利用內(nèi)標(biāo)為基礎(chǔ)的蘋(píng)果銹果類(lèi)病毒RT-PCR檢測(cè)技術(shù)

呂運(yùn)霞, 李楠，王亞迪，王雪靜，楊金鳳，

胡同樂(lè),王樹(shù)桐，王亞南, 曹克強(qiáng)

利用內(nèi)標(biāo)為基礎(chǔ)的蘋(píng)果銹果類(lèi)病毒RT-PCR檢測(cè)技術(shù)

呂運(yùn)霞, 李楠，王亞迪，王雪靜，楊金鳳，

胡同樂(lè),王樹(shù)桐，王亞南, 曹克強(qiáng)

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，河北 保定071001)

為開(kāi)發(fā)準(zhǔn)確、靈敏的蘋(píng)果銹果類(lèi)病毒(Apple scar skin viroid，ASSVd)RT-PCR檢測(cè)方法，以田間染病蘋(píng)果組織為試材，提取高質(zhì)量總RNA為模板，在常規(guī)RT-PCR檢測(cè)體系中引入蘋(píng)果線(xiàn)粒體nad5基因作為內(nèi)標(biāo)基因，對(duì)RT-PCR反應(yīng)體系和程序進(jìn)行優(yōu)化，并測(cè)定其靈敏度和穩(wěn)定性，最后利用優(yōu)化的檢測(cè)體系確定蘋(píng)果果實(shí)著色期最佳檢測(cè)部位。結(jié)果表明：以RNA提取改良法提取總RNA為模板合成cDNA后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，優(yōu)化后的PCR體系(25 μL)中cDNA模板2 μL、ASSVd(20 pmol/μL)正反向引物各1.0 μL，nad5(20 pmol/μL)正反向引物各0.1 μL；擴(kuò)增程序中退火溫度為60.9℃，循環(huán)次數(shù)為35次；檢測(cè)靈敏度為37.5 ng新鮮樣本；果實(shí)著色期，染病植株的幼嫩葉片、1 a生枝的韌皮部和木質(zhì)部、果實(shí)及部分種子樣本均能檢測(cè)到病毒，最佳檢測(cè)部位為幼嫩韌皮部。研究結(jié)果可以為ASSVd高效、快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)提供可靠方法，并為田間病害診斷及無(wú)毒苗木繁育提供依據(jù)和借鑒。

蘋(píng)果銹果類(lèi)病毒；RT-PCR；nad5；分布部位

蘋(píng)果銹果病又稱(chēng)“花臉病”，是蘋(píng)果(MaluspumilaMill.)生產(chǎn)中毀滅性的類(lèi)病毒病害之一[1]。蘋(píng)果銹果病的病原為蘋(píng)果銹果類(lèi)病毒(Apple skin scar viroid，ASSVd)屬于馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)紡錘塊莖類(lèi)病毒科馬鈴薯紡錘塊莖類(lèi)病毒屬(Pospiviroid)，一般具有330個(gè)左右的核苷酸。近年來(lái)，伴隨老果園高接換優(yōu)，蘋(píng)果銹果病發(fā)病率逐年升高。同時(shí)，一部分新發(fā)展蘋(píng)果園病情也相當(dāng)嚴(yán)重[2]。

由于類(lèi)病毒是裸露 RNA 分子, 沒(méi)有蛋白質(zhì)外殼，所以蘋(píng)果銹果病毒不能用血清學(xué)方法檢測(cè)，而指示植物檢測(cè)法周期長(zhǎng)，并且癥狀表現(xiàn)受環(huán)境條件影響較大，準(zhǔn)確度低[3]。近年來(lái)，反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)技術(shù)的發(fā)明和應(yīng)用為果樹(shù)病毒的檢測(cè)提供了有力的依據(jù)[4]。Shamloul利用RT-PCR技術(shù)在梨樹(shù)(PyruscommunisL. ,P.amygdaliformisL.)上發(fā)現(xiàn)了ASSVd的新變種[5]；趙英和牛建新利用RT-PCR技術(shù)首次在我國(guó)杏樹(shù)(ArmeniacavulgarisLam.)、桃樹(shù)[Amygdaluspersica(L.)Batsch.]、梨樹(shù)上檢測(cè)到了ASSVd[6-8]；Yazarlou利用RT-PCR技術(shù)首次報(bào)道了伊朗蘋(píng)果樹(shù)和梨樹(shù)上ASSVd的分子變異[9]；郝璐等利用RT-PCR技術(shù)首次對(duì)侵染小蘋(píng)果的ASSVd進(jìn)行了分離鑒定[10]。郭超等利用RT-PCR技術(shù)明確了蘋(píng)果銹果類(lèi)病毒在八棱海棠(MalusrobustaRehd.)種子中的分布及氫氧化鈉脫毒效果分析[11]。但尚未見(jiàn)利用內(nèi)標(biāo)為基礎(chǔ)的ASSVd RT-PCR檢測(cè)技術(shù)的相關(guān)報(bào)道。為此，以感染ASSVd的田間蘋(píng)果樹(shù)的幼嫩組織為試材，在常規(guī)RT-PCR檢測(cè)體系中引入蘋(píng)果線(xiàn)粒體nad5作為內(nèi)標(biāo)基因，對(duì)其共擴(kuò)增體系及程序進(jìn)行優(yōu)化，以期避免假陰性檢測(cè)結(jié)果的發(fā)生，并對(duì)優(yōu)化體系田間樣本的檢測(cè)靈敏度和穩(wěn)定性進(jìn)行測(cè)定；同時(shí)，采用優(yōu)化好的體系，對(duì)果實(shí)著色期幼嫩葉片、韌皮部、木質(zhì)部、果肉和種子進(jìn)行檢測(cè)，確定蘋(píng)果果實(shí)著色期ASSVd最佳檢測(cè)部位，以便為ASSVd的有效檢測(cè)提供技術(shù)手段。

1 材料和方法

1.1 材料

于2014年5—7月在河北農(nóng)業(yè)大學(xué)蘋(píng)果實(shí)驗(yàn)園，采集顯癥蘋(píng)果幼嫩枝條，作為RT-PCR體系建立及優(yōu)化的材料；于2014年11月在保定市曲陽(yáng)縣苗圃，采集蘋(píng)果幼嫩枝條，作為驗(yàn)證檢測(cè)體系可靠性的材料；于2014年9—10月在保定市順平縣南神南，采集顯癥蘋(píng)果樹(shù)幼嫩組織，作為確定果實(shí)著色期最佳檢測(cè)部位的材料。

1.2 主要試劑

植物總RNA提取試劑購(gòu)自于天根生化科技(北京)有限公司；M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、RNA稀釋液、DNA Marker、dNTPs、大腸桿菌DH5α為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；DEPC、瓊脂糖購(gòu)自于生工生物工程(上海)股份有限公司；2×Es Taq MasterMix購(gòu)自于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司； 其他化學(xué)試劑購(gòu)自于保定市萬(wàn)科實(shí)驗(yàn)儀器貿(mào)易有限公司。

1.3 引物

參閱GenBank中已經(jīng)發(fā)表的ASSVd序列，選擇保守性區(qū)域自行設(shè)計(jì)ASSVd特異性引物， 所用軟件為Vector NTI version 10.3(Informax，F(xiàn)rederick，MD，USA)。蘋(píng)果內(nèi)源基因參照Menzel的報(bào)道[12]，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列信息如表1所示。

表1 ASSVd RT-PCR檢測(cè)引物Table 1 Primers used for RT-PCR detection of ASSVd

注：a序列位置參考序列的NCBI登錄號(hào)分別為：ASSVd(X17696)，nad5(D37958)。

1.4 蘋(píng)果組織總RNA的提取

采用RNA提取改良法[13]，取100 mg植物組織，在液氮中充分研磨，加0.5 mL RNAplant 提取液進(jìn)行提取，最后加入20.00 μL DEPC水充分溶解RNA沉淀，-70.0℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 內(nèi)標(biāo)nad5基因與ASSVd共擴(kuò)增RT-PCR檢測(cè)體系的優(yōu)化

以總RNA為模板，按照M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶說(shuō)明書(shū)合成cDNA第1鏈，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。自行設(shè)計(jì)PCR體系及程序如下：PCR反應(yīng)體系為25.00 μL，包括2×Es Taq MasterMix 12.50 μL、ASSVd(20 pmol/μL)和nad5(20 pmol/μL)正反向引物各0.50 μL、反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物3.00 μL，最后用ddH2O補(bǔ)至25.00 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4.0℃預(yù)變性2 min；94.0℃變性1 min，59.0℃退火1 min，72.0℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；最后72.0℃延伸10 min，4.0℃保存。

以上述反應(yīng)體系為基礎(chǔ)，體系的優(yōu)化分別按照ASSVd(20 pmol/μL)和nad5(20 pmol/μL)引物比例(1∶1，1∶2，1∶5，1∶10，1∶15，1∶20)、cDNA模板用量(4.00 μL，3.00 μL，2.00 μL，1.00 μL，0.50 μL，0.25 μL)、ASSVd(20 pmol/μL)用量(4.00 μL，3.00 μL，2.00 μL，1.00 μL，0.50 μL，0.25 μL)進(jìn)行逐一優(yōu)化；程序的優(yōu)化包括退火溫度(70.0℃，68.9℃，67.1℃，64.4℃，60.9℃，58.5℃，56.4℃，55.0℃)和循環(huán)次數(shù)(25，30，35，40，45)的優(yōu)化。

1.6 內(nèi)標(biāo)nad5基因與ASSVd共擴(kuò)增RT-PCR檢測(cè)體系靈敏度的測(cè)定

將染病植株的總RNA用RNA稀釋液進(jìn)行系列稀釋?zhuān)♂尡壤謩e為1∶10、1∶100、1∶1 000、1∶10 000、1∶100 000、1∶1 000 000、1∶10 000 000，然后進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，根據(jù)擴(kuò)增效果，確定優(yōu)化體系的檢測(cè)靈敏度。

1.7 內(nèi)標(biāo)nad5基因與ASSVd共擴(kuò)增RT-PCR檢測(cè)體系可靠性的驗(yàn)證

利用優(yōu)化的RT-PCR檢測(cè)體系，對(duì)曲陽(yáng)果園124株田間樣品進(jìn)行檢測(cè)，采用常規(guī)RT-PCR體系進(jìn)行驗(yàn)證[2]。比較2種方法的檢測(cè)結(jié)果，驗(yàn)證本研究?jī)?nèi)標(biāo)nad5基因與ASSVd共擴(kuò)增RT-PCR檢測(cè)體系檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

1.8 序列測(cè)定與電泳分析

PCR產(chǎn)物的電泳分析： 1×TAE電泳緩沖液，1.5%瓊脂糖凝膠，上樣量8.00 μL，100 V穩(wěn)壓電泳40 min，EB染色后觀察結(jié)果。目的片段的克隆測(cè)序：PCR產(chǎn)物切膠回收，純化后與載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，通過(guò)藍(lán)白斑篩選和PCR鑒定陽(yáng)性克隆[14]，委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank中序列進(jìn)行同源性分析，確定序列的準(zhǔn)確性。

1.9 RT-PCR最佳檢測(cè)組織的確定

為了明確果實(shí)著色期ASSVd在蘋(píng)果樹(shù)1 a生枝條及果實(shí)中的分布情況及最佳檢測(cè)部位，對(duì)田間處于果實(shí)著色期的10株果樹(shù)1 a生枝條葉片、韌皮部、木質(zhì)部、果肉和種子進(jìn)行了RNA提取和RT-PCR檢測(cè)，觀察擴(kuò)增效果，確定果實(shí)著色期帶毒部位及最佳檢測(cè)部位。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)標(biāo)nad5基因與ASSVd共擴(kuò)增RT-PCR檢測(cè)體系的建立

對(duì)染病植株進(jìn)行nad5基因、ASSVd基因單獨(dú)擴(kuò)增和共擴(kuò)增，結(jié)果如圖1所示。

圖1 內(nèi)標(biāo)為基礎(chǔ)的ASSVd RT-PCR體系的建立

Fig.1 Establishment of ASSVd RT-PCR system based on internal standard

注：M：DL2 000；1, 2: 染病植株nad5單獨(dú)擴(kuò)增；3, 4：染病植株ASSVd單獨(dú)擴(kuò)增；5, 6：染病植株nad5和ASSVd共同擴(kuò)增。

由圖1可知，nad5基因單獨(dú)擴(kuò)增得到181 bp目的條帶，ASSVd基因單獨(dú)擴(kuò)增得到325 bp目的條帶，nad5基因和ASSVd基因共擴(kuò)增同時(shí)得到181 bp和325 bp目的條帶，表明nad5和ASSVd共同擴(kuò)增的有效性。

2.2 內(nèi)標(biāo)nad5基因與ASSVd共擴(kuò)增RT-PCR檢測(cè)體系的優(yōu)化

以選用的ASSVd和nad5為引物，按照RT-PCR基本體系和程序?qū)σ锱浔?、cDNA模板、引物用量、退火溫度、循環(huán)次數(shù)進(jìn)行逐一優(yōu)化。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后觀察擴(kuò)增效果，確定RT-PCR共擴(kuò)增最佳體系及程序組合。結(jié)果如圖2所示。

圖2 內(nèi)標(biāo)為基礎(chǔ)的ASSVd RT-PCR體系的優(yōu)化Fig.2 Optimization of ASSVd RT-PCR system based on internal control

注：M：DL2 000；A：ASSVd：nad5引物比例，(泳道1—7為1∶1，1∶2，1∶5，1∶10，1∶15，1∶20)；B：cDNA模板(泳道1—6為4.00 μL，3.00 μL，2.00 μL，1.00 μL，0.50 μL，0.25 μL)；C：ASSVd引物用量(泳道1—6為4.00 μL，3.00 μL，2.00 μL，1.00 μL，0.50 μL，0.25 μL)；D：退火溫度(泳道1—8為70.0℃，68.9 ℃，67.1 ℃，64.4℃，60.9 ℃，58.5 ℃，56.4 ℃，55.0℃)；E：不同循環(huán)次數(shù)(泳道1—5為25，30，35，40，45)

由圖2可知，最終確定的體系為25 μL的PCR體系：含cDNA模板2.00 μL、ASSVd(20 pmol/μL)正反向引物各1.00 μL，nad5(20 pmol/μL)正反向引物各0.10 μL，ddH2O 8.30 μL，2×Es Taq MasterMix 12.50 μL；最終優(yōu)化的程序?yàn)椋?4.0℃預(yù)變性2 min；94.0℃變性45 s，60.9℃退火45 s，72.0℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；最后72.0℃延伸10 min。

2.3 內(nèi)標(biāo)nad5基因與ASSVd共擴(kuò)增RT-PCR檢測(cè)體系靈敏度的確定

將染病植株幼嫩韌皮部提取的總RNA用RNA稀釋液進(jìn)行系列稀釋?zhuān)缓笠韵♂尯蟮腞NA為模板，進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，測(cè)定體系的靈敏度，結(jié)果如圖3所示。

圖3 ASSVd RT-PCR靈敏度的測(cè)定

Fig.3 Assay of the detection sensitivity of RT-PCR for ASSVd

注：M：DL 2 000；1：未被稀釋的染病植株總RNA提取液；2—8：以RNA稀釋液系列稀釋染病植株總RNA提取液1∶10，1∶100，1∶1 000，

1∶10 000，1∶100 000，1∶1 000 000，1∶10 000 000；9—10：RNA稀釋液。

由圖3可知，作為陰性對(duì)照的RNA稀釋液沒(méi)有擴(kuò)增出病毒特異性條帶，而以總RNA為模板10 000倍稀釋液仍有325 bp和181 bp左右的條帶出現(xiàn)。經(jīng)過(guò)折算，RT-PCR共擴(kuò)增體系的靈敏度達(dá)到能夠檢測(cè)37.5 ng新鮮植物組織中的ASSVd。

2.4 內(nèi)標(biāo)nad5基因與ASSVd共擴(kuò)增RT-PCR檢測(cè)體系可靠性的驗(yàn)證

利用內(nèi)標(biāo)nad5基因與ASSVd共擴(kuò)增RT-PCR檢測(cè)體系和利用常規(guī)RT-PCR檢測(cè)體系對(duì)保定市曲陽(yáng)縣124株樣品進(jìn)行檢測(cè)，部分檢測(cè)結(jié)果如圖4所示。本研究檢測(cè)體系檢測(cè)出30株帶毒，參考的常規(guī)檢測(cè)體系檢測(cè)出28株帶毒，說(shuō)明本研究檢測(cè)體系有效控制了假陰性的發(fā)生,證明了本研究RT-PCR體系對(duì)田間樣本檢測(cè)的準(zhǔn)確性和可靠性。

圖4 曲陽(yáng)部分樣品ASSVd RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

Fig.4 ASSVd RT-PCR detection result of Quyang sample

注： M：DL2 000；1—10：QY-1，QY-2，QY-3，QY-4，QY-5，QY-6，QY-7，QY-8，QY-9，QY-10；11：陽(yáng)性對(duì)照；12：健康植株對(duì)照。上為本研究檢測(cè)體系，下為參考檢測(cè)體系。

2.5 PCR產(chǎn)物的克隆與測(cè)序

對(duì)RT-PCR特異條帶進(jìn)行回收、克隆和測(cè)序，獲得與目的片段大小相符的序列，經(jīng)過(guò)序列比對(duì)，ASSVd與GenBank中X71599株系親緣關(guān)系最近，相似性為99%；nad5與GenBank中GU585873.1株系親緣關(guān)系最近，相似性為99%，結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了檢測(cè)結(jié)果的可靠性。

2.6 果實(shí)著色期ASSVd最佳檢測(cè)組織部位的確定

對(duì)果實(shí)著色期田間1 a生枝條不同部位進(jìn)行了RNA提取和RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果如圖5所示。

圖5 9—10月份蘋(píng)果各組織部位ASSVd RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

Fig.5 Detection of ASSVd in different parts of apple in September and October by RT-PCR

注：M： DL2 000；1：葉片，2：韌皮部，3：木質(zhì)部，4：果實(shí)，5：陰性對(duì)照 。

由圖5可知，10株果樹(shù)1 a生枝條葉片、韌皮部、木質(zhì)部和果實(shí)均成功擴(kuò)增出了ASSVd目的條帶，且結(jié)果穩(wěn)定，其中韌皮部條帶亮度最高，為最佳檢測(cè)部位。通過(guò)對(duì)種子帶毒情況檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，10個(gè)樣本中僅7個(gè)樣本擴(kuò)增出了目的條帶，不宜作為檢測(cè)部位。

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)利用自行設(shè)計(jì)的引物，在常規(guī)RT-PCR檢測(cè)體系基礎(chǔ)上引入線(xiàn)粒體nad5基因?yàn)閮?nèi)標(biāo)，確定適宜的引物濃度組合為ASSVd引物20 pmol/μL，nad5內(nèi)標(biāo)引物2 pmol/μL，采用優(yōu)化后的內(nèi)標(biāo)nad5基因與ASSVd共擴(kuò)增RT-PCR檢測(cè)體系進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)體系靈敏度達(dá)到10 000×總RNA模板稀釋液，不低于常規(guī)RT-PCR檢測(cè)體系靈敏度[16]。測(cè)序結(jié)果表明，ASSVd與GenBank中X71599株系親緣關(guān)系最近，相似性為99%；nad5與GenBank中GU585873.1株系親緣關(guān)系最近，相似性為99%。同時(shí)，通過(guò)對(duì)果實(shí)著色期不同部位進(jìn)行檢測(cè)，最終確定1 a生枝條的韌皮部為蘋(píng)果植株ASSVd最佳檢測(cè)部位。

曾有多種內(nèi)標(biāo)被報(bào)道,但是沒(méi)有一種可區(qū)分RNA與DNA模板,因此在RT-PCR前必須完全消除DNA[15]。nad5基因是蘋(píng)果線(xiàn)粒體DNA的NADH脫氫酶亞基5基因，利用此基因?yàn)镽T-PCR的內(nèi)標(biāo)不論是健康樣或帶毒樣，當(dāng)RNA完整且可擴(kuò)增時(shí)，nad5均能成功被擴(kuò)增出，且不受DNA存在與否的影響。當(dāng)存在DNA污染、RNA處于抑制狀態(tài)或降解時(shí)，nad5則不能被擴(kuò)增出。以nad5為內(nèi)標(biāo)可減少假陰性出現(xiàn)，使檢測(cè)結(jié)果更加可靠[15]。

在田間樣本檢測(cè)中，不同的檢測(cè)部位影響著檢測(cè)的準(zhǔn)確性。帶有休眠芽的1 a生枝條枝皮組織可以作為果樹(shù)病毒周年檢測(cè)的材料[11]，檢測(cè)果樹(shù)1 a生枝條葉片、韌皮部、木質(zhì)部和果實(shí)都能擴(kuò)增出ASSVd的目的條帶，因韌皮部條帶亮度相對(duì)較高，從而確定為最佳檢測(cè)部位，并且樹(shù)皮為檢測(cè)材料可以使檢測(cè)不受季節(jié)限制。

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(編輯 潘秀華)

Internal reference gene-based RT-PCR assay for the detection of apple scar skin viroid

LV Yunxia，LI Nan，WANG Yadi，WANG Xuejing，YANG Jinfeng，HU Tongle，WANG Shutong，WANG Yanan，CAO Keqiang

(CollegeofPlantProtection,HebeiAgriculturalUniversity,Baoding071001,China)

In order to develop an accurate and sensitive method to detect apple scar skin viroid(ASSVd), a RT-PCR assay based on internal standard was developed. The total RNA with high quality was extracted from diseased apple branch. The primers of ASSVd and apple mitochondria genenad5 were added to the assay and the RT-PCR detection method was optimized. In fruit coloring period, the optimal detection tissue was also determined. The total RNA was extracted by improved RNA-extraction method and cDNA was synthesed. Our results showed that the optimized reaction system contained cDNA template 2 μL, the forward and reverse primers of ASSVd(20 pmol/μL) both for 1.0 μL, and the forward and reverse primer ofnad5(20 pmol/μL) both for 0.1 μL. The PCR annealing temperature was 60.9℃ and the cycle was 35. The sensitivity of the optimized RT-PCR method could reach as less as 37.5 ng fresh sample. The tissues, including young leaves, phloem, xylem, fruit and part of seed could be used to detect ASSVd in fruit coloring period, and the young phloem was the best test tissue in this special period. The method provided a reliable way for efficient, rapid and accurate detection of ASSVd and lay a foundation for disease diagnosis and detoxification seedling breeding.

Apple scar skin viroid; RT-PCR;nad5; distribution sites

1007-4961(2017)01-0051-06

10.13320/j.cnki.hjfor.2017.0010

2016-10-25；

2016-12-23

國(guó)家蘋(píng)果現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-28)；河北省高等學(xué)校科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目“蘋(píng)果褪綠葉斑病毒運(yùn)動(dòng)相關(guān)寄主因子研究”(YQ2014023)；河北省青年拔尖人才計(jì)劃。

呂運(yùn)霞(1990-)，女，河北邯鄲人，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)橹参锊『α餍信c綜合防治。 李楠(1994-)，女，河北衡水人，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)橹参锊『α餍信c綜合防治。 呂運(yùn)霞與李楠為同等貢獻(xiàn)作者。

曹克強(qiáng)(1963-)，男，河北容城人，博士，教授，從事植物病害流行與綜合防治研究。

S 432.4

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