應(yīng)用HPLC—ICP—MS聯(lián)用法分析飼料中As的四種形態(tài)

陳國++吳銀良

摘 要：應(yīng)用HPLC-ICP-MS聯(lián)用技術(shù)對飼料中四種形態(tài)砷：亞砷酸（AsⅢ）、砷酸（AsⅤ）、一甲基砷酸（MMA）、二甲基砷酸（DMA）進(jìn)行分析。試驗(yàn)結(jié)果表明：方法檢出限低，線性相關(guān)系數(shù)良好，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%。對飼料做了三個水平的添加回收（10μg/kg、50μg/kg和100μg/kg），加標(biāo)回收率均在78.8%～117%。實(shí)際樣品的分析結(jié)果表明，該方法檢出限低，準(zhǔn)確度高，可用于飼料中砷的形態(tài)分析。

關(guān)鍵詞：HPLC-ICP-Ms；飼料；砷形態(tài)

中圖分類號 S132 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-7731（2017）06-0159-04

Determination of Arsenic Species Compounds in Feed by High Performance Liquid Chromatography-inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry

Chen Guo et al.

（Ningbo Academy of Agricultural Sciences，Ningbo 315101，China）

Abstract：A High Performance Liquid Chromatography-inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry（HPLC-ICP-MS） method was applied for determination of arsenite（AsⅢ），arsenate （AsⅤ），monomethy larsonic acid（MMA）and dimethylarsinic acid（DMA） in feed.The results showed that the limits of detection was low，the Correlation coefficients of the curves were good，and the relative standard derivations were less than 10%.The recoveries of the four arsenic species spiked in feed at three levels（10μg/kg、50μg/kg和100μg/kg） ranged from 78.8%～117%.The results showed that the method is much more precise，accurate and durable for the determination of arsenic species in feed.

Key words：High performance liquid chromatography-inductively coupled plasma mass spectrometry；Feed；Arsenic species

無機(jī)及有機(jī)砷化合物在工農(nóng)業(yè)中的廣泛應(yīng)用，使得相當(dāng)數(shù)量的砷進(jìn)入環(huán)境，并通過化學(xué)或生物過程在各砷化合物之間循環(huán)，常見的砷化合物包括：亞砷酸（AsⅢ）、砷酸（AsⅤ）、一甲基砷酸（MMA）、二甲基砷酸（DMA）、砷甜菜堿（AB）和砷膽堿（AC）等，不同形態(tài)的砷具有不同毒性，因此，對砷的形態(tài)分析研究越來越多，也備受關(guān)注[1-2]。亞砷酸主要成分As2O3，俗稱砒霜，砷酸毒性次之，一甲基砷酸（MMA）、二甲基砷酸（DMA）已被證明是潛在的致癌物質(zhì)，而砷甜菜堿（AB）和砷膽堿（AC）則被認(rèn)為無毒的。目前，有機(jī)砷制劑作為一種飼料添加劑廣泛應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)，有機(jī)砷類制劑具有刺激動物生長的作用，而且具有較廣的抗菌譜，可以改善肉類品質(zhì)[3-4]。所以，按照飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)（GB13078-2001）對畜禽飼料中的總砷測定，很難反應(yīng)畜禽飼料質(zhì)量安全狀況，對飼料中亞砷酸（AsⅢ）、砷酸（AsⅤ）、一甲基砷酸（MMA）、二甲基砷酸（DMA）進(jìn)行形態(tài)分析就顯得尤為重要。目前，對于砷的形態(tài)的分析，目前應(yīng)用的最為先進(jìn)的方法為HPLC-ICP-Ms聯(lián)用技術(shù)。它將HPLC高效分離的特點(diǎn)和ICP-Ms對于重金屬元素的檢出限低、線性范圍寬以及同時測定多種元素相結(jié)合，對于不同形態(tài)的重金屬測定取得了良好的效果。目前HPLC-ICP-Ms聯(lián)用技術(shù)已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用于蔬果[5]、稻米[6]、中藥[7]、肉類[8-9]、煙草[10]、土壤[11]、水[12]、水產(chǎn)品[13-14]中不同形態(tài)的砷以及食鹽中不同形態(tài)的碘[15]、肉類中不同形態(tài)的硒[16]含量的測定。但是對于飼料中不同形態(tài)砷的測定卻鮮有報道。本文采取1%硝酸溶液浸提，應(yīng)用HPLC-ICP-Ms法聯(lián)用技術(shù)對砷的形態(tài)進(jìn)行分離、測定，取得了良好的效果。

1 試驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與裝置 350D型電感耦合等離子質(zhì)譜儀（ICP-MS）：美國PE公司，配有碰撞模式和反應(yīng)模式兩種干擾消除模式；2695型高效液相色譜儀：美國WATERS公司；Milli-Q超純水儀：美國Millipore公司；3K15型離心機(jī)：德國SIGMA公司；Quiuti X124型電子天平：賽多利斯。

1.2 主要材料與試劑 硝酸（優(yōu)級純蘇州晶瑞化學(xué)股份有限公司），磷酸（優(yōu)級純國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），氫氧化銨（優(yōu)級純 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），實(shí)驗(yàn)用水為Mili-Q高純水。

As形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)溶液：亞砷酸、砷酸、一甲基砷酸、二甲基砷酸均購于中國計量科學(xué)研究院。4種砷形態(tài)混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液：用純水將砷形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稀釋為質(zhì)量濃度均為2mg/L（以As計）的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，置于4℃冰箱中避光保存。As形態(tài)混合工作液現(xiàn)用現(xiàn)配。

實(shí)驗(yàn)室飼料樣品隨機(jī)采購于當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場。

1.3 試驗(yàn)條件

1.3.1 HPLC條件 色譜柱：HAMILTON 79433 PRP-100X，10μm*4.1×250mm。等度洗脫流動相：15mmol/L磷酸二氫銨溶液（pH6.0）（配制方式：1L超純水中加1.67g磷酸，用氫氧化銨調(diào)節(jié)pH值6.0），流速：2.0mL/min，進(jìn)樣體積：100μL。

1.3.2 ICP-MS條件 RF入射功率1600W，等離子體氣體流速18L/min，輔助氣流速1.2L/min，霧化氣流量1.0L/min，檢測質(zhì)量數(shù)m/z=75（As），分兩種模式采集數(shù)據(jù)，（standard模式：RPa=0，RPq=0.25；KED模式：He：3.2mL/min，RPa=0，RPq=0.25）。

1.4 樣品預(yù)處理 稱取0.50g仔豬飼料樣品，于50mL塑料離心管中，加入20mL 1%硝酸溶液浸提，放置過夜。于90℃恒溫箱中熱浸提2.5h，期間0.5h振蕩1min。取出冷卻至室溫，8 000r/min離心15min，吸取上清液，用0.45μm有機(jī)膜過濾后待測。樣液經(jīng)HPLC分離后，ICP-MS法測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜分離條件選擇 亞砷酸（AsⅢ）、砷酸（AsⅤ）、一甲基砷酸（MMA）、二甲基砷酸（DMA）呈弱酸或中強(qiáng)酸，在適宜的pH值條件下以陰離子的形式存在，適用陰離子交換機(jī)理來分離陰離子。HAMILTON 79433 PRP-100X陰離子交換柱對砷化物具有較好的分離效果，應(yīng)用Standard（圖1）和KED（圖2）模式對標(biāo)準(zhǔn)品（AsⅢ、DMA、MMA、As）測定了4種As形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖，均取得了良好的效果。

2.2 質(zhì)譜條件的選擇 試驗(yàn)采用standard模式和KED模式進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，從圖譜比對結(jié)果看，在standard模式下，ArCl（分子量74.9112）并未對樣品中As（分子量74.9216）分析形成干擾，采用standard模式，靈敏度更高，線性相關(guān)系數(shù)r2>0.999，達(dá)到分析要求。

2.3 線性和檢出限 分別配置不同形態(tài)砷的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液：標(biāo)準(zhǔn)溶液1：AsⅢ、AsⅤ、MMA、DMA，ρ=1.0μg/L，標(biāo)準(zhǔn)溶液2：AsⅢ、AsⅤ、MMA、DMA，ρ=2.0μg/L，標(biāo)準(zhǔn)溶液3：AsⅢ、AsⅤ、MMA、DMA，ρ=5.0μg/L，標(biāo)準(zhǔn)溶液4：AsⅢ、AsⅤ、MMA、DMA，ρ=10.0μg/L，標(biāo)準(zhǔn)溶液5：AsⅢ、AsⅤ、MMA、DMA，ρ=20.0μg/L，得到不同形態(tài)砷標(biāo)準(zhǔn)圖譜（圖3）和回歸方程（表1）。由表可見，線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r2>0.999。

取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用1% HNO3稀硝酸逐級稀釋，直至色譜圖中四種形態(tài)色譜峰的信噪比（S/N）約為3的濃度為該種形態(tài)砷的儀器檢出限。取樣量為0.5g，定容體積為20mL時，方法檢出限見table.1。

圖3 系列標(biāo)準(zhǔn)溶液分離圖譜疊加效果圖

表1 不同形態(tài)砷標(biāo)準(zhǔn)溶液回歸方程和方法檢出限

[形態(tài)分析＼&線形關(guān)系＼&r2＼&LOD /（μg/kg）＼&As（Ⅲ）＼&y=192.352x+446.477＼&0.999782＼&2.0＼&As（Ⅴ）＼&y=836.026x+301.382＼&0.999162＼&2.4＼&MMA＼&y=982.112x+308.179＼&0.999983＼&2.2＼&DMA＼&y=1181.77x+499.274＼&0.999319＼&2.2＼&]

2.4 樣品分析 精密稱取飼料樣品0.5g，按照上述方法進(jìn)行6次平行測定，得到樣品色譜圖（圖4）樣品中As（Ⅲ）含量為20.2μg/L，As（Ⅴ）含量為96.6μg/L，RSD分別為2.37%和4.89%，均未檢出MMA和DMA，重復(fù)性良好。試驗(yàn)過程進(jìn)行了三種水平添加回收試驗(yàn)，得到相關(guān)數(shù)據(jù)見表2，從表中得到高、中、低三個濃度的加標(biāo)回收率都在78.8%～117%之間，RSD<10%。

圖4 飼料樣品色譜

表2 不同水平添加回收試驗(yàn)結(jié)果

[Speciations＼&Original

（μg/kg）＼&Added

（μg/kg）＼&Found

（μg/kg）＼&Recover（%）＼&RSD（n=3） （%）＼&As（Ⅲ）＼&20.2＼&10＼&28.3＼&81.0＼&5.06＼&50＼&65.7＼&91.0＼&4.55＼&100＼&115＼&94.8＼&3.08＼&DMA＼&ND＼&10＼&10.3＼&103＼&2.78＼&50＼&48.5＼&97.0＼&3.08＼&100＼&98.7＼&98.7＼&3.22＼&MMA＼&ND＼&10＼&9.80＼&98.0＼&1.23＼&50＼&47.3＼&94.6＼&6.35＼&100＼&96.5＼&96.5＼&6.88＼&As（Ⅴ）＼&96.6＼&10＼&110.3＼&117＼&2.34＼&50＼&136＼&78.8＼&5.55＼&100＼&178＼&81.4＼&7.38＼&]

3 小結(jié)

本實(shí)驗(yàn)建立了HPLC-ICP-Ms聯(lián)用技術(shù)同時測定了飼料中4種砷的形態(tài)（亞砷酸（AsⅢ）、砷酸（AsⅤ）、一甲基砷酸（MMA）、二甲基砷酸（DMA））的分析方法。以1%硝酸水溶液為提取劑，HAMILTON 79433 PRP-100X陰離子交換柱對4種形態(tài)的砷進(jìn)行分離，ICP-Ms檢測，4種砷形態(tài)化合物的檢出限為2.0～2.4μg/kg，方法RSD均小于10%，加標(biāo)回收率在78.8%～117%。通過對實(shí)際樣品的分析，該方法操作簡單、快捷，方法的靈敏度和準(zhǔn)確度均較高。由此可見，本方法適合于飼料中4種形態(tài)砷的準(zhǔn)確定性、定量分析。

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（責(zé)編：張長青）