guān)系到成分變化的狀況。

圖1 不同酶解時間后萃取得到的香草蘭凈油色譜圖

2.2 同酶解時間香草蘭凈油GC－MS分析

通過GC／MS圖譜掃描，利用手動積分模式對各物質(zhì)進行積分，將峰面積表示其含量，做y軸，用不同酶解時間作為x軸，表示香草蘭凈油中風(fēng)味物質(zhì)在不同酶解時間過程中含量變化趨勢，各組樣品中各物質(zhì)峰面積累加，通過各物質(zhì)峰面積之和變化，可以看出香草蘭凈油在不同酶解過程中其組分發(fā)生不同程度的變化，具體趨勢見圖2。

圖2 不同酶解時間得到的香草蘭凈油峰面積變化

從圖2中可以看出，香草蘭在酶解6 h時其峰面積總和達到最高，之后隨著時間的延長，物質(zhì)含量逐漸下降，這可能是由于纖維素酶在酶解纖維時，其新物質(zhì)產(chǎn)生的同時也存在一定的揮發(fā)性散失，當(dāng)物質(zhì)含量達到最大時，隨著時間的延長其物質(zhì)散失速度越快，因此在時間最長9 h的情況下得到的物質(zhì)峰面積含量最少。

2.3 不同酶解時間下各物質(zhì)檢出數(shù)量

不同酶解時間下的各樣品，經(jīng)過正己烷萃取，添加無水硫酸鈉去除所含水分，低溫超速離心等工藝，利用GC／MS掃描分析，在30～450 amu的掃描范圍下，采用自動積分模式，并用手動積分模式修正自動積分中存在的明顯錯誤，各樣品掃描出風(fēng)味物質(zhì)數(shù)量見圖3。

圖3 不同酶解時間下各物質(zhì)檢出比較

酶解不同時間做預(yù)處理，溶劑萃取的凈油檢出化合物數(shù)量比較，發(fā)現(xiàn)在6 h時檢查化合物數(shù)量最多，即表示在酶解6 h時香草蘭凈油中含量較多的風(fēng)味物質(zhì)，但是隨著時間的延長凈油中化合物逐漸減少，表明酶解時間越長，揮發(fā)性物質(zhì)損失越多，幾乎減少一半，說明香草蘭凈油中易揮發(fā)香氣物質(zhì)較多。因此，選擇合適的酶解時間能更好的得到香味濃郁的凈油。

2.4 不同酶解時間下峰面積比較及香蘭素相對含量

香蘭素是香草蘭中主要香氣物質(zhì)之一，從圖4可以看出，隨著酶解時間的延長，香蘭素含量呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢。而各時間下其峰面積總和卻是在6 h之后呈現(xiàn)下降趨勢，說明雖然隨著酶解時間的延長，其物質(zhì)含量有所減少，但是酶解時間對香蘭素影響不大。

圖4 不同酶解時間下峰面積比較及香蘭素相對含量

2.5 不同時間酶解下主要化合物及相對含量

各凈油樣品經(jīng)計算機檢索、人工解析及與標(biāo)準譜圖對照，選出其中主要的14種風(fēng)味成分。以面積歸一化法測定其相對含量［7－8］，結(jié)果見表1。

從表1中可以看出，不同酶解時間作為預(yù)處理，其他條件相同萃取得到的香草蘭凈油在相同保留時間下所含組分基本相同，選擇了5種不同時間下相對含量較多的14種化合物成分進行分析，得到醛類：香蘭素、環(huán)丙基甲醛，相對含量在8～9 h時相對含量較高；酸類：正十六酸、亞油酸，酸類在5 h時相對含量較高；酯類：正十六酸乙酯、亞油酸乙酯、1，2－苯二甲酸單（2－乙己基）酯、16－甲氧基－14－氧化十六碳－15烯酸甲酯、噻吩－2－甲酸－4甲基戊基酯；酯類物質(zhì)沒有統(tǒng)一的酶解時間，不同的時間下不同的物質(zhì)相對含量具有一定的差別；烷烴類：十四烷基環(huán)辛烷；烷烴類在9 h時相對含量較高；醇類：蕓苔甾醇；醇類在6 h時相對含量較高；雜環(huán)類：2，4－二羥基吡啶；雜環(huán)類在8 h時相對含量較高；酮類：2－噻酚環(huán)丙基甲酮、2，4－噻唑烷二酮。酮類在6 h時相對含量較高。利用不同酶解時間作為預(yù)處理，其他條件相同萃取得到的香草蘭凈油相同保留時間下所含組分基本相同，其中這14種化合物為香草蘭凈油中的主要化學(xué)組分，其相對含量占總含量的50%以上。但是不同的酶解時間下相對含量相差較大。

表1 不同酶解時間下香草蘭凈油風(fēng)味物質(zhì)及相對含量比較

本試驗是應(yīng)用酶法冷浸出法提油工藝，主要利用酶類對油料細胞的降解作用使細胞結(jié)構(gòu)破壞而有利于油的提取，由于酶解條件溫和、溫度較低，因而不僅能耗明顯低于傳統(tǒng)方法，更主要的是油料中蛋白質(zhì)等成分性能能很好的保持，達到同時利用油脂和蛋白質(zhì)等有效成分的目的，油料不經(jīng)高溫處理，所提油脂的品質(zhì)明顯提高，得油率也高；另外，油料中存在脂蛋白和脂多糖，不僅阻礙油脂的提取，而且這些復(fù)合物本身會對油分子起包埋作用，傳統(tǒng)的熱處理難以打破這種包埋，而通過酶法能降解復(fù)合物，釋放油脂；應(yīng)用酶法還能解決油脂提取常規(guī)方法中的乳化問題，破壞其中起兩性作用的物質(zhì)［9］。如蛋白、果膠、磷脂等，使得主要成分保持較好，但所需酶量較大，必須考慮經(jīng)濟上切實可行，使用產(chǎn)量大、價格低的酶種是以后發(fā)展的趨勢。

3 結(jié)論

3.1 采用纖維素酶酶解作為預(yù)處理，溶劑法萃取香草蘭凈油，改變酶解時間，其他條件相同時，所得到的5種香草蘭凈油進行GC－MS分析，5種香草蘭凈油在同一保留時間下組成成分基本一致。香草蘭凈油中含量最高的14種主要成分分別為：香蘭素；正十六酸、正十六酸乙酯、亞油酸、亞油酸乙酯、1，2－苯二甲酸單（2－乙己基）酯、16－甲氧基－14－氧化十六碳－15烯酸甲酯、2－噻酚環(huán)丙基甲酮、2，4－二羥基吡啶、2，4－噻唑烷二酮、噻吩－2－甲酸－4甲基戊基酯、十四烷基環(huán)辛烷、蕓苔甾醇、環(huán)丙基甲醛。

3.2 在不同酶解時間作為預(yù)處理，其他條件相同萃取得到的香草蘭凈油在相同保留時間下所含組分基本相同，其中這14種化合物為香草蘭凈油中的主要化學(xué)組分，其相對質(zhì)量分數(shù)為50%以上。但是在不同的酶解時間下相對含量相差較大。

3.3 酶法具有條件溫和、溫度較低，不經(jīng)高溫處理，所提油脂的品質(zhì)較高；另外，能降解復(fù)合物、釋放油脂、解決油脂提取常規(guī)方法中的乳化問題，破壞其中起兩性作用的物質(zhì)如蛋白、果膠、磷脂等，使得主要成分保持較好，但所需酶量較大，必須考慮經(jīng)濟上切實可行，使用產(chǎn)量大、價格低的酶種是以后發(fā)展的趨勢。

［1］Bernd Schwarz，Thomas Hofmann.Identification of Novel Orosensory Active Molecules in Cured Vanilla Beans（Vanilla planifolia）.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2009，57，3729－3737

［2］陳德新.香莢蘭［M］.北京：中國林業(yè)出版社，2009：6－7

［3］劉曉庚，鞠興榮，茆旭東，等.酶法提取松針精油的實驗室研究［J］.林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2005，25（3）：111－114

［4］黃惠芳，梁立娟，農(nóng)耀京，等.不同溫度條件下超臨界萃取姜黃油 GC－MS分析［J］.食品科技，2011，36（2）：270－272

［5］Henryk HJ，Krystian W，Erwin W，et al.Solid－phase microextrac－tion for the analysis of some alcohols and esters in beer：compari－son with static headspace method［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1998，46（4）：1469－1473

［6］Alexandra S，Janusz P.Analysis of flavor volatiles using headspace solid－phase microextration［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1996，44（8）：2187－2193

［7］劉曉艷，白衛(wèi)東，黃玩娜.柿子果酒香氣成分的GC－MS分析［J］.釀酒，2011，38（1）：52－55

［8］李洪玉，壽旦，李亞平，等.不同產(chǎn)地馬尾松針揮發(fā)油的GC－MS分析［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2011，29（1）：78－80

［9］錢俊青，謝祥茂.酶法提取植物油的工藝方法及特點［J］.中國油脂，2003，28（4）：14－17.