化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)抗髓過(guò)氧化物酶抗體和抗蛋白酶3抗體

馬晉，張蜀瀾，胡朝軍，柳樂(lè)，李慶春，李夢(mèng)濤，曾小峰

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院風(fēng)濕免疫科 風(fēng)濕免疫病學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100730)

ChinJAllergyClinImmunol，2017，11(2)：112- 118

抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體(anti-neutrophil cytoplas-mic autoantibodies, ANCA)是最早由Davies及其同事在研究節(jié)段性壞死性腎小球腎炎患者抗核抗體時(shí)所發(fā)現(xiàn)的一種自身抗體[1]?，F(xiàn)有研究結(jié)果表明ANCA是包括壞死性肉芽腫性血管炎、顯微鏡下多脈管炎和Churg-Strauss綜合征等疾病在內(nèi)的系統(tǒng)性小血管炎(systemic small vasculitis, SSV)臨床診斷的重要血清學(xué)指標(biāo)[2- 4]。大約85%～90%的壞死性肉芽腫性血管炎、顯微鏡下多脈管炎和Churg-Strauss綜合征等疾病患者的體內(nèi)都能夠檢測(cè)到ANCA。其中，抗蛋白酶3(proteinase 3, PR3)抗體和抗髓過(guò)氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)抗體對(duì)SSV具有良好的診斷特異性，而且抗體的滴度與疾病的活動(dòng)度具有相關(guān)性[5]。因此，在臨床實(shí)踐中作為重要的ANCA靶抗原確認(rèn)實(shí)驗(yàn)而廣泛開(kāi)展。

目前臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)抗MPO抗體和抗PR3抗體多采用基于20世紀(jì)70年代的傳統(tǒng)酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)技術(shù)[6- 8]。近年來(lái)，新的免疫學(xué)技術(shù)已經(jīng)逐步應(yīng)用到臨床自身抗體檢測(cè)實(shí)踐中[9- 11]。具有全自動(dòng)、定量、隨機(jī)上樣以及檢測(cè)線性范圍更寬等優(yōu)勢(shì)的全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光(chemiluminescent immunoassay, CLIA)檢測(cè)技術(shù)廣泛應(yīng)用于臨床樣本檢測(cè)。本研究采用CLIA方法對(duì)臨床常規(guī)樣本開(kāi)展抗MPO和抗PR3抗體檢測(cè)，探討其在抗MPO抗體和抗PR3抗體檢測(cè)中的臨床應(yīng)用價(jià)值。

對(duì)象與方法

對(duì)象

收集北京協(xié)和醫(yī)院門診和住院申請(qǐng)ANCA檢測(cè)項(xiàng)目的常規(guī)臨床樣本242例，其中住院患者29例，門診患者213例；男性97例，年齡7～87歲，平均(52.0±18.5)歲，女性145例，年齡10～87歲，平均(48.1±17.1)歲。所有入組樣本中，119例具有明確疾病診斷信息(表1)，其中包括47例SSV患者和72例非SSV患者(含29例風(fēng)濕炎癥疾病和43例非自身免疫疾病)。待檢測(cè)患者清晨空腹靜脈采血，離心分離血清后，應(yīng)用免疫熒光法(immunofluorescent assay，

表1　具有明確疾病診斷信息的入組樣本臨床特點(diǎn)Table 1　Demographic and clinical characteristics of subjects with disease diagnosis

SSV:系統(tǒng)性小血管炎; 風(fēng)濕炎癥疾病組包括6例系統(tǒng)性紅斑狼瘡、9例結(jié)締組織病、12例類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎及2例系統(tǒng)性硬化癥

IFA)開(kāi)展ANCA篩查檢測(cè)的同時(shí)，平行采用CLIA和ELISA開(kāi)展抗MPO抗體和抗PR3抗體檢測(cè)。

試劑和儀器

CLIA自身抗體檢測(cè)系統(tǒng)，包括全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀(LumiRay 1260)及抗MPO抗體和抗PR3抗體檢測(cè)試劑(蘇州浩歐博生物醫(yī)藥有限公司)。IFA檢測(cè)試劑盒：同時(shí)包被HEp- 2細(xì)胞、靈長(zhǎng)類肝組織片、甲醛固定中性粒細(xì)胞和乙醇固定中性粒細(xì)胞等基質(zhì)的粒細(xì)胞馬賽克檢測(cè)試劑盒(德國(guó)歐蒙醫(yī)學(xué)診斷股份公司)。對(duì)比ELISA試劑盒：抗MPO抗體和抗PR3抗體ELISA檢測(cè)試劑盒(德國(guó)歐蒙醫(yī)學(xué)診斷股份公司)。第三方ELISA驗(yàn)證試劑盒：由于抗MPO抗體和抗PR3抗體缺乏公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)參考方法，本研究針對(duì)CLIA與ELISA檢測(cè)結(jié)果不一致樣本選擇第三方驗(yàn)證ELISA檢測(cè)試劑盒(德國(guó)AESKU Diagnostic公司)開(kāi)展復(fù)測(cè)。SUNRISE酶標(biāo)儀(瑞士TECAN公司)；熒光顯微鏡(日本Olympus)。

方法

CLIA檢測(cè)抗MPO抗體和抗PR3抗體：檢測(cè)流程嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)開(kāi)展檢測(cè)，所有檢測(cè)均在配套的全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀(LumiRay 1260)上全自動(dòng)開(kāi)展檢測(cè)。抗PR3抗體和抗MPO抗體的檢測(cè)臨界值均為20 RU/ml。

IFA開(kāi)展ANCA篩查檢測(cè)：采用包括乙醇固定粒細(xì)胞、甲醛固定粒細(xì)胞、靈長(zhǎng)類肝組織片和HEp- 2細(xì)胞抗原片等四個(gè)基質(zhì)組合檢測(cè)。血清1∶10稀釋后與抗原基質(zhì)片反應(yīng)30 min(同時(shí)設(shè)立陽(yáng)性和陰性對(duì)照)，在PBS緩沖液中浸泡5 min，加入熒光素標(biāo)記的抗人IgG抗體避光溫育30 min，再次在PBS緩沖液中浸泡5 min，加甘油基質(zhì)封片并在熒光顯微鏡下觀察和判讀結(jié)果。以抗體滴度≥1∶10為陽(yáng)性。

ELISA檢測(cè)抗MPO和PR3抗體：血清樣本1∶100稀釋，加入包被MPO和PR3抗原的微孔板中，室溫反應(yīng)30 min，用清洗緩沖液清洗3次，每孔加入100 μl酶標(biāo)記的抗人IgG抗體，室溫反應(yīng)30 min，用清洗緩沖液清洗3次，每孔加入100 μl TMB底物液，室溫反應(yīng)15 min，最后加入100 μl終止液，在酶標(biāo)儀中按照450 nm和620 nm的雙波長(zhǎng)進(jìn)行光密度測(cè)量。根據(jù)光密度值計(jì)算抗體濃度并判讀陰陽(yáng)性結(jié)果。其中對(duì)比ELISA試劑盒和第三方驗(yàn)證ELISA試劑盒的檢測(cè)臨界值分別為20 RU/ml和18 U/ml。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。不同方法檢測(cè)結(jié)果差異的比較，采用四格表的χ2檢驗(yàn)，兩種方法檢測(cè)結(jié)果一致性的分析采用Kappa檢驗(yàn)，一致性強(qiáng)度的判斷：當(dāng)Kappa<0.4，一致性強(qiáng)度較差；0.4≤Kappa<0.75，兩者一致性一般；Kappa≥0.75兩者一致性較好。同時(shí)以ELISA作為對(duì)比方法繪制受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve,ROC曲線)，借助曲線以下面積(area under the curve, AUC)分析CLIA與ELISA比較的準(zhǔn)確性，判斷標(biāo)準(zhǔn)：當(dāng)0.50.9時(shí)，具有較高的準(zhǔn)確性。當(dāng)兩種方法學(xué)檢測(cè)結(jié)果一致性強(qiáng)度較差時(shí)，差異樣本經(jīng)第三方試劑復(fù)測(cè)的結(jié)果與CLIA和ELISA檢測(cè)結(jié)果分別采用單因素ANOVA分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)　　果

CLIA與ELISA檢測(cè)抗MPO抗體的符合率

應(yīng)用CLIA和ELISA同時(shí)對(duì)入組樣本開(kāi)展抗MPO抗體平行檢測(cè)，分別對(duì)兩種方法學(xué)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行符合率分析。結(jié)果顯示，CLIA和ELISA在檢測(cè)抗MPO抗體時(shí)表現(xiàn)出良好的一致性，其中陽(yáng)性符合率、陰性符合率及總符合率分別為81.9%、98.8%和93.8%(表2)。以ELISA作為對(duì)比方法繪制ROC曲線，結(jié)果顯示與ELISA比較，CLIA檢測(cè)抗MPO抗體時(shí)具有良好的準(zhǔn)確性，AUC為0.966 (95%置信區(qū)間為0.946～0.986)(圖1)。兩種方法檢測(cè)結(jié)果差異樣本僅為15例，針對(duì)差異樣本采用第三方試劑開(kāi)展復(fù)測(cè)的結(jié)果見(jiàn)表3。

表2　CLIA與ELISA檢測(cè)抗MPO抗體符合率分析Table 2　Qualitative agreement between CLIA and ELISA for the detection of anti-MPO

MPO：髓過(guò)氧化物酶；CLIA：化學(xué)發(fā)光法；ELISA：酶聯(lián)免疫吸附法

圖1兩種方法檢測(cè)抗MPO和PR3抗體ROC曲線圖

Fig1Receiver operating characteristic (ROC) curves of anti-MPO and anti-PR3 for the comparison between CLIA and ELISA

MPO：髓過(guò)氧化物酶；PR3：蛋白酶3；ROC：受試者工作特征；AUC：曲線下面積

表3　CLIA與ELISA檢測(cè)抗MPO抗體差異樣本的第三方試劑復(fù)測(cè)結(jié)果Table 3　Retest of discrepant samples between CLIA and ELISA with the validation reagent for anti-MPO

MPO：髓過(guò)氧化物酶；CLIA：化學(xué)發(fā)光法；ELISA：酶聯(lián)免疫吸附法

CLIA與ELISA檢測(cè)抗PR3抗體的符合率

應(yīng)用CLIA和ELISA同時(shí)對(duì)入組樣本開(kāi)展抗PR3抗體平行檢測(cè)，對(duì)兩種方法學(xué)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行符合率分析。結(jié)果顯示，CLIA與ELISA在檢測(cè)抗PR3抗體時(shí)符合率和一致性較低，其中陽(yáng)性符合率、陰性符合率和總符合率分別為35.1%、96.1%和86.8%(表4)。兩種方法檢測(cè)結(jié)果差異樣本合計(jì)為32例，針對(duì)差異樣本采用第三方試劑開(kāi)展復(fù)測(cè)，結(jié)果顯示，CLIA結(jié)果與第三方試劑復(fù)測(cè)結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而ELISA結(jié)果與第三方試劑復(fù)測(cè)結(jié)果差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(表5)。以ELISA作為對(duì)照方法繪制ROC曲線，結(jié)果顯示與ELISA比較時(shí)，CLIA在檢測(cè)抗PR3抗體時(shí)具有一定的準(zhǔn)確性， AUC為0.839 (95%置信區(qū)間為0.773～0.905)(圖1)。

CLIA和ELISA分別與IFA篩查ANCA檢測(cè)結(jié)果的符合率

臨床實(shí)踐中，首先以包括乙醇和甲醛固定的中性粒細(xì)胞為基質(zhì)的IFA開(kāi)展ANCA初篩試驗(yàn)，然后進(jìn)一步采用免疫印跡法或ELISA方法開(kāi)展抗PR3抗體和抗MPO抗體的確認(rèn)試驗(yàn)。本研究中242例樣本以抗

表4　CLIA與ELISA檢測(cè)抗PR3抗體符合率分析Table 4　Qualitative agreement between CLIA and ELISA for the detection of anti-PR3

PR3：蛋白酶3；CLIA：化學(xué)發(fā)光法；ELISA：酶聯(lián)免疫吸附法

表5　CLIA與ELISA檢測(cè)抗PR3抗體差異樣本的第三方試劑復(fù)測(cè)結(jié)果分析Table 5　Analysis of discrepant samples between CLIA and ELISA retested with the validation reagent for anti-PR3　(n)

PR3：蛋白酶3；CLIA：化學(xué)發(fā)光法；ELISA：酶聯(lián)免疫吸附法。CLIA與第三方驗(yàn)證結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，ELISA與第三方驗(yàn)證結(jié)果差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)

MPO和(或)抗PR3抗體陽(yáng)性作陽(yáng)性樣本，分別開(kāi)展兩種方法與IFA檢測(cè)結(jié)果的符合率比較。結(jié)果顯示，CLIA與IFA的陰性符合率(94.8%)明顯優(yōu)于ELISA與IFA的陰性符合率(77.2%)(表6)。

CLIA和ELISA抗MPO抗體和抗PR3抗體檢測(cè)性能對(duì)比分析

本研究中，共有119例入組樣本具有明確的疾病診斷，其中包括47例SSV以及72例非SSV。應(yīng)用上述兩組樣本的檢測(cè)結(jié)果，分別比較CLIA和ELISA抗PR3抗體和抗MPO抗體的檢測(cè)性能。結(jié)果顯示在抗PR3抗體檢測(cè)時(shí)，CLIA敏感度(21.3%)略低于ELISA(29.8%)，但CLIA特異度(92.3%)優(yōu)于ELISA(87.5%)。而在檢測(cè)抗MPO抗體時(shí)，兩種方法學(xué)的敏感度基本相當(dāng)，但CLIA特異度(68.1%)高于ELISA(58.3%)(表7)。

表6　CLIA及ELISA確認(rèn)試驗(yàn)與IFA篩查檢測(cè)結(jié)果符合率比較Table 6　The qualitative agreement between IFA screening test and confirmatory test with CLIA and ELISA

MPO：髓過(guò)氧化物酶；PR3：蛋白酶3；CLIA：化學(xué)發(fā)光法；ELISA：酶聯(lián)免疫吸附法；IFA：免疫熒光法

表7　CLIA和ELISA抗MPO和PR3抗體檢測(cè)性能對(duì)比分析Table 7　The comparison of clinical performance between CLIA and ELISA for the detection of anti-MPO and anti-PR3

SSV：系統(tǒng)性小血管炎；MPO：髓過(guò)氧化物酶；PR3：蛋白酶3；CLIA：化學(xué)發(fā)光法；ELISA：酶聯(lián)免疫吸附法

討　　論

ANCA是SSV臨床診斷的重要血清學(xué)指標(biāo)。大約85%～90%的壞死性肉芽腫性血管炎、顯微鏡下多脈管炎和Churg-Strauss綜合征等疾病患者的體內(nèi)都能夠檢測(cè)到ANCA。應(yīng)用IFA方法檢測(cè)ANCA時(shí)，在乙醇固定的中性粒細(xì)胞基質(zhì)中可以觀察到cANCA和pANCA等熒光表現(xiàn)。前者表現(xiàn)為細(xì)胞胞質(zhì)顆粒陽(yáng)性且在核小葉部位明顯增強(qiáng)，而后者則表現(xiàn)為細(xì)胞核周邊連續(xù)線性的熒光。ANCA常規(guī)檢測(cè)中除了開(kāi)展IFA篩查實(shí)驗(yàn)之外，由于抗PR3抗體和抗MPO抗體對(duì)系統(tǒng)性血管炎具有良好的診斷特異性，而且抗體的滴度與疾病的活動(dòng)度具有明確相關(guān)性[12]。因此，在臨床實(shí)踐中作為重要的ANCA靶抗原確認(rèn)實(shí)驗(yàn)而廣泛開(kāi)展定量檢測(cè)。

自1990年，F(xiàn)alk和Jennette等發(fā)現(xiàn)PR3和MPO等靶抗原后，ELISA方法一直以來(lái)都被作為抗MPO抗體和抗PR3抗體檢測(cè)的主要方法。ELISA作為20世紀(jì)70年代的傳統(tǒng)免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)，存在明顯的方法學(xué)局限性，包括特異性較低、檢測(cè)線性范圍有限和僅能實(shí)現(xiàn)半定量檢測(cè)等。近年來(lái)，新的免疫學(xué)技術(shù)已經(jīng)逐步應(yīng)用到臨床自身抗體檢測(cè)實(shí)踐中。CLIA檢測(cè)技術(shù)作為目前臨床免疫檢測(cè)的主流技術(shù)，由于具有全自動(dòng)、全定量、隨機(jī)上樣、靈活組合和質(zhì)控更嚴(yán)等顯著優(yōu)勢(shì)和特點(diǎn)，已經(jīng)在包括腫瘤標(biāo)記物、傳染病、性激素和甲狀腺功能等免疫學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域發(fā)揮重要的臨床價(jià)值。

本研究采用CLIA檢測(cè)技術(shù)對(duì)臨床申請(qǐng)ANCA檢測(cè)的常規(guī)樣本開(kāi)展抗MPO抗體和抗PR3抗體檢測(cè)，同時(shí)將檢測(cè)結(jié)果與IFA及ELISA檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析。在所有入組242例樣本中，無(wú)論是CLIA還是ELISA與IFA方法學(xué)相比較，陽(yáng)性符合率均低于75%(CLIA為60.7%，ELISA為73.6%)。IFA作為篩查實(shí)驗(yàn)由于所包含的抗原譜更廣泛，因此與CLIA和ELISA等靶抗原確認(rèn)實(shí)驗(yàn)相比較具有更好的檢測(cè)敏感性。在臨床實(shí)踐中，針對(duì)ANCA相關(guān)抗體檢測(cè)時(shí)，IFA方法應(yīng)始終作為首選篩查實(shí)驗(yàn)開(kāi)展。但基于IFA而檢測(cè)出的cANCA和pANCA，在臨床應(yīng)用方面由于均不具備明確的疾病特異性，因此需要應(yīng)用CLIA或ELISA等方法進(jìn)行抗MPO抗體和抗PR3抗體的定量或半定量的確認(rèn)，從而提高ANCA在臨床中的疾病特異性。與此同時(shí)，采用CLIA及ELISA等定量及半定量的檢測(cè)方法，還可以獲得抗體濃度的數(shù)值，為臨床針對(duì)系統(tǒng)性血管炎患者的疾病診斷、病情監(jiān)測(cè)、預(yù)后及復(fù)發(fā)判斷提供更加重要的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

應(yīng)用CLIA與ELISA對(duì)抗MPO抗體和抗PR3抗體檢測(cè)時(shí)，兩種方法在抗MPO抗體的檢測(cè)結(jié)果上均保持良好的一致性(陽(yáng)性符合率81.9%，陰性符合率98.8%，總符合率93.8%)和相同的檢測(cè)敏感度(62.2%)。但在抗PR3抗體的檢測(cè)結(jié)果顯示兩種方法學(xué)的陽(yáng)性符合率偏低(僅為35.1%)，而且CLIA的檢測(cè)敏感度(21.3%)略低于ELISA(29.8%)。上述差異可能是由于下列幾個(gè)原因?qū)е拢?1)不同反應(yīng)體系和不同反應(yīng)原理所引起的結(jié)果差異。與ELISA相比較，CLIA以納米級(jí)的磁微粒作為抗原和抗體反應(yīng)的液相載體，因此具備更良好的反應(yīng)效率、更完整的抗原抗體結(jié)合及更徹底的清洗步驟，從而確保整體反應(yīng)體系的特異性。由于抗PR3抗體和抗MPO抗體的檢測(cè)為ANCA中最常見(jiàn)的靶抗原確認(rèn)實(shí)驗(yàn)，因此在方法學(xué)選擇上應(yīng)該更加注重特異性的考量。(2)不同方法學(xué)中所使用的檢測(cè)抗原不同而導(dǎo)致結(jié)果差異。本研究中ELISA檢測(cè)法為了提高檢測(cè)的敏感度采用的是重組PR3及天然PR3抗原混合包被的方式。而CLIA所采用的抗原為天然的PR3抗原[13]。抗原之間的差異可能是導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果之間差異的原因之一。從本研究的結(jié)果來(lái)看，盡管ELISA在檢測(cè)抗PR3抗體的敏感度略優(yōu)于CLIA，但特異性卻顯著下降。(3)在CLIA反應(yīng)體系中，借助生物素和親和素作為載體實(shí)現(xiàn)PR3抗原在納米磁性微球的間接包被，因此能夠更好地確?？乖Y(jié)構(gòu)不會(huì)由于ELISA在微孔板中的直接包被而導(dǎo)致的抗原構(gòu)想改變。上述兩種方法學(xué)在檢測(cè)抗PR3抗體時(shí)的檢測(cè)差異樣本應(yīng)用第三方驗(yàn)證試劑進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明第三方驗(yàn)證試劑的檢測(cè)結(jié)果與CLIA檢測(cè)更加符合。

綜上所述，由于抗MPO抗體和抗PR3抗體缺乏公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)參考方法，因此不同檢測(cè)方法之間的結(jié)果可能存在差異?？紤]到抗MPO抗體和抗PR3抗體對(duì)于SSV患者疾病診斷、病情進(jìn)展及預(yù)后判斷等具有至關(guān)重要的作用和價(jià)值，因此建議在實(shí)驗(yàn)室針對(duì)上述兩種抗體的檢測(cè)方法學(xué)選擇之前，應(yīng)同時(shí)結(jié)合IFA抗體篩查實(shí)驗(yàn)結(jié)果、樣本的臨床診斷信息以及方法學(xué)的具體特點(diǎn)(包括自動(dòng)化、線性范圍、隨機(jī)上樣等)因素進(jìn)行嚴(yán)格的判斷和評(píng)價(jià)。

[1]Davies DJ，Moran JE，Niall JF，et al. Segmental necrotising glomerulonephritis with antineutrophil anti-body: possible arbovirus aetiology?[J]. Br Med J (Clin Res Ed), 1982, 285: 606.

[2]Jenne DE，Tschopp J，Ludemann J，et al. Wegener’s autoantigen decoded[J]. Nature, 1990, 346: 520.

[3]Jennette JC，Hoidal JR，F(xiàn)alk RJ. Specificity of anti-neutrophil cytoplasmic autoantibodies for proteinase 3[J]. Blood, 1990, 75: 2263- 2264.

[4]Hagen EC，Daha MR，Hermans J，et al. Diagnostic value of standardized assays for anti-neutrophil cytoplasmic antibodies in idiopathic systemic vasculitis. EC/BCR Project for ANCA Assay Standardization[J]. Kidney Int, 1998, 53: 743- 753.

[5]McLaren JS，Stimson RH，McRorie ER，et al. The diagnostic value of anti-neutrophil cytoplasmic antibody testing in a routine clinical setting[J]. QJM, 2001, 94: 615- 621.

[6]Vassilopoulos D，Niles JL，Villa-Forte A，et al. Prevalence of antineutrophil cytoplasmic antibodies in patients with various pulmonary diseases or multiorgan dysfunction[J]. Arthritis Rheum, 2003, 49: 151- 155.

[7]Savige J，Dimech W，F(xiàn)ritzler M，et al. Addendum to the International Consensus Statement on testing and reporting of antineutrophil cytoplasmic antibodies. Quality control guidelines, comments, and recommendations for testing in other autoimmune diseases[J]. Am J Clin Pathol, 2003, 120: 312- 318.

[8]Savige J，Gillis D，Benson E，et al. International Consensus Statement on Testing and Reporting of Antineutrophil Cytoplasmic Antibodies (ANCA)[J]. Am J Clin Pathol, 1999, 111: 507- 513.

[9]Zafrir Y，Gilburd B，Carrasco MG，et al. Evaluation of an automated chemiluminescent immunoassay kit for antinuclear antibodies in autoimmune diseases[J]. Immunol Res, 2013, 56: 451- 456.

[10] Bentow C，Lakos G，Rosenblum R，et al. Clinical performance evaluation of a novel, automated chemiluminescent immunoassay, QUANTA Flash CTD Screen Plus[J]. Immunol Res, 2015, 61: 110- 116.

[11] Webb T，Lakos G，Swart A，et al. Clinical evaluation of a novel chemiluminescent immunoassay for the detection of anti-citrullinated peptide antibodies[J]. Clin Chim Acta, 2014, 437: 161- 167.

[12] Bosch X，Guilabert A，F(xiàn)ont J. Antineutrophil cytoplasmic antibodies[J]. Lancet, 2006, 368: 404- 418.

[13] Damoiseaux J，Dahnrich C，Rosemann A，et al. A novel enzyme-linked immunosorbent assay using a mixture of human native and recombinant proteinase- 3 significantly improves the diagnostic potential for antineutrophil cytoplasmic antibody-associated vasculitis[J]. Ann Rheum Dis, 2009, 68: 228- 233.