色譜-質(zhì)譜技術(shù)在生物分析研究中的最新進(jìn)展

張祥民(復(fù)旦大學(xué)化學(xué)系,生物醫(yī)學(xué)研究院, 上海 200433)

鄒漢法研究員紀(jì)念專輯(下)·聚 焦

色譜-質(zhì)譜技術(shù)在生物分析研究中的最新進(jìn)展

張祥民*
(復(fù)旦大學(xué)化學(xué)系,生物醫(yī)學(xué)研究院, 上海 200433)

本文對(duì)近期色譜-質(zhì)譜相關(guān)技術(shù)和方法學(xué)研究進(jìn)展進(jìn)行簡(jiǎn)略評(píng)述。由于色譜方法研究和應(yīng)用領(lǐng)域十分廣泛,涉及方方面面,本文僅簡(jiǎn)要介紹色譜、多維色譜及其與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在生物物質(zhì)分析領(lǐng)域(主要是人類染色體蛋白質(zhì)組、糖蛋白、磷酸化蛋白質(zhì)組)的研究工作，此外還包括體積排阻色譜分離病毒顆粒、量子點(diǎn)、肝素方面的研究和多維氣相色譜分析進(jìn)展及其他亮點(diǎn)文章。

最近有專輯[1]報(bào)道了人類染色體蛋白質(zhì)組的研究。人類染色體蛋白組計(jì)劃(CHPP)的目標(biāo)瞄準(zhǔn)人類基因組編碼的19 467個(gè)蛋白質(zhì),鑒定其中盡可能多的蛋白質(zhì)。從過(guò)去的4年來(lái)看,該蛋白質(zhì)組計(jì)劃獲得的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)從2013年的13 664個(gè)逐年增加到2016年的16 537個(gè)高置信度蛋白質(zhì)。該數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)了嚴(yán)格的人類蛋白質(zhì)組計(jì)劃質(zhì)譜數(shù)據(jù)解析標(biāo)準(zhǔn)(2.14版)的驗(yàn)證。人類基因組預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)中，85%已得到質(zhì)譜和多重方法的確認(rèn),那些還沒(méi)有得到驗(yàn)證的丟失蛋白質(zhì)(missing proteins)仍然在持續(xù)發(fā)現(xiàn)之中,其中2 663個(gè)丟失蛋白質(zhì)的線索正在通過(guò)國(guó)際數(shù)據(jù)庫(kù)PeptidesAtlas重新分析。

糖蛋白有重要作用,例如改變蛋白質(zhì)功能、調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)相互作用和蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)率,而糖鏈結(jié)構(gòu)與疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān),其中非正常序列結(jié)構(gòu)是疾病或癌癥的關(guān)鍵標(biāo)志物。Zhou等[2]發(fā)展了糖蛋白的定量標(biāo)記新方法,采用aminoxy TMT(aminoxy tandem mass tag)標(biāo)記試劑,同時(shí)編碼標(biāo)記定量6種糖鏈結(jié)構(gòu)的糖蛋白,用0.2 mol/L NaCl溶液顯著增強(qiáng)鈉加合物的離子化效率。經(jīng)過(guò)色譜分離與質(zhì)譜條件的優(yōu)化,作者分離檢測(cè)了血清中的少量N-糖鏈,確定了該方法在食管疾病中的診斷作用。

相對(duì)分子質(zhì)量較大的多肽鑒定一直是一項(xiàng)困難的工作,由于其不能酶解、電荷少,鑒定比較困難。近期,Lin等[3]報(bào)道了一種納流高效液相色譜-質(zhì)譜分析方法,分離鑒定高相對(duì)分子質(zhì)量的糖肽。該方法發(fā)展了一種超強(qiáng)離子化試劑硝基芐醇(m-NBA),將其加入流動(dòng)相中可顯著增強(qiáng)相對(duì)分子質(zhì)量較大的，特別是酸性糖基化肽的電離效果。含有唾液酸的糖肽提高效果尤其明顯。通過(guò)對(duì)生物工程在大腸桿菌中表達(dá)的糖蛋白的分析,鑒定到的糖肽含有98個(gè)單糖的糖鏈結(jié)構(gòu)。驗(yàn)證了反相液相色譜流動(dòng)相中添加m-NBA可有效增強(qiáng)糖蛋白的鑒定效果。

Shubhakar等[4]報(bào)道了一種糖鏈全甲基化的高通量鑒定方法,該方法經(jīng)過(guò)自動(dòng)化的流程對(duì)糖鏈進(jìn)行全甲基化處理,平均每分鐘完成一個(gè)樣品的分析。對(duì)免疫球蛋白(IgG4)單克隆抗體和重組人紅細(xì)胞生成素(rhEPO)的分析驗(yàn)證了方法的可靠性。通過(guò)親水作用色譜和超高效液相色譜分析驗(yàn)證了方法的準(zhǔn)確性,其有望在藥物篩選和臨床標(biāo)志物研究等方面獲得應(yīng)用。

Tanabe等[5]開(kāi)展了多巖藻糖化蛋白與肝癌的相關(guān)性研究。研究發(fā)現(xiàn)早期的肝癌不僅與甲胎蛋白(AFP)的異常升高相關(guān),還與多巖藻糖化的α-1-酸糖蛋白有密切關(guān)系。對(duì)27例乙肝、26例丙肝、27例健康志愿者血液中的糖蛋白組進(jìn)行分析,采用超濾和凝集素親和色譜處理、色譜-質(zhì)譜分離鑒定,在3萬(wàn)多糖肽中篩選出了α-1-酸糖蛋白分子,該分子具有多個(gè)巖藻糖結(jié)構(gòu)和四天線結(jié)構(gòu),在乙肝和丙肝導(dǎo)致的肝癌病人的血液樣本中異常升高。

Karner等[6]研究了黏膜炎莫拉菌,它通過(guò)膜蛋白黏附在人的呼吸道上皮細(xì)胞上，感染形成慢性阻塞性肺病和急性中耳炎等疾病。作者采用碳酸鈉溶液提取外層質(zhì)膜泡囊,通過(guò)納流液相色譜、多維色譜-質(zhì)譜進(jìn)行分離鑒定。氨基葡萄糖糖苷(GAGs)在侵入人體細(xì)胞時(shí)發(fā)揮著關(guān)鍵作用,作者重點(diǎn)對(duì)GAGs親和的膜蛋白組進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)了潛在的抗原蛋白組和疫苗結(jié)合蛋白質(zhì)。同時(shí),還發(fā)現(xiàn)了一批新的潛在免疫抗原蛋白質(zhì)。

磷酸化蛋白在生命調(diào)控過(guò)程中的作用非常廣泛,其分離鑒定研究仍然十分活躍。Zarei等[7]研究發(fā)展了基于靜電排斥-親水作用色譜(ERLIC)分離磷酸化肽的新方法。第一步,多磷酸化肽根據(jù)其負(fù)電荷多少在離子排斥-親水作用模式下依次分離;第二步,強(qiáng)陽(yáng)離子交換(SCX)色譜再次分離單磷酸化肽。鑒于SCX色譜的交換能力較強(qiáng),可以分離那些單磷酸化肽和少數(shù)負(fù)電荷少的肽,使各種磷酸化肽組分得到更完全的分離和鑒定。該方法還可以通過(guò)固相萃取柱在2 h內(nèi)實(shí)現(xiàn)餾分化分級(jí)。

鹽和pH是目前離子交換色譜的主要淋洗方式,Adachi等[8]研究開(kāi)發(fā)了一種酸梯度洗脫分離磷酸化肽的新方法。作者采用C18-SCX StageTip為分離介質(zhì),分別對(duì)比了酸和鹽梯度洗脫的效果。實(shí)驗(yàn)表明,采用酸梯度洗脫能從2 mg樣品中分離鑒定到22 000個(gè)磷酸化肽,比傳統(tǒng)方法獲得更多的蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果,而且方法簡(jiǎn)單、成本低、易自動(dòng)化、無(wú)需復(fù)雜的技術(shù)設(shè)備。

與蛋白質(zhì)組研究密切相關(guān)的、多維色譜分離基礎(chǔ)上的蛋白質(zhì)譜檢測(cè)定量技術(shù)得到不斷發(fā)展。Ruedi Aebersold研究組[9]發(fā)展了SWATH-MS (sequential windowed acquisition of all theoretical fragment ion mass spectra)技術(shù),大幅提高了蛋白組分析的通量和重復(fù)性。近期,他們[9]又推出了用于蛋白質(zhì)組定量的TRIC(Transfer of Identification Confidence)軟件技術(shù)。通過(guò)質(zhì)譜碎片離子數(shù)據(jù)構(gòu)建交叉校正方法,采用連續(xù)峰提取定量獲得更加準(zhǔn)確的定量結(jié)果。TRIC技術(shù)能夠得到更加精確的數(shù)據(jù),校正點(diǎn)不超過(guò)3個(gè)即可解決色譜出峰過(guò)程中的濃度非均勻性問(wèn)題。人誘導(dǎo)干細(xì)胞的蛋白組分析結(jié)果表明,不經(jīng)校正即可自動(dòng)分析、定量輕/重同位素標(biāo)記的不同蛋白質(zhì)組中數(shù)千種蛋白質(zhì)峰對(duì)。

在定量蛋白質(zhì)組研究方面的常用定量軟件MaxQuant近期又有新的技術(shù)升級(jí)[10],其中包括提供不同定量方法、控制最小假陽(yáng)性率(FDRs),以及翻譯后修飾(PTMs)分析等功能。該軟件可以網(wǎng)上免費(fèi)獲取(http://www.maxquant.org)。

體積排阻色譜在分離大的生物分子和顆粒物方面具有特殊作用。Vajda等[11]研究了體積排阻色譜(SEC)分離流感病毒顆粒的新方法。血凝反應(yīng)檢測(cè)是廣泛用于流感活性檢測(cè)的方法,但是它不能觀察到病毒顆粒大小。SEC分離基礎(chǔ)上的檢測(cè)便可以獲得相關(guān)的重要信息。流動(dòng)相中添加200 mmol/L的精氨酸或氯化鈉可以獲得完全分散的病毒顆粒,檸檬酸鈉則可以導(dǎo)致病毒聚集。H1N1病毒的數(shù)量與DNA含量在5 ng/mL到670 ng/mL之間有很好的關(guān)聯(lián)度。餾分中病毒含量得到紅細(xì)胞凝聚活性測(cè)定的驗(yàn)證。3種流感疫苗株(H1N1v 5258、H1N1 PR/8/34和H3N2 Aichi/2/68)依據(jù)病毒顆粒的大小經(jīng)過(guò)SEC分離和活性檢測(cè),獲得了更重要的病毒相關(guān)信息。

量子點(diǎn)(QD)納米材料廣泛用于生物分子熒光標(biāo)記跟蹤和細(xì)胞成像等。龐代文實(shí)驗(yàn)室[12]采用SEC發(fā)展了量子點(diǎn)分離純化技術(shù)。作者采用高效SEC對(duì)辛胺接枝聚丙烯酸修飾的量子點(diǎn)進(jìn)行分離,將量子點(diǎn)與團(tuán)聚量子點(diǎn)和聚合物分開(kāi);分離后的量子點(diǎn)穩(wěn)定性大幅增加。隨后,作者對(duì)量子點(diǎn)、量子點(diǎn)與鏈霉親和素(SA)和免疫球蛋白(IgG)分別結(jié)合形成復(fù)合物QD-SA和QD-IgG進(jìn)行分離,并將分離制備的兩種復(fù)合物用于腫瘤標(biāo)志物的切片檢測(cè),效果非常好,無(wú)非特異性吸附現(xiàn)象。該方法對(duì)生物探針的制備、分離、純化有重要的應(yīng)用價(jià)值。

Zaia等[13]采用體積排阻色譜-離子抑制質(zhì)譜分離檢測(cè)了低分子量肝素類化合物的成分。肝素作為重要的治療藥物,一直被廣泛應(yīng)用于治療凝血功能障礙。隨著國(guó)際專利過(guò)期,應(yīng)用肝素制備的新藥已經(jīng)獲得美國(guó)FDA(Food and Drug Administration)批準(zhǔn)。作者發(fā)展了針對(duì)含有30個(gè)以內(nèi)寡糖并具有精確相對(duì)分子質(zhì)量的肝素類化合物單體測(cè)定方法,采用離子抑制池除鹽,體積排阻色譜餾分直接用電噴霧質(zhì)譜鑒定,可以圓滿解決肝素的分析問(wèn)題。

全二維氣相色譜(GC×GC)技術(shù)研究也有不少新進(jìn)展。Luong等[14]發(fā)展了新的GC×GC系統(tǒng),采用了不依賴溫度的調(diào)制調(diào)節(jié)器(TiM)。該系統(tǒng)采用熱電制冷和云母制熱技術(shù),無(wú)需液氮冷凍,增大補(bǔ)充氣流可以有效改善色譜操作參數(shù),有利于分別控制第一維和第二維色譜柱達(dá)到最佳分離效率。調(diào)節(jié)再進(jìn)樣效率還有利于第一維色譜的反吹,加快消除柱子的背景干擾。TiM技術(shù)可用于nC6～nC24范圍的揮發(fā)性化合物的分析。對(duì)苯、甲苯、乙苯和二甲苯的測(cè)定結(jié)果表明,第一維和第二維結(jié)果的重復(fù)性分別達(dá)到0.009%和0.008%(n=10),標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于4.7%。

Tian等[15]研究開(kāi)發(fā)了用于GC×GC/time of flight (TOF)-MS的數(shù)據(jù)處理軟件系統(tǒng)(GC2MS)。該系統(tǒng)基于網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)開(kāi)發(fā),可以有效利用網(wǎng)上數(shù)據(jù)信息,特別是代謝組學(xué)數(shù)據(jù),能獲得各種GC×GC/TOF-MS質(zhì)譜圖譜數(shù)據(jù)信息。通過(guò)比較圖譜的相似性、校正基線獲得圖譜的關(guān)聯(lián)度。GC2MS可用于不同條件下人血漿樣品中當(dāng)歸中化合物的分析,表明該數(shù)據(jù)系統(tǒng)具有高效性和實(shí)用性。

Zimmermann實(shí)驗(yàn)室[16]采用GC×GC技術(shù)研究了人呼出氣體中的揮發(fā)性有機(jī)物。利用真空紫外吸收光譜(VUV)檢測(cè)化合物類型。系統(tǒng)優(yōu)化了吸收池體積和氣體流速,取得了高靈敏度和高分辨率。同時(shí),將VUV檢測(cè)器與TOF-MS進(jìn)行了比較,其峰寬達(dá)到300 ms,檢出限達(dá)到ng以下級(jí)別。采用針頭捕集微萃取(NTME)采樣,測(cè)定了人血糖變化過(guò)程中呼出氣體的組成變化,對(duì)臨床應(yīng)用具有重要意義。

在色譜柱制備技術(shù)方面,Lincoln等[17]近期研究了基于兩維“柱狀”陣列的色譜分離系統(tǒng)。采用多孔二氧化硅層增加比表面積,降低相比,提高色譜保留能力。柱狀填料多孔層厚20～250 nm,采用光刻和等離子增強(qiáng)化學(xué)氣相沉積法制備,再采用十八烷基三氯硅烷或正丁基二甲基氯硅烷鍵合反應(yīng)制備反相表面。理論計(jì)算表明,50 nm厚的多孔層可提高比表面積120倍。實(shí)際樣品的保留測(cè)試也表明,隨著多孔層厚度的增加,樣品的保留顯著增大。對(duì)熒光衍生的胺類化合物的兩維分離驗(yàn)證了該平面色譜的高效分離能力。

Jorgenson研究組[18]報(bào)道了一種超長(zhǎng)、超高效毛細(xì)管液相色譜柱的勻漿裝柱技術(shù)。高濃度的填料勻漿液和超聲震蕩是形成高均一填充床、獲得高效柱的途徑。作者利用200 mg/mL的2.02微米填料勻漿液填充了6根長(zhǎng)1 m、內(nèi)徑75 μm的柱子,其中3根在超聲條件下獲得了折合塔板高度為1.05的結(jié)果。這表明高濃度勻漿填料加超聲可以制備超長(zhǎng)、超高效毛細(xì)管液相色譜柱。

色譜-質(zhì)譜分析技術(shù)還用于研究人的生活習(xí)性、活動(dòng)范圍，以及與人群之間的物質(zhì)交換等。Petras等[19]采用色譜-質(zhì)譜采集了大量日常生活中接觸的環(huán)境和物體上殘留的化合物樣品,以此分析數(shù)據(jù)用于關(guān)聯(lián)人的生活習(xí)慣和各種活動(dòng)空間、接觸物體等。通過(guò)對(duì)居住的房間、開(kāi)的車(chē)、光顧的飯店、工作的實(shí)驗(yàn)室和辦公室等環(huán)境中接觸到的各種化學(xué)物質(zhì)和人體釋放的化學(xué)物質(zhì)的分析,可以從人群中描繪出一個(gè)人每天的各種習(xí)慣和留下的蹤跡,得到三維空間模型中各種接觸點(diǎn)(如門(mén)把手、自行車(chē)把手等)和皮膚接觸到的物體(如自行車(chē)架等)。大約50%的化合物來(lái)自其他人群和環(huán)境中的物質(zhì)。從中可以發(fā)現(xiàn)個(gè)人使用的化妝品、塑料用品、清洗劑、食物和食品添加劑,甚至吃的藥物等線索。這一研究在法醫(yī)學(xué)、醫(yī)療保健、建筑設(shè)計(jì)、空間探索與環(huán)境應(yīng)用中均有重要價(jià)值。

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10.3724/SP.J.1123.2016.11012

2016-11-14

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(2016YFA0501402).

Foundation item: China State Key Research Grant (No. 2016YFA0501402).

*通訊聯(lián)系人.E-mail:xmzhang@fudan.edu.cn.