毛細(xì)管電泳與化學(xué)發(fā)光檢測聯(lián)用方法的研究進(jìn)展

易 方, 黃香宜, 任吉存(上海交通大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院, 金屬基復(fù)合材料國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 200240)

鄒漢法研究員紀(jì)念專輯(下)·專論與綜述

毛細(xì)管電泳與化學(xué)發(fā)光檢測聯(lián)用方法的研究進(jìn)展

易 方, 黃香宜*, 任吉存*
(上海交通大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院, 金屬基復(fù)合材料國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 200240)

毛細(xì)管電泳由于其超高的分離效率廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥、環(huán)境監(jiān)測、食品科學(xué)以及公共安全等領(lǐng)域。然而,由于毛細(xì)管電泳具有進(jìn)樣量較少、檢測光程較短等缺點(diǎn),需要與高靈敏度檢測器聯(lián)用實(shí)現(xiàn)低濃度樣品的分析?；瘜W(xué)發(fā)光檢測由于其背景信號(hào)低而具有超高的靈敏度。毛細(xì)管電泳-化學(xué)發(fā)光檢測聯(lián)用方法將毛細(xì)管電泳的高效分離特性與化學(xué)發(fā)光檢測的高靈敏性相結(jié)合,成為一種非常重要的分析方法,廣泛用于化學(xué)分析、藥物篩選以及環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域。該文對(duì)近年來毛細(xì)管電泳-化學(xué)發(fā)光檢測聯(lián)用方法的基本原理進(jìn)行概述,并對(duì)其發(fā)展趨勢(shì)和應(yīng)用前景進(jìn)行了展望。

毛細(xì)管電泳;化學(xué)發(fā)光檢測;綜述

毛細(xì)管電泳(capillary electrophoresis, CE)是一類以毛細(xì)管為分離通道、以高壓直流電場為驅(qū)動(dòng)力的新型液相分離分析技術(shù)。CE迅速發(fā)展于20世紀(jì)80年代后期,是分析科學(xué)中繼高效液相色譜之后的又一重大進(jìn)展,是最有效的分析方法之一。它使分析科學(xué)得以從微升水平進(jìn)入納升水平,并使單細(xì)胞乃至單分子分析成為可能。芯片毛細(xì)管電泳(microchip capillary electrophoresis, MCE)是在常規(guī)毛細(xì)管電泳原理和技術(shù)的基礎(chǔ)上,利用微加工技術(shù)在平方厘米級(jí)大小的芯片上加工出各種微細(xì)結(jié)構(gòu),通過不同的通道、反應(yīng)器、檢測單元等設(shè)計(jì)和布局,實(shí)現(xiàn)樣品進(jìn)樣、反應(yīng)和分離檢測的微型實(shí)驗(yàn)裝置。

CE和MCE相對(duì)于常規(guī)分析方法具有分析時(shí)間短、樣品及試劑用量少和分離效率高等特點(diǎn),已廣泛用于化學(xué)和生物分析、藥物分析、環(huán)境以及食物分析等領(lǐng)域。然而,極少的樣品量對(duì)檢測靈敏度提出了更高的要求。對(duì)CE和MCE而言,選擇合適的檢測器是非常重要的。紫外可見吸收檢測法具有良好的通用性,通常作為商品化毛細(xì)管電泳儀的常規(guī)檢測器。但是紫外可見吸收檢測法靈敏度較低,加上毛細(xì)管內(nèi)徑細(xì)小、檢測光程短等不足,導(dǎo)致該檢測方法的靈敏度不能滿足某些低含量生物樣品檢測的要求[1]。目前,某些更靈敏的檢測方法得以發(fā)展,比如激光誘導(dǎo)熒光檢測[2-4]、電化學(xué)檢測[5,6]、質(zhì)譜檢測[7]等。其中激光誘導(dǎo)熒光檢測和質(zhì)譜檢測具有高靈敏度,但設(shè)備成本較高,使其應(yīng)用受到一定的限制;電化學(xué)檢測具有高靈敏度且成本較低,但具有一些如電極表面污染等應(yīng)用限制[8]。因此,發(fā)展高靈敏、高選擇性的微體積檢測方法非常重要。

化學(xué)發(fā)光(chemiluminescence,CL)檢測方法是指在沒有外加光源的情況下,由化學(xué)反應(yīng)過程提供能量,從而產(chǎn)生光輻射來進(jìn)行定量分析的方法。CL檢測方法因其分析速度快、線性范圍寬、儀器設(shè)備簡單及易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化等特點(diǎn),成為痕量分析領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。與其他的光學(xué)檢測方法相比,CL檢測由于沒有來自光源雜散光的干擾,可獲得極低的檢測噪聲,因此被認(rèn)為是最靈敏的檢測方法之一[9]。CE-CL聯(lián)用方法實(shí)現(xiàn)了CE高效分離與CL高靈敏度檢測的結(jié)合,并具有以下優(yōu)點(diǎn)[10]: (1)背景信號(hào)低,檢出限可達(dá)到單分子水平,且具有與激光誘導(dǎo)熒光檢測方法相當(dāng)?shù)母哽`敏度;(2)具有較寬的線性范圍,有利于對(duì)分析物進(jìn)行定量分析;(3)不需要光源,儀器的配制更簡單。

CE-CL聯(lián)用方法已經(jīng)成功應(yīng)用于無機(jī)和有機(jī)化合物的定量分析,主要包括金屬離子、藥物、氨基酸、核酸以及蛋白質(zhì)的分析研究[11]。本文對(duì)近年來CE-CL聯(lián)用方法的研究和發(fā)展進(jìn)行了總結(jié)與展望。

1 CE-CL聯(lián)用的發(fā)光體系

1.1 魯米諾體系

到目前為止,luminol-CL體系在CE-CL檢測系統(tǒng)中應(yīng)用最為廣泛,已用于金屬離子、有機(jī)小分子、糖類和蛋白質(zhì)等物質(zhì)的檢測分析。Albrecht[13]早在1928年提出luminol及其衍生物在堿性溶液(pH=10～11)中加入H2O2時(shí)可以觀測到微弱的藍(lán)色發(fā)光(發(fā)射波長425～435 nm)現(xiàn)象。加入適當(dāng)?shù)拇呋瘎?如Co(Ⅱ)、Fe(Ⅱ)、Mn(Ⅱ)、Cu(Ⅱ)、辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)等,可以極大地提高CL強(qiáng)度。H2O2、K3[Fe(CN)6]、NaClO、KIO4和KMnO4等氧化劑可以誘導(dǎo)luminol反應(yīng)并產(chǎn)生CL信號(hào)[20]。在該體系中,luminol與氧化劑在堿性條件下反應(yīng),而大部分金屬離子在堿性環(huán)境中會(huì)生成氫氧化物沉淀,失去對(duì)luminol的催化作用。為了避免沉淀,可以將堿性電泳緩沖液換成酸性電泳緩沖液,之后再增加pH值。Zhang等[21]將這種方法用于分析異煙肼和對(duì)氨基水楊酸。這兩種分析物在luminol-H2O2反應(yīng)體系中可以提高Cu2+的催化能力,增強(qiáng)的CL信號(hào)分別與這兩種分析物的濃度成比例。

K3[Fe(CN)6]在luminol反應(yīng)中也是合適的氧化劑和催化劑。在luminol-K3[Fe(CN)6]反應(yīng)體系中,Han等[22]利用米托蒽醌在CL反應(yīng)中的增敏作用提高了分析方法的靈敏度,將該方法成功用于人血漿和尿液樣品中米托蒽醌的檢測。進(jìn)而,該課題組[23]證明了在沒有任何催化劑的條件下,煙酰胺可以有效抑制luminol-K3[Fe(CN)6]體系的發(fā)光強(qiáng)度,并通過CE-CL聯(lián)用方法快速、可靠、靈敏地對(duì)煙酰胺進(jìn)行微量檢測,成功應(yīng)用于食品、血漿樣品中的檢測。Zhu等[24]發(fā)現(xiàn)KIO4在K3[Fe(CN)6]的催化下可以快速與luminol發(fā)生反應(yīng),luminol-KIO4-K3[Fe(CN)6]反應(yīng)體系在0.65 s內(nèi)完成CL反應(yīng)。Mu等[25]利用甲狀腺素(thyroxine,T4)在堿性條件下對(duì)luminol-KMnO4反應(yīng)體系CL信號(hào)的增強(qiáng)作用,檢測了正常人與甲亢患者以及甲狀腺功能衰退患者血清中T4的含量。結(jié)果表明,甲亢患者血清中T4的含量高于正常人的含量,而甲狀腺功能衰退者血清中T4的含量低于正常人的含量。因此,該方法可以快速地對(duì)甲亢患者或甲狀腺功能衰退患者進(jìn)行初步診斷。

1.2 PO體系

PO反應(yīng)中,PO在熒光基團(tuán)的存在下被H2O2氧化,生成一種雙氧基中間體儲(chǔ)能物,隨后發(fā)生能量轉(zhuǎn)移至熒光基團(tuán),該熒光基團(tuán)發(fā)出高量子產(chǎn)率的熒光[8]。熒光標(biāo)記方法很容易應(yīng)用于PO-CL反應(yīng)體系中,因此利用該體系可以檢測熒光標(biāo)記的化合物[26]。PO在高效液相色譜中已經(jīng)廣泛應(yīng)用,但由于其在水溶液中溶解度較低且不穩(wěn)定,故在CE的應(yīng)用中受到一定限制[20]。Zhu等[27]提出了基于雙(2,4,6-三氯苯基)草酸酯-H2O2反應(yīng)體系的CE-CL檢測系統(tǒng)。該系統(tǒng)可以在7 min內(nèi)對(duì)羅丹明6G(R6G)及其水解產(chǎn)物R6G-COOH進(jìn)行有效分離,對(duì)R6G的堿性水解過程進(jìn)行監(jiān)測并對(duì)速率常數(shù)和活化能進(jìn)行估算。Tsuge等[26]在CE-CL檢測體系中同時(shí)引入luminol和PO,對(duì)異硫氰酸熒光素、異魯米諾異硫氰酸鹽以及這兩種試劑標(biāo)記的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析。

1.3 吖啶酯體系

吖啶類衍生物具有很高的CL量子產(chǎn)量以及超低的背景信號(hào),且衍生化過程簡單、快速,常用于免疫分析。通常采用的體系是吖啶酯-H2O2體系,即用吖啶酯或吖啶磺酰胺標(biāo)記抗原或抗體,用HNO3、H2O2和NaOH作為發(fā)光啟動(dòng)試劑。Guo等[28]采用吖啶酯標(biāo)記的多肽和蛋白質(zhì)來測定刻蝕的毛細(xì)管接口孔徑。Wang等[16]通過CE-CL聯(lián)用方法實(shí)現(xiàn)了人尿液中多巴胺和西布特羅的分離檢測。該方法采用吖啶酯作為衍生化試劑,分析過程在400 s之內(nèi)完成,檢出限分別為2.0和0.50 μg/L。

1.4 直接氧化體系

1.5 釕(Ⅱ)聯(lián)吡啶體系

2 CE-CL檢測模式

由于不需要光源,CE-CL及MCE-CL檢測系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)相對(duì)簡單,檢測部分像常規(guī)CL測試方法一樣僅由一個(gè)光電倍增管組成。然而,把CL檢測應(yīng)用于CE或MCE系統(tǒng)中最大的挑戰(zhàn)是如何在線引入一種或兩種CL試劑。因此,構(gòu)建適合的CL試劑引入和檢測界面對(duì)CE-CL檢測系統(tǒng)的靈敏度和分離效率具有重要影響。一般按照檢測窗口和接地電極相對(duì)位置的不同,將接口分為在柱檢測模式、離柱檢測模式和柱端檢測模式等。

在柱檢測模式[37,38]由于其較高的靈敏度和分離效率成了CE-CL系統(tǒng)常用的檢測模式。在柱式接口大都采用套管式設(shè)計(jì),即分離毛細(xì)管的末端插入內(nèi)徑稍大的反應(yīng)毛細(xì)管中。1991年,Hara等[39]首次將在柱式接口與CE-CL聯(lián)用,Dadoo等[40]隨后對(duì)這一體系進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。Whang等[41,42]所用的接口有所不同,分離毛細(xì)管的末端不需要?dú)浞峥涛g,直接插入反應(yīng)毛細(xì)管中,在反應(yīng)毛細(xì)管上燒刻光窗即可。由于該模式的檢測窗口一般位于電泳電路之間,因此在高壓下不穩(wěn)定的發(fā)光試劑不適用于該裝置。為了解決這一問題,Jiang等[43]對(duì)蓄液池進(jìn)行改進(jìn),將運(yùn)行緩沖池和電解池用電介質(zhì)陶瓷連接在一起,實(shí)現(xiàn)了對(duì)煙草樣品中綠原酸和蘆丁含量的檢測。

離柱檢測模式[44,45]的檢測窗口遠(yuǎn)離電泳高壓電源,位于接地電極的后方,主要采用的是柱后套管式。柱后套管式與在柱套管式類似,均將分離毛細(xì)管插入內(nèi)徑稍大的反應(yīng)毛細(xì)管中,但是檢測窗口和接地電極的相對(duì)位置不同。為了解決CL試劑受電壓影響的問題,Lee等[44]在毛細(xì)管上設(shè)計(jì)一個(gè)斷口,用醋酸纖維酯覆蓋形成多孔聚合物接點(diǎn)并插入一個(gè)裝滿緩沖液且?guī)в须姌O的瓶子內(nèi),實(shí)現(xiàn)了電泳高壓分離區(qū)與CL檢測區(qū)的分離。Lin等[46]將離柱式接口置于光電倍增管(photomultiplier tube, PMT)前方,接口由兩塊不同厚度的有機(jī)玻璃板和一些不同大小的分離、反應(yīng)毛細(xì)管組成。該方法成功應(yīng)用于4種血色素蛋白質(zhì)的分離及檢測,并實(shí)現(xiàn)了對(duì)人尿液樣品中肌紅蛋白的測定。

柱端檢測模式[47,48]實(shí)際是在柱檢測模式的一種,最大的特點(diǎn)是緩沖液、發(fā)光試劑、接地電極、檢測窗口及分離毛細(xì)管出口集中于一個(gè)儲(chǔ)液池內(nèi)。這種接口的接地電極與檢測窗口的相對(duì)位置重合。雖然該模式搭建簡單且具有較高的靈敏度,但試劑更換較為頻繁。另外,由于CL試劑是靜止的,導(dǎo)致分析物的峰形拖尾和展寬從而使分離效率降低。Wang等[49]提出了一種旋轉(zhuǎn)式反應(yīng)池(見圖1)。池內(nèi)有一個(gè)石英底的圓形窄通道用于盛CL試劑,相當(dāng)于一個(gè)反應(yīng)槽。分離毛細(xì)管位于反應(yīng)槽底部附近,這樣分離出來的樣品可以與CL試劑發(fā)生反應(yīng)。PMT位于反應(yīng)通道的下方以檢測CL信號(hào)。該實(shí)驗(yàn)采用HRP和血紅蛋白這兩種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)樣品對(duì)接口性能進(jìn)行評(píng)估。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,該方法具有較高的靈敏度和分離度且解決了電泳過程中H2O2電解產(chǎn)生氣泡等問題。

圖1 旋轉(zhuǎn)檢測池的示意圖和照片[49]Fig. 1 Schematic diagram and photographs of the rotary detection cell[49] a and b: top and bottom views; c and d: photos in close and general views. 1. step motor and lead screw; 2. detection cell body; 3. Pt cathode; 4. slit; 5. quartz bottom; 6. photo multiplier tube (PMT); 7. separation capillary; 8. offset between capillary and the slit window.

圖2 (a)在柱斷口、(b)在柱斷口/柱端反應(yīng)接口和(c)傳統(tǒng)的柱端CE-CL接口示意圖[50]Fig. 2 Schematic diagrams of (a) the on-column fractureassembly, (b) the on-column fracture/end-column reaction interface and (c) the conventional end-column capillary electrophoresis-chemiluminescence (CE-CL) interface[50] H: height; HV: high voltage.

Xu等[50]提出一種新的接口方式,可以分別完成CE分離和CL檢測條件的優(yōu)化。他們將在柱裂縫浸于陰極緩沖液池內(nèi)完成電路連接并用作CL試劑加入口,再將毛細(xì)管末端插入柱端蓄池內(nèi)完成CL反應(yīng)及檢測,其結(jié)構(gòu)見圖2。這種設(shè)計(jì)結(jié)合了離柱式和柱端式接口的優(yōu)點(diǎn),并且消除了各自的局限性。通過吖啶酯-luminol反應(yīng)體系對(duì)該接口適用性進(jìn)行評(píng)估,結(jié)果發(fā)現(xiàn)該方法較之前的接口方式表現(xiàn)出更好的分析性能。Xie等[51]設(shè)計(jì)了一種新型的固定化酶檢測接口,通過利用共價(jià)鍵合作用將HRP固定于醛基紙膜上,在自行設(shè)計(jì)的固定化酶發(fā)光流通池中催化luminol-H2O2-溴酚藍(lán)CL體系。該實(shí)驗(yàn)將含有巰基的β-環(huán)糊精修飾的納米金作為固定相涂于毛細(xì)管內(nèi)壁中制作開管毛細(xì)管電色譜柱,并采用三乙胺催化生物胺與N-(4-氨基丁基)-N-乙基異魯米諾(ABEI)的衍生反應(yīng),通過開管毛細(xì)管電色譜-CL聯(lián)用技術(shù)對(duì)人體唾液及尿液樣品進(jìn)行了分析檢測。

3 應(yīng)用

CE與CL聯(lián)用系統(tǒng)自20世紀(jì)90年代出現(xiàn)以來就一直受到廣泛關(guān)注,并應(yīng)用于藥物分析[16,34,52-80]、蛋白質(zhì)分析[81-84]、細(xì)胞分析[85-90]以及基于納米材料的分析[91-101]等領(lǐng)域。

3.1 藥物分析

液相色譜法在藥物檢驗(yàn)中應(yīng)用廣泛,但系統(tǒng)操作和維護(hù)較為復(fù)雜,并消耗大量的有機(jī)溶劑。CE-CL聯(lián)用方法由于其費(fèi)用低、操作簡單、分析時(shí)間短等特點(diǎn)成了藥物檢測的一種新方法,其原理主要基于藥物對(duì)CL反應(yīng)的增強(qiáng)或抑制效應(yīng)。近年來,CE-CL檢測用于藥物分析的部分研究如表1所示[16,34,52-79]。

表1 近年來CE-CL檢測在藥物分析中的應(yīng)用Table 1 Applications of CE-CL in drug analysis in recent years

CN: cyanide; ABEI:N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol; HRP: horseradish peroxidase; DPC: diperiodatocuprate (Ⅲ); bpy: bipyridine; AuNPs: Au nanoparticles.

Zhao等[52,62,64-66,68-73]對(duì)CE-CL聯(lián)用方法在藥物方面的應(yīng)用做了一系列深入研究,他們提出了一種簡單快速的方法檢測蘋果汁以及人體尿液中的葉酸[68]。該方法基于葉酸對(duì)luminol-BrO-反應(yīng)體系的增強(qiáng)效應(yīng)。該方法在20 min之內(nèi)完成對(duì)葉酸的測定,檢出限達(dá)到2.0×10-8mol/L,峰面積和遷移時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.5%和1.1%。他們還通過這種簡單快速的方法檢測藥物制劑及生物流體中的左旋多巴[69]。該方法主要基于左旋多巴對(duì)luminol-K3[Fe(CN)6]反應(yīng)體系的增強(qiáng)效應(yīng)。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下,線性范圍為5.0×10-8～2.5×10-6mol/L,檢出限為2.0×10-8mol/L。

Zhu等[74]基于維生素B12對(duì)luminol-H2O2反應(yīng)體系的催化活性建立了CE-CL檢測方法。在對(duì)藥品中維生素B12的加標(biāo)回收試驗(yàn)中,回收率達(dá)到了97%～106%。

Wang等[75]采用CE-CL檢測方法測定藥品和人血漿中的黃酮類化合物(蘆丁和槲皮素)的含量。蘆丁和槲皮素可以增強(qiáng)luminol-K3[Fe(CN)6]反應(yīng)體系中的CL信號(hào),兩種物質(zhì)的檢出限分別為1和5 nmol/L。該方法還可以對(duì)復(fù)雜樣品中黃酮類化合物進(jìn)行定量分析。

過渡金屬在高氧化態(tài)時(shí)不穩(wěn)定,Wang等[76]將二過碘酸合銅(Ⅲ)鉀(K5[Cu(HIO6)2], DPC)用于CE-CL系統(tǒng)中檢測多巴胺。該方法主要基于多巴胺增強(qiáng)luminol-DPC體系的CL信號(hào)。多巴胺的檢出限達(dá)6.0×10-6g/L,較于之前用其他方法檢測多巴胺的報(bào)道,該方法具有更高的靈敏度。DPC可以增強(qiáng)luminol-H2O2的CL反應(yīng)并產(chǎn)生強(qiáng)烈的CL信號(hào)。基于此,Fu等[80]建立了一種CE-CL快速檢測體系對(duì)luminol和ABEI進(jìn)行同時(shí)檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該方法可以用于檢測復(fù)雜的生物樣品,在生物醫(yī)學(xué)和藥物分析等領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。

3.2 蛋白質(zhì)分析

蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ),與各種形式的生命活動(dòng)緊密聯(lián)系在一起。因此對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離和分析在生命科學(xué)方面具有重要意義。

Zhou等[81]采用CE-CL聯(lián)用方法研究血紅素(hemoglobin,Hb)和H2O2的反應(yīng)過程。該方法基于Hb和Fe3+對(duì)H2O2-CL反應(yīng)體系的增強(qiáng)作用對(duì)Hb和Fe3+進(jìn)行檢測。Hb和H2O2反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生熒光產(chǎn)物導(dǎo)致Hb釋放Fe3+。在該反應(yīng)過程中,有一個(gè)中間產(chǎn)物可以顯著增強(qiáng)luminol-H2O2反應(yīng)體系的CL信號(hào)。Fe3+、Hb及該中間產(chǎn)物的最大CL信號(hào)比大約為1∶10∶60。

為了解決蛋白質(zhì)非特異性吸附問題,Liu等[82]設(shè)計(jì)了一種動(dòng)態(tài)涂層CE-CL檢測系統(tǒng)。聚乙烯吡咯烷酮具有易溶于水且黏度低于其他高分子溶液的特點(diǎn),可以輕松注入毛細(xì)管且涂覆于毛細(xì)管內(nèi)壁。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,注入聚乙烯吡咯烷酮后可以很大程度抑制蛋白質(zhì)吸附并降低電滲流。涂層的毛細(xì)管至少可以連續(xù)30次注入蛋白質(zhì)樣品并具有良好的重復(fù)性。該方法成功用于檢測溶血病患者血清中Hb的濃度,檢出限為2.0 mg/L。

Zhang等[83]采用HRP標(biāo)記乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)形成HBsAg*,引入對(duì)碘苯酚增強(qiáng)CL反應(yīng)。該方法分別采用競爭免疫和非競爭免疫形式檢測人體血清中HBsAg與乙型肝炎表面抗體(HBsAb)。游離的HBsAg*和結(jié)合的HBsAg*-HBsAb在6 min內(nèi)通過CE分離,HBsAg和HBsAb的檢出限分別為0.4 pmol/L和1 IU/L。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與酶聯(lián)免疫吸附測定的結(jié)果相一致,證明CE-CL免疫測定法在臨床診斷上具有可行性。Liu等[84]同樣采用CE-CL免疫測定法分析腫瘤標(biāo)記物甲胎蛋白。甲胎蛋白抗原與過量HRP標(biāo)記的抗體Ab*反應(yīng),游離的Ab*與生成的Ab*-Ag通過CE在4 min內(nèi)完成分離,檢出限為0.85 μg/L。

3.3 細(xì)胞分析

分析單細(xì)胞內(nèi)組分及其行為特征有助于了解基本的細(xì)胞功能,而微流控芯片的微米尺寸通道適合單細(xì)胞的引入、反應(yīng)、分離及檢測。因此,CE-CL、MCE-CL分離分析方法適用于單細(xì)胞分析。

本課題組[85]提出采用CE-CL檢測方法對(duì)單個(gè)紅細(xì)胞內(nèi)Hb的含量進(jìn)行測定,并對(duì)細(xì)胞注射流程進(jìn)行了改善。通過該方法檢測了人血液樣本中Hb的含量,線性范圍為1.7～6.8 mg/L,檢出限為0.17 mg/L(乘以進(jìn)樣體積之后約為2.2 pg)。通過對(duì)26個(gè)人體紅細(xì)胞樣本統(tǒng)計(jì)表明,單個(gè)紅細(xì)胞中Hb的平均含量為23.6 pg。

圖3 20種氨基酸的電泳圖譜[87]Fig. 3 Electropherogram of the 20 amino acids[87] Peaks: 1. Arg; 2. Lys; 3. Ala; 4. Pro+Val; 5. Leu+Ile; 6. Phe+His; 7. Tyr; 8. Gln+Met; 9. Ser; 10. Asn; 11. Thr; 12. Cys; 13. Gly; 14. Trp; 15. Glu; 16. Asp.

Zhao等[86]采用MCE-CL方法對(duì)紅細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽的含量進(jìn)行測定。首先采用重氮luminol標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)的谷胱甘肽,然后單細(xì)胞進(jìn)樣,在線加電壓解離。樣品通過MCE分離后,與次溴酸鈉發(fā)生氧化反應(yīng)產(chǎn)生CL。檢出限達(dá)5×10-20mol,線性范圍為2×10-18～9.0×10-17mol。相較于之前報(bào)道的激光誘導(dǎo)熒光方法檢測單細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽含量,該方法更簡單,且靈敏度高出100倍左右。該課題組還提出了一種高靈敏度的方法測定單個(gè)人體血紅細(xì)胞中氨基酸的含量[87],圖3是采用該方法分析20種氨基酸的電泳圖譜。發(fā)現(xiàn)在luminol-NaBrO-QD(quantum dots)體系中具有高效的能量共振轉(zhuǎn)移,并且受到生物胺類、生物硫醇、氨基酸及有機(jī)酸等的有效抑制。生物胺類的檢出限可達(dá)10-9mol/L,生物硫醇、有機(jī)酸、雌激素及天然氨基酸的檢出限為10-8mol/L。結(jié)果表明,該方法比之前報(bào)道的MCE-CL檢測法、電化學(xué)法等的靈敏性高10～1 000倍。

Zhao等[88]采用同樣的方法,檢測了大鼠肝細(xì)胞中抗壞血酸和氨基酸(色氨酸、甘氨酸和丙氨酸)的含量。這些物質(zhì)在130 s內(nèi)完成分離,在單個(gè)大鼠肝細(xì)胞中的含量分別為38.3、5.15、3.78和3.84 fmol。同樣,Ye等[89]對(duì)大鼠纖維肉瘤細(xì)胞中?；撬岷桶被?丙氨酸、甘氨酸、色氨酸、谷氨酸和天冬氨酸)的含量也進(jìn)行了檢測。除此之外,他們還對(duì)血紅細(xì)胞中的巰基化合物(半胱氨酸、谷胱甘肽和Hb)含量進(jìn)行了測定[90],檢出限分別為7、32和69 amol。對(duì)正常人及癌癥患者的血紅細(xì)胞分析結(jié)果表明,癌癥患者血紅細(xì)胞內(nèi)半胱氨酸、谷胱甘肽的含量均高于正常人。因此可以通過該方法量化血紅細(xì)胞內(nèi)的半胱氨酸和谷胱甘肽,為癌癥臨床診斷提供一種方法。

圖4 Ab*與免疫復(fù)合物的電泳圖譜[94]Fig. 4 Electropherograms of Ab*and the immunocomplex[94] Lines a, b, c, and d correspond to 0, 0.1, 0.5, and 3.0 μg/mL human IgG, respectively; Line e: blank. Peaks: 1. Immunocomplex; 2. free Ab*; X. unknown compounds.

3.4 基于納米材料的分析

納米材料如AuNPs[91-96]、QDs[97-99]、氧化石墨烯[100](grapheme oxide, GO)以及納米介孔二氧化硅(mesoporous silica nanoparticles, MSN)[101]等已經(jīng)用于高靈敏度CE-CL的檢測中。

Liu等[94]提出基于AuNPs的CE-CL免疫實(shí)驗(yàn)方法檢測人血清中免疫球蛋白G。該方法采用對(duì)luminol-H2O2反應(yīng)體系有催化作用的AuNPs來標(biāo)記蛋白質(zhì)。AuNPs和抗體Ab結(jié)合形成標(biāo)記抗體Ab*, Ab*隨后與抗原Ag反應(yīng)生成Ab*-Ag,圖4為Ab*與免疫復(fù)合物的電泳圖譜。過量的Ab*及Ab*-Ag在5 min內(nèi)完成分離和檢測,檢出限為1.14×10-3mg/L?；诖?Liu等[95]隨后提出了基于核酸適配體(aptamer,Apt)的CE-CL方法對(duì)人免疫球蛋白E進(jìn)行檢測,檢出限達(dá)到7.6 fmol/L,線性范圍為0.025～250 pmol/L。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該方法可用于生物樣品中蛋白質(zhì)的高靈敏度檢測。

Jiang等[96]用AuNPs作為載體、luminol-H2O2為發(fā)光體系的非競爭性免疫分析方法檢測人體血清中的癌胚胎抗原(carcinoembryonic antigen, CEA)。AuNPs結(jié)合HRP共同標(biāo)記癌胚胎抗體Ab*并與CEA共同孵育。隨后通過CE-CL系統(tǒng)對(duì)CEA-Ab*-AuNPs和過量的Ab*-AuNPs進(jìn)行分離和定量分析。通過對(duì)碘苯酚增強(qiáng)以及AuNPs放大luminol-H2O2-HRP系統(tǒng)的CL信號(hào)使得CL檢測具有高靈敏度,檢出限達(dá)到0.034 μg/L。

QD具有很好的光電學(xué)性能,被用于高靈敏CE-CL分析技術(shù)中。Zhou等[98]提出一種測定CEA的新方法,主要采用QD修飾Apt探針。DNAA與DNAB為一對(duì)互補(bǔ)的核酸序列。HRP-DNAA首先與QD-DNAB形成HRP-DNAA-B-QD探針。當(dāng)CEA存在時(shí),DNAA中Apt與CEA特異性結(jié)合形成CEA/HRP-DNAA-B-QD復(fù)合物。HRP-DNAA-B-QD探針和CEA/HRP-DNAA-B-QD復(fù)合物通過CE分離后,CEA/HRP-DNAA-B-QD復(fù)合物在無任何干擾下催化CL,通過CL強(qiáng)度可以估算該復(fù)合物濃度。該方法中,QD的引入解決了游離HRP-DNAA-B-QD探針干擾的問題,為分離檢測生物分子提供了新的思路。Zhang等[99]采用CE-CL檢測方法同時(shí)檢測5-羥吲哚乙酸和5-羥色胺。CdTe(cadmium telluride) QDs和HRP共同催化luminol-H2O2CL反應(yīng),增強(qiáng)CL信號(hào)強(qiáng)度,而微量的5-羥吲哚乙酸和5-羥色胺可以抑制CL。目前,該方法已經(jīng)成功對(duì)人體尿液中5-羥吲哚乙酸和5-羥色胺進(jìn)行檢測,檢出限分別為7.0和6.0 nmol/L。

Zhou等[100]以GO為載體、luminol-H2O2為發(fā)光體系對(duì)CEA進(jìn)行檢測(見圖5)。當(dāng)無CEA存在時(shí),HRP-Apt與GO混合產(chǎn)生能量共振轉(zhuǎn)移從而淬滅CL;當(dāng)CEA存在時(shí),HRP-Apt與CEA特異性結(jié)合形成HRP-Apt-CEA復(fù)合物,從GO上分離。隨后該復(fù)合物催化產(chǎn)生CL而沒有檢測到任何能量轉(zhuǎn)移。該方法通過HRP-Apt吸附在GO上解決了游離HRP-Apt的干擾問題,同時(shí)GO對(duì)CL的影響可以通過CE解決。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,CL強(qiáng)度與CEA的濃度呈線性關(guān)系,線性范圍為0.065 4～6.54 μg/L,檢出限為4.8 ng/L。該方法具有較高的特異性,為生物大分子的分離和測定提供了新方法,在生化分析中有很好的應(yīng)用潛力。

圖5 基于Apt/GO CE-CL檢測方法檢測CEA的示意圖[100]Fig. 5 Schematic depiction of detection of carcinoembryonic antigen (CEA) based on aptamer/grapheme oxide (Apt/GO) by CE-CL[100]

圖6 納米介孔二氧化硅可控釋放系統(tǒng)與CL檢測技術(shù)聯(lián)用系統(tǒng)檢測可卡因的示意圖[101]Fig. 6 Schematic illustration of the mesoporous silicananoparticles (MSN) based controlled release system coupled with luminol/H2O2CL system for cocaine determination[101]

納米介孔二氧化硅具有較高的比表面積,較高的孔隙率,孔徑分布均勻且小,表面富含活性羥基,在孔內(nèi)和孔外實(shí)現(xiàn)各種官能團(tuán)化以及良好的生物兼容性等特點(diǎn),在藥物可控釋放方面具有廣泛的應(yīng)用前景。Chen等[101]首次將納米介孔二氧化硅可控釋放系統(tǒng)與CL檢測技術(shù)聯(lián)用,建立了一個(gè)靈敏的生物傳感器并成功應(yīng)用于人尿液中可卡因的檢測(見圖6)。在該方法中,首先將MSN載體與葡萄糖溶液混合,MSN壁與葡糖糖分子之間的強(qiáng)烈作用力使大量葡萄糖分子負(fù)載于介孔孔道內(nèi);之后帶正電荷的MSN與帶負(fù)電荷的寡核苷酸(可卡因Apt)反應(yīng)關(guān)閉了MSN孔,形成“孔帽”。當(dāng)可卡因存在時(shí),可卡因與其Apt間的特異性識(shí)別,導(dǎo)致“孔帽”移走,孔道內(nèi)的葡萄糖釋放出來。釋放出的葡萄糖在葡萄糖氧化酶的存在下與氧氣反應(yīng)產(chǎn)生葡萄糖酸與H2O2,后者可以增強(qiáng)luminol的CL,檢出限達(dá)到1.43 μmol/L。該方法可以通過設(shè)計(jì)不同的分子探針實(shí)現(xiàn)對(duì)不同藥物的檢測。

3.5 其他

CE-CL聯(lián)用檢測方法還應(yīng)用于金屬離子[102,103]、氨基酸[88,104,105]、糖類[106]、有機(jī)小分子[107-110]等領(lǐng)域的分析。

CE-CL檢測方法最初多用于對(duì)金屬離子的分離分析,主要基于金屬離子對(duì)luminol-H2O2反應(yīng)體系的催化作用。Yang等[102]采用luminol-H2O2反應(yīng)體系測定水中污染金屬離子Cr(Ⅲ)、Cr(Ⅵ)。他們將Cr(Ⅵ)轉(zhuǎn)化為Cr(Ⅲ),實(shí)現(xiàn)分離檢測,Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)的檢出限分別為6×10-13和8×10-12mol/L。

基于Cu(Ⅱ)-氨基酸復(fù)合物在堿性條件下對(duì)luminol-H2O2反應(yīng)體系的增強(qiáng)作用,Lin等[104]采用加壓毛細(xì)管電色譜與CL聯(lián)用方法對(duì)L-組氨酸、L-蘇氨酸和L-酪氨酸進(jìn)行分離分析。結(jié)果表明,L-組氨酸、L-蘇氨酸和L-酪氨酸的檢出限分別為6.4×10-7、8.4×10-7和3.0×10-7mol/L。Li等[105]在柱前通過ABEI將生物胺衍生化,并在柱后采用高靈敏度的luminol-H2O2-DPC反應(yīng)體系進(jìn)行檢測。通過該方法得到的背景信號(hào)很低且CL信號(hào)較強(qiáng),靈敏度較其他方法有進(jìn)一步提高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,甘氨酸、脯氨酸和苯基丙氨酸的檢出限分別為3.0×10-8、2.3×10-7和2.1×10-7mol/L。

Tsukagoshi等[106]通過單糖、二糖的二醇基與碘代苯硼酸之間的相互反應(yīng)對(duì)單糖、二糖進(jìn)行分子識(shí)別。其中,碘代苯硼酸可以增強(qiáng)luminol-H2O2-HRP反應(yīng)體系的CL信號(hào),但其與糖類反應(yīng)后會(huì)使CL信號(hào)降低從而成功實(shí)現(xiàn)識(shí)別。相較于傳統(tǒng)的方法,該方法對(duì)于糖類分子識(shí)別所需要的樣品量更少,分析更加快速,并且簡單易操作。

Shu等[109]基于Hb的催化性能,采用CE與Hb-luminol-H2O2的CL體系聯(lián)用方法對(duì)酚類物質(zhì)進(jìn)行分離和檢測。高濃度的NH4OH可以防止Hb的聚集,得到穩(wěn)定的基線信號(hào)。該方法用于對(duì)鄰仲丁基苯酚、苯酚、2,4-二氯苯酚、鄰甲苯酚及間甲苯酚的測定,檢出限在4.8×10-8～7.1×10-8mol/L之間。Lin等[110]基于苯二酚的3種同分異構(gòu)體可以抑制luminol-K3[Fe(CN)6]反應(yīng)體系的CL,對(duì)尿液中苯二酚的3種同分異構(gòu)體(鄰苯二酚、間苯二酚和對(duì)苯二酚)進(jìn)行測定,檢出限分別為2.8×10-8、3.2×10-8和3.7×10-8mol/L。

4 總結(jié)與展望

CL檢測系統(tǒng)因其無需外加光源、不存在熒光分析中瑞利散射和拉曼散射及溶劑熒光雜質(zhì)產(chǎn)生的背景信號(hào),具有較高的信噪比,可獲得與激光誘導(dǎo)熒光檢測相媲美的靈敏度。CE和MCE具有分析速度快,樣品用量少和分離效率高等特點(diǎn)。CE和CL的聯(lián)用兼具高分離效率與高靈敏度的特點(diǎn),已發(fā)展成為一種高效的分離檢測方法。多種可聯(lián)用CE的發(fā)光體系及可用的接口設(shè)計(jì)模式使這一方法得到較快的發(fā)展,在生物制藥、環(huán)境分析和臨床醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域獲得了廣泛的應(yīng)用。

然而,CE-CL聯(lián)用方法的重現(xiàn)性仍然不太理想。這主要是由于該方法的重現(xiàn)性除了與電泳條件相關(guān)外,還受化學(xué)發(fā)光反應(yīng)類型、反應(yīng)物混合模式和反應(yīng)物流速的穩(wěn)定性等因素的影響。另外,相對(duì)紫外可見吸收法和激光誘導(dǎo)熒光法,該方法的線性范圍較窄(約兩個(gè)數(shù)量級(jí))。此外,可以直接參與CL反應(yīng)的待測物種類不多,相關(guān)標(biāo)記技術(shù)也不是很成熟,因此如何擴(kuò)大CE-CL中分析對(duì)象的范圍成了現(xiàn)實(shí)的問題。

目前,CE-CL聯(lián)用方法尚需要在以下幾個(gè)方面繼續(xù)開展研究:(1)設(shè)計(jì)更簡潔的CE-CL聯(lián)用儀器接口,進(jìn)一步提高系統(tǒng)的重現(xiàn)性、便捷性、選擇性和靈敏度。另外,CE-CL聯(lián)用方法可與其他檢測方法如質(zhì)譜聯(lián)用從而獲得更好的性能;(2)將新型的CL試劑和納米材料如AuNPs、QD和熒光高分子納米粒子等應(yīng)用于CE-CL聯(lián)用系統(tǒng),進(jìn)一步拓寬線性范圍,提高靈敏度,擴(kuò)展其應(yīng)用范圍;(3)新方法(如化學(xué)發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移方法)的進(jìn)一步應(yīng)用將為CE-CL聯(lián)用方法提供更高的靈敏度以及進(jìn)一步滿足在復(fù)雜體系中同時(shí)分離檢測多種物質(zhì)的需求;(4)可以嘗試應(yīng)用毛細(xì)管陣列電泳及芯片毛細(xì)管陣列電泳與CL檢測聯(lián)用實(shí)現(xiàn)高通量樣品分析。

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Recent advances in capillary electrophoresis coupledwith chemiluminescence detection

YI Fang, HUANG Xiangyi*, REN Jicun*
(SchoolofChemistryandChemicalEngineering,StateKeyLaboratoryofMetalMatrixComposites,ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai200240,China)

Capillary electrophoresis (CE) is considered as a powerful method in many fields, such as biopharmaceuticals, environmental, food and public security analysis, owing to its high separation efficiency. However, the injection of small sample volumes and the short optical length lead to limited sensitivity. So it is necessary to couple with high sensitivity detector to realize the low concentration sample analysis. Chemiluminescence (CL) detection is characterized by providing low background with excellent sensitivity. By coupling with CL, both the high separation efficiency of CE and the high sensitivity of CL can be achieved at the same time. So far, this method has been widely applied to chemical analysis, drug screening, and environment monitoring. In this review, we briefly introduce some developments for CE-CL systems, and then put the emphasis on the applications in the past decades. Moreover, we discuss the perspectives of CE-CL system.

capillary electrophoresis (CE); chemiluminescence (CL) detection; review

10.3724/SP.J.1123.2016.08043

2016-08-31

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(21075081,21135004);上海市自然科學(xué)基金項(xiàng)目(14ZR1423400).

Foundation item: National Natural Science Foundation of China (Nos. 21075081, 21135004); Shanghai Natural Science Foundation (No. 14ZR1423400).

O658

:A

:1000-8713(2017)01-0110-11

*通訊聯(lián)系人.E-mail:huangxy@sjtu.edu.cn(黃香宜);E-mail:jicunren@sjtu.edu.cn(任吉存).