嗜熱厭氧細菌Caldicellulosiruptor bescii降解木質(zhì)纖維素研究進展

儲引娣 蘇小運

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，北京 100081）

嗜熱厭氧細菌Caldicellulosiruptor bescii降解木質(zhì)纖維素研究進展

儲引娣 蘇小運

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，北京 100081）

嗜熱厭氧菌Caldicellulosiruptor bescii具有強大的木質(zhì)纖維素降解能力，能以多種模式植物細胞壁多糖如微晶纖維素Avicel和木聚糖，甚至未經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素如柳枝稷作為唯一碳源快速生長，該菌還具有少見的厭氧降解木質(zhì)素的能力。對基因組注釋發(fā)現(xiàn)，該菌所編碼的蛋白大多為多結(jié)構(gòu)域雙功能酶，即在多肽鏈的N端和C端分別是不同家族的糖苷水解酶，間隔以2-3個碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域。該菌降解纖維素相關(guān)的酶基因多集中于一個植物細胞壁多糖降解利用的基因簇，例如纖維素酶/木聚糖酶、纖維素酶/甘露聚糖酶和纖維素酶/木葡聚糖酶等。C. bescii的木聚糖酶主要屬于GH10家族，該家族的酶底物特異性較為寬泛，氨基酸序列的同源性在18.7%-59.5%間。Caldicellulosiruptor屬細菌進化出了一系列的機制使得糖苷水解酶和底物、細菌和木質(zhì)纖維素能更好的吸附在一起，從而有利于木質(zhì)纖維素的酶解。C. bescii有12個含SLH結(jié)構(gòu)域的蛋白，以及新發(fā)現(xiàn)的黏附蛋白Tāpirin，可能參與了木質(zhì)纖維素的吸附與利用。綜述了近年來對C. bescii降解植物細胞壁的糖苷水解酶的基因資源挖掘方面和降解分子機制方面的研究進展，對高效、多功能高效木質(zhì)纖維素降解酶的設(shè)計和優(yōu)化具有積極的意義。

木質(zhì)纖維素；嗜熱厭氧菌；糖苷水解酶；生物燃料

石油和天然氣等化石能源消耗量巨大，與國民經(jīng)濟各行各業(yè)息息相關(guān)，但由于其不可再生的缺陷，使得化石能源逐漸枯竭。即使如今已經(jīng)發(fā)現(xiàn)頁巖氣和可燃冰能部分的作為替代資源，世界各國仍然在積極地尋找化石能源的替代者，其中可再生的生物質(zhì)，尤其是植物細胞壁成分（包括多糖及木質(zhì)素成分）的高效利用和開發(fā)成為了研究的重點領(lǐng)域之一。歐盟要求到2020年在所有的燃油中添加10%可再生生物燃料［1］，而美國計劃到2025年將30%的燃料從汽油更換為生物燃料［2］。

由于涉及到“與人爭地”和“與人爭糧”等倫理問題，直接將玉米、紅薯等高淀粉糧食作物轉(zhuǎn)化為乙醇的第一代生物燃料技術(shù)一直飽受爭議，而開發(fā)非糧作物如柳枝稷、芒草和利用農(nóng)作物廢棄物如秸稈、稻草、谷殼等資源生產(chǎn)乙醇或高級生物燃料則能實現(xiàn)變廢為寶，具有更好的可持續(xù)性。在此過程中，首先需要將植物生物質(zhì)尤其是植物細胞壁成分中的多糖有效的降解、釋放為可被釀酒酵母、大腸桿菌等工程微生物利用的單糖或寡糖，再經(jīng)體內(nèi)代謝途徑轉(zhuǎn)化為乙醇、高級燃料或高附加值化學(xué)品。使用酶法降解處理植物細胞壁反應(yīng)條件溫和，能很好的契合下游的發(fā)酵過程，但酶的使用成本仍然高企，這限制了開發(fā)植物細胞壁生物質(zhì)生產(chǎn)二代生物燃料。

Caldicellulosiruptor bescii是一株分離于熱泉的革蘭氏陽性細菌，具有耐熱性強（最適生長溫度為75℃）、降解木質(zhì)纖維素能力強的特點。該菌能在多種木質(zhì)纖維素模式多糖如微晶纖維素Avicel和木聚糖上生長；對未經(jīng)預(yù)處理的能源作物柳枝稷，該菌也能有效的利用和快速生長。它甚至還具有罕見的在厭氧狀態(tài)下降解木質(zhì)素的能力。鑒于以上發(fā)現(xiàn)，該菌參與降解植物細胞壁多糖的糖苷水解酶及相應(yīng)的在酶蛋白和微生物層面上降解植物細胞壁多糖的分子機制，近年來得到了廣泛的關(guān)注和研究。

1 菌株的分離和研究歷史

1990年，Svetlichnyi等［3］從俄羅斯堪察加半島的間歇泉山谷一處熱泉中分離得到一株極端嗜熱和嚴格厭氧的革蘭氏陽性細菌，并將其命名為Anaerocellum thermophilum。在發(fā)現(xiàn)之時，人們已經(jīng)意識到該菌具有寬泛的植物多糖利用譜，且其在纖維素上生長最好。1998年，Zverlov等［4］對分離純化自A. thermophilum培養(yǎng)液上清中的雙催化結(jié)構(gòu)域纖維素酶CelA進行了酶學(xué)性質(zhì)表征，并注意到該菌和Caldicellulosiruptor屬細菌代表菌、同樣來自熱泉的Caldicellulosiruptor saccharolyticus具有高度的相似性。雖然如此，直到2009年，美國喬治亞大學(xué)的Yang等［5］在重新評估過去人們所發(fā)現(xiàn)的木質(zhì)纖維素降解菌時，對A. thermophilum做了系統(tǒng)的分析發(fā)現(xiàn)，A. thermophilum DSM6725能夠有效的降解各種未經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素，包括硬木（如白楊）、低木質(zhì)素草本植物（如象草）和高木質(zhì)素草本植物（如柳枝稷）。隨后，該學(xué)者通過細致的分類學(xué)研究證明A.thermophilum和Caldicellulosiruptor saccharolyticus同歸一屬，并將其種名定為“bescii”，其中“besc”是作者所屬美國能源部生物能源科學(xué)中心（BioEnergy Science Center）的首字母縮寫［6］。由于Caldicellulosiruptor bescii最適生長溫度為75℃，且其具有強大的木質(zhì)纖維素降解和利用能力，這意味著該菌的基因組編碼有嗜熱、高效和針對纖維素、木聚糖等多種植物細胞壁多糖的糖苷水解酶。相對于常見的中溫酶，來自于極端嗜熱微生物的酶往往具有催化效率高、抗逆性好和貨架期長等優(yōu)點，因此，隨著第二波生物能源研究熱潮在本世紀初的興起，C. bescii所編碼的酶引人注目，人們在酶基因資源挖掘和在分子生物學(xué)和微生物層面上的降解機制進行了許多研究。2009年，Kataeva等［7］完成了對C.bescii DSM6725菌株的基因組測序。該菌基因組大小為2.97 Mb，另外還含有兩個染色體外的質(zhì)粒，大小分別為8.3和3.6 kb。兩年后，Dam等［8］對其基因組的詳盡分析指出，該菌基因組編碼2 666個蛋白質(zhì)，且其中83%以上蛋白的表達已得到實驗證實；與碳水化合物轉(zhuǎn)運和利用相關(guān)的基因分別為171和88個?；蛩睫D(zhuǎn)移在該菌獲得植物細胞壁多糖降解能力，以及快速適應(yīng)環(huán)境方面可能起到了重要的作用。

2 降解植物細胞壁的糖苷水解酶

2.1 纖維素酶

C.bescii具有強大的木質(zhì)纖維素降解能力，其降解微晶纖維素的能力非常突出。Caldicellulosiruptor屬中不同種的細菌利用木質(zhì)纖維素的能力有所差異：在對7種菌的比較中，Blumer-Schuette等［9］發(fā)現(xiàn)，C.bescii降解并利用微晶纖維素Avicel作唯一碳源在其上生長的能力與C. saccharolyticus相當(dāng)，遠高于其他5種同屬細菌。對C. bescii的基因組注釋發(fā)現(xiàn)，該菌降解纖維素相關(guān)的酶基因多集中于一個植物細胞壁多糖降解利用的基因簇，該基因組所編碼的蛋白大多為多結(jié)構(gòu)域雙功能酶如纖維素酶/木聚糖酶、纖維素酶/甘露聚糖酶和纖維素酶/木葡聚糖酶等。對8個Caldicellulosiruptor屬細菌的基因組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)存在3個核心的多結(jié)構(gòu)域酶，分別為GH9-CBM3c-CBM3b-CBM3b-GH48（CelA 或 CbCel9A/Cel48A）、GH74-CBM3b-CBM3b-GH48和GH9-CBM3b-CBM3b-CBM3b-GH5（CbCel9B/Man5A）；說明這3個酶存在與否與該屬細菌降解纖維素的能力成正相關(guān)［10］。在C.bescii中，這3個多結(jié)構(gòu)域的酶以完整形式存在，而在部分其他種的細菌中，它們則可能以完整或斷裂的形式存在。

同真菌依賴于GH7和GH6等外切纖維素酶（或稱纖維二糖水解酶）分別從還原端或非還原端切割纖維素鏈不同，細菌主要使用GH48外切纖維素酶從末端切割纖維素。GH48纖維素酶對細菌降解利用纖維素的能力早有研究：將嗜熱梭菌里的Cel48S基因敲除大大削弱了其水解纖維素的能力［11］。我們注意到，C. bescii具有豐富的GH48結(jié)構(gòu)域（3個），而纖維素降解能力較弱的Caldicellulosiruptor屬細菌C. hydrothermalis、C. kristjanssonii和 C. owensensis則沒有GH48外切纖維素酶；另外，C. bescii的3個GH48結(jié)構(gòu)域均和其他一個催化結(jié)構(gòu)域形成N端、C端雙催化結(jié)構(gòu)域、多碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域的酶，它們分別是GH9-CBM3c-CBM3b-CBM3b-GH48、GH10-CBM3b-CBM3b-GH48（CbXyn10C/Cel48B） 和GH74-CBM3b-CBM3b-GH48。

GH9家族蛋白是C. bescii中一種重要的內(nèi)切葡聚糖酶，和Caldicellulosiruptor屬中具有最強纖維素降解能力的另外兩個菌類似，C. bescii具有兩個GH9同功酶，其中一個以GH9-CBM3c-CBM3b-CBM3b-GH48形式存在，而在具較弱的纖維素降解能力的同屬其他細菌中則只有1個GH9基因甚至完全缺失。CbCel9B的最適溫度是85℃，最適pH為5.5，C端直接相連的CBM3c和GH9催化結(jié)構(gòu)域形成緊密相互作用的整體，而且，兩個CBM3b也有助于其降解Avicel和濾紙等微晶纖維素［12］。CbCel9A對Avicel的活性強于CbCel9B，但對濾紙的活性卻弱于CbCel9B［13］。

C. bescii的基因組編碼6個GH5家族糖苷水解酶，而在其他已測序的Caldicellulosiruptor屬細菌中，GH5的數(shù)量是1-6個。C. bescii的這6個GH5家族酶，其中3個是氨基酸序列幾乎完全一致的甘露聚糖酶，均以多結(jié)構(gòu)域雙功能酶（CbCel9B/Man5A、CbMan5B/Cel44A和CbMan5C/Cel5A）的形式存在，剩下的基因中2個為內(nèi)切纖維素酶，分別以多結(jié)構(gòu)域雙功能酶（CbMan5C/Cel5A）或游離酶（CelD）形式存在；另一個為甘露聚糖酶。與Cel5A不同，CelD主要能降解可溶的或無定型纖維素，降解微晶纖維素的能力非常弱［14］。在CelD蛋白的GH5結(jié)構(gòu)域的C端依次連接有CBM28和3個surface layer homologs（SLHs），分別與結(jié)合特定纖維素成分及將蛋白錨定在細胞壁表面有關(guān)。

其他與纖維素降解相關(guān)的酶包括CbCel44A，該酶位于多結(jié)構(gòu)域糖苷水解酶CbMan5B/Cel44A的C端，該酶包括一個TIM狀模塊和一個β-三明治樣模塊，最適溫度是85℃，對Avicel微晶纖維素的降解活性高于其他已報道的同源蛋白［15］。此外，CbCdx1是一個第1家族的糖苷水解酶，能將纖維寡糖降解為葡萄糖［16］。

2.2 半纖維素酶

依據(jù)植物物種的不同，半纖維素的主要成分包括木聚糖、甘露聚糖等。與木聚糖主鏈降解相關(guān)的主要家族有GH10和GH11家族，C. bescii的木聚糖酶主要屬于前者，該家族的酶底物特異性較為寬泛，氨基酸序列的同源性在18.7%-59.5%間；該菌基因組僅編碼1個GH11家族的酶，但此家族酶的底物特異性較為嚴謹。兩個主要的GH10木聚糖酶為CbXyn10A和CbXyn10B，位于同一個木聚糖利用的基因簇中，前者具有兩個CBM22結(jié)構(gòu)域，后者沒有。有文獻認為，CBM22結(jié)構(gòu)域兼具底物結(jié)合和穩(wěn)定催化結(jié)構(gòu)域的作用［17］。研究發(fā)現(xiàn)，將CbXyn10A上的兩個CBM22依次去掉會使酶的最適溫度降低10-15℃；然而將這兩個CBM22構(gòu)建在CbXyn10B的N端并不能起到對它的穩(wěn)定作用，反而使其最適溫度降低了25℃［18］。CbXyn10A 和CbXyn10B均能降解多種模式木聚糖底物如小麥阿拉伯木聚糖、燕麥木聚糖和樺木木聚糖；盡管它們的氨基酸序列和結(jié)構(gòu)域組織形式大為不同，但都釋放以木二糖為主要產(chǎn)物和少量木糖及其他木寡糖作為終產(chǎn)物［18］。與這兩個酶不同，CbXyn10C處理小麥阿拉伯木聚糖時以木二糖、木三糖和不同聚合形式、不同支鏈的木寡糖作為產(chǎn)物［19］。CbXyn10C除了降解木聚糖外，還對大麥葡聚糖有顯著活性，且能降解微晶纖維素、酸溶脹纖維素和羧甲基纖維素鈉等多種形式的纖維素，在釀酒業(yè)中用于發(fā)酵液澄清上具有較好的應(yīng)用價值。由于CbXyn10C兼具木聚糖酶和β-葡聚糖酶活性且活性較高的特點，因此成為研究GH10家族中雙功能酶結(jié)構(gòu)和功能對應(yīng)關(guān)系的很好模型。CbXyn10C是多結(jié)構(gòu)域雙功能酶（CbXyn10C/Cel48B）的N端結(jié)構(gòu)域，其結(jié)構(gòu)域組織形式以及C端的兩個CBM3b-Cel48B和CelA在氨基酸序列上幾乎完全一致。由于CelA具有極強的降解纖維素能力，基于CbXyn10C具有明顯的纖維素酶酶活，全酶CbXyn10C/Cel48B是否也如CelA一樣具有較高的纖維素酶活，在降解復(fù)雜植物細胞壁中的木聚糖和纖維素時的表現(xiàn)如何，值得研究。

自然界中的木聚糖一般以異質(zhì)性、含側(cè)鏈的形式存在，因此，側(cè)鏈降解有助于去除木聚糖酶作用時的物理屏障，且由內(nèi)切木聚糖酶產(chǎn)生的木二糖和木寡糖需要經(jīng)過木糖苷酶降解成為木單糖方能被細菌轉(zhuǎn)化進入代謝途徑。在C. bescii中，與木聚糖側(cè)鏈和木寡糖降解相關(guān)的輔助酶至少存在于GH3、GH5、GH39、GH43、GH51、GH67和CE7等家族中。所有已測序的Caldicellulosiruptor屬細菌均至少包括1個GH3家族的酶。對C. bescii的CbXyl3A分析發(fā)現(xiàn)，該酶的最適溫度為90℃，最適pH為6.0，能將聚合度為2-6的木寡糖降解為木糖；而其阿拉伯呋喃糖苷酶（GH51）和α-葡萄糖醛酸酶（GH67）的最適溫度分別為 90℃和 70-75℃［18］。

在Caldicellulosiruptor屬細菌中，與甘露聚糖降解相關(guān)的酶歸屬于GH2、GH5、GH26和GH36家族。在C. bescii中，3個氨基酸序列幾乎完全一致的GH5甘露聚糖酶均以多結(jié)構(gòu)域雙功能酶的形式存在于一個大蛋白的N端或C端。從對CbCel9B/Man5A的表征看，這些甘露聚糖酶具備很強的降解不同類型甘露聚糖（角豆角、瓜爾豆膠和魔芋多糖）的能力，還能降解聚合度為3以上的甘露寡糖［12］。蛋白質(zhì)組學(xué)分析表明，在纖維素培養(yǎng)基上CbCel9B/Man5A的分泌量僅次于CelA［20］。因此該酶在降解利用纖維素和甘露聚糖等植物細胞壁多糖時具有重要意義。

β-甘露糖苷酶將甘露寡糖完全降解為甘露糖（單糖），便于進入細胞的代謝途徑。β-甘露糖苷酶存在于GH1、GH2和GH5家族中。C. bescii中GH1家族的CbCdx1是一個多功能酶，能降解纖維寡糖、木寡糖等，但不能降解甘露寡糖。如上所述，GH5家族的3個序列極相似的酶均為甘露聚糖酶，第4和第5個酶為纖維素酶，而第5個酶則只對甘露聚糖有微弱活性，不能降解甘露寡糖。這意味著甘露寡糖酶必然存在于GH2中。從基因組DNA中克隆了Athe_0227，并將其命名為CbMan2A，該酶能將甘露二糖至甘露六糖降解為甘露糖，并與甘露聚糖酶展現(xiàn)出一定的協(xié)同降解作用。CbMan2A沒有信號肽，因此，從這些生化數(shù)據(jù)可推斷，多結(jié)構(gòu)域雙功能酶在胞外降解甘露聚糖，所形成的甘露寡糖通過細胞膜上某種未知的轉(zhuǎn)運蛋白進入胞內(nèi)，然后被CbMan2A降解為單糖進入代謝途徑［21］。

3 木質(zhì)素降解

對木質(zhì)素的酶催化降解，現(xiàn)有研究多集中于有氧狀態(tài)下的酶催化降解，這是因為一般認為木質(zhì)素的降解必須需要氧氣的參與才能打開木質(zhì)素的主體結(jié)構(gòu)，即難降解的醚鍵和苯環(huán)。而對無氧狀態(tài)下的木質(zhì)素降解研究得非常少。木質(zhì)素伴生于植物細胞壁多糖，雖然多糖的降解既能在有氧（水解+加氧裂解）也能在無氧（水解）狀態(tài)下進行。但無氧環(huán)境下木質(zhì)素的主要結(jié)構(gòu)如何降解（醚鍵、酯鍵）或開環(huán)（苯環(huán)）并最終礦化為二氧化碳實現(xiàn)碳元素的循環(huán)還是一個未知的領(lǐng)域。反芻動物的瘤胃為天然無氧、高效降解木質(zhì)纖維素的特異生物反應(yīng)器，某些瘤胃細菌的培養(yǎng)物或發(fā)酵產(chǎn)物能在厭氧培養(yǎng)時降解木質(zhì)素或其模型化合物，但其分子機制尚不明確［22-23］。厭氧細菌變形菌Sphingobium屬細菌有Cα脫氫酶Lig D、β-酯酶LigF和谷胱甘肽裂解酶LigG，這3個酶能協(xié)同作用，在輔基NAD+/NADH的作用下，降解木質(zhì)素模型化合物1-（4-hydroxy-3-methoxyphenyl）-2-（2-methoxyphenoxy）-1，3-propanediol和木質(zhì)素中的β-O-4芳香醚鍵［24-25］。值得注意的是，以柳枝稷為能源作物時，C. bescii能在降解纖維素和木聚糖的同時，厭氧降解木質(zhì)素并釋放出木質(zhì)素的小分子化合物如對香豆酸等。但與植物細胞壁多糖被降解進而利用不同，C. bescii只能降解木質(zhì)素卻沒有證據(jù)表明其能有效利用木質(zhì)素降解小分子維持其生長［26］。對C. bescii的基因組分析并未發(fā)現(xiàn)和Lig D、LigF和LigG同源的蛋白，這意味著該菌采取的木質(zhì)素降解機制與Sphingobium屬細菌不同。在C. bescii的蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析中發(fā)現(xiàn)了一些具有信號肽的酯酶和“假定蛋白”（hypothetical proteins），由于厭氧降解木質(zhì)素在生物能源、生物化工和畜牧養(yǎng)殖等行業(yè)均有重要的應(yīng)用價值，這些蛋白是否參與到木質(zhì)素的厭氧降解是將來需要研究的重要課題。

4 木質(zhì)纖維素降解的分子機制

4.1 雙催化結(jié)構(gòu)域組織形式

在 C. bescii中，GH9-CBM3c-CBM3b-CBM3b-GH48 被 稱 為 CelA［4］或 CbCel9A/Cel48A［13］。GH9和GH48分別為內(nèi)切和外切纖維素酶，能協(xié)同降解纖維素。受限于酶的自身特性（進行性，Processivity），不管以內(nèi)切還是外切方式切割纖維素的糖苷水解酶在降解一定鏈長后均會從纖維素上脫落，由于GH9、GH48和中間的3個CBMs均具有結(jié)合纖維素的能力，這使得解離的催化結(jié)構(gòu)域又能很快找到纖維素底物。這種分子內(nèi)協(xié)同效應(yīng)和較強的底物結(jié)合能力使得CelA具有高效降解微晶纖維素的能力［4，27］。顯然，這種高效降解底物的能力與CelA獨特的結(jié)構(gòu)域組織形式是密切相關(guān)的；而這種結(jié)構(gòu)域組織形式被認為可能反映了自然界繼自由酶（Free enzyme，以里氏木霉的纖維素酶為代表）和纖維小體（Cellulosome，以嗜熱梭菌的纖維小體為代表）后的第三種降解纖維素的范式，是一種處于自由酶和纖維小體之間、過渡態(tài)的降解形式［27］。除了CelA，C. bescii還編碼5個此類雙催化結(jié)構(gòu)域酶，在多肽鏈的N端和C端分別是不同家族的糖苷水解酶，間隔以2-3個碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域。除CelA為纖維素酶外，其余5個酶均為雙功能酶，針對植物細胞壁多糖的不同成分?？紤]到CelA對微晶纖維素的強大降解能力，由于未經(jīng)預(yù)處理的植物細胞壁多糖在物理上緊密相連，這種特殊的結(jié)構(gòu)域組織形式是否對這類酶降解完整植物細胞壁也有類似的促進作用，值得進一步研究。

4.2 底物雜泛性

不同的糖苷水解酶具有不同的底物專一性。如前所述，相對于GH10家族的木聚糖酶，GH11酶具有更嚴格的底物專一性。從已分析的C. bescii的糖苷水解酶來看，該菌的多個GH均具有較寬泛的底物特異性。例如，CbCel9B除了能降解纖維素外，還能降解甘露聚糖［12］。相似的，CbCel44A還能降解甘露聚糖和木聚糖；而CbCdx1則能降解pNP-α-L-arabinopyranoside、pNP-β-D-fucopyranoside、pNP-β-D-galactopyranoside、pNP-β-D-glucopyranoside、pNP-β-D-xylopyranoside 和 pNP-β-D-cellobiose［16］。CbXyn10B［28］和 CbXyn10C［19］除了能降解木聚糖，還能降解纖維素；CelA的GH48外切纖維素酶還具有降解木聚糖的活性［27］。這種廣泛存在的糖苷水解酶的底物雜泛性是否有利于該菌更好的適應(yīng)環(huán)境尚未做過系統(tǒng)的研究。但顯然并非可有可無：單獨添加CelA就能使柳枝稷中超過60%的木聚糖被降解。而且，從節(jié)約酶的使用成本角度上，新的雙功能酶或多功能酶或改造既有酶獲得新功能［29］在工業(yè)上具有一定的應(yīng)用價值。

4.3 吸附-降解模式

Caldicellulosiruptor屬細菌進化出了一系列的機制使得糖苷水解酶和底物、細菌和木質(zhì)纖維素能更好的吸附在一起，從而有利于木質(zhì)纖維素的酶解，如C. kronotskyensis編碼有19個含SLH結(jié)構(gòu)域的蛋白，將其中一個基因（Calkro_0402）插入C. bescii能促使其降解木聚糖。C. bescii有12個含SLH結(jié)構(gòu)域的蛋白，其中CelD是能降解無定型或可溶纖維素的纖維素酶，其余SLH蛋白的功能尚有待進一步研究。此外，在C. bescii的培養(yǎng)物上清中存在許多的solute-binding proteins（SBP），這些蛋白的pI值偏堿，對木質(zhì)纖維素有良好的結(jié)合能力，推測這些蛋白能通過結(jié)合木質(zhì)纖維素，再通過和pI偏酸的糖苷水解酶的非特異的蛋白間相互作用，促進C. bescii所分泌的糖苷水解酶降解木質(zhì)纖維素［30］。在固型木質(zhì)纖維素作底物的培養(yǎng)基中，C. bescii主要通過吸附在木質(zhì)纖維素上發(fā)揮降解和利用作用。在具有較強纖維素降解能力的Caldicellulosiruptor屬細菌中發(fā)現(xiàn)了Tāpirin這類新的黏附蛋白，基因組中位于編碼IV型菌毛操縱子的下游，生化分析表明它們能結(jié)合在模式纖維素和復(fù)雜植物細胞壁上，結(jié)構(gòu)分析則表明這類蛋白具有全新、獨一無二的結(jié)構(gòu)［31］。對C. bescii的基因組分析發(fā)現(xiàn)，該菌具有兩個Tāpirin的同源蛋白，可能參與了木質(zhì)纖維素的吸附和降解利用。

5 結(jié)語

C.bescii降解木質(zhì)纖維素的強大能力，與該菌基因組編碼的多種針對不同底物的糖苷水解酶、酯酶、碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域甚至假定蛋白有密不可分的關(guān)系。由于該菌最適生長溫度高，從C. bescii中克隆、表達得到的重組酶往往具有優(yōu)秀的耐熱性和較高的催化效率，這為實際應(yīng)用木質(zhì)纖維素降解酶奠定良好的基礎(chǔ)。更為重要的是，C. bescii采取了多種獨特的、異于其他木質(zhì)纖維素降解微生物的策略進行植物生物質(zhì)的降解。將來對這些分子機制的進一步闡明和利用無疑可更好的促進高效、多功能高效木質(zhì)纖維素降解酶的設(shè)計和優(yōu)化。目前對C. bescii的研究，主要集中在對其糖苷水解酶的基因資源挖掘和降解的分子機制的研究，未來可對其降解木質(zhì)素的酶進行生化分析和基因資源的挖掘。另外，國外已有對C. bescii進行遺傳改造的研究，可借鑒已有工作基礎(chǔ)，進一步改造該菌使其能高效的將植物細胞壁多糖聯(lián)合生物加工轉(zhuǎn)化成所需的物質(zhì)（如氫氣或乙醇等），這些工作在生物能源領(lǐng)域?qū)⒂兄匾囊饬x。

［1］Robertson GP, Dale VH, Doering OC, et al. Agriculture. Sustainable biofuels redux［J］. Science, 2008, 322（5898）：49-50.

［2］Ragauskas AJ, Williams CK, Davison BH, et al. The path forward for biofuels and biomaterials［J］. Science, 2006, 311 ：484-489.

［3］Svetlichnyi VA, Svetlichnaya TP, Chernykh NA, et al. Anaerocellum thermophilum gen. nov. sp. nov. ：an extremely thermophilic cellulolytic eubacterium isolated from hot springs in the valley of geysers［J］. Mikrobiologiya, 1990, 59 ：598-603.

［4］Zverlov V, Mahr S, Riedel K, et al. Properties and gene structure of a bifunctional cellulolytic enzyme（CelA）from the extreme thermophile ‘Anaerocellum thermophilum’ with separate glycosyl hydrolase family 9 and 48 catalytic domains［J］. Microbiology,1998, 144（Pt 2）：457-465.

［5］Yang SJ, Kataeva I, Hamilton-Brehm SD, et al. Efficient degradation of lignocellulosic plant biomass, without pretreatment, by the thermophilic anaerobe“Anaerocellum thermophilum”DSM 6725［J］. Appl Environ Microbiol, 2009, 75：4762-4769.

［6］Yang SJ, Kataeva I, Wiegel J, et al. Classification of‘Anaerocellum thermophilum’ strain DSM 6725 as Caldicellulosiruptor bescii sp.nov［J］. Int J Syst Evol Microbiol, 2010, 60：2011-2015.

［7］ Kataeva IA, Yang SJ, Dam P, et al. Genome sequence of the anaerobic, thermophilic, and cellulolytic bacterium “Anaerocellum thermophilum” DSM 6725［J］. J Bacteriol, 2009, 191：3760-3761.

［8］Dam P, Kataeva I, Yang SJ, et al. Insights into plant biomass conversion from the genome of the anaerobic thermophilic bacterium Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725［J］. Nucleic Acids Research,2011, 39：3240-3254.

［9］ Blumer-Schuette SE, Lewis DL, Kelly RM. Phylogenetic, microbiological, and glycoside hydrolase diversities within the extremely thermophilic, plant biomass-degrading genus Caldicellulosiruptor［J］. Appl Environm Microbiol, 2010, 76：8084-8092.

［10］Blumer-Schuette SE, Giannone RJ, Zurawski JV, et al.Caldicellulosiruptor core and pangenomes reveal determinants for noncellulosomal thermophilic deconstruction of plant biomass［J］. Journal of bacteriology, 2012, 194：4015-4028.

［11］Olson DG, Tripathi SA, Giannone RJ, et al. Deletion of the Cel48S cellulase from Clostridium thermocellum［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 2010, 107：17727-17732.

［12］Su X, Mackie RI, Cann IK. Biochemical and mutational analyses of a multidomain cellulase/mannanase from Caldicellulosiruptor bescii［J］. Appl Environm Microbiol, 2012, 78 ：2230-2240.

［13］Yi Z, Su X, Revindran V, et al. Molecular and biochemical analyses of CbCel9A/Cel48A, a highly secreted multi-modular cellulase by Caldicellulosiruptor bescii during growth on crystalline cellulose［J］. PLoS One, 2013, 8：e84172.

［14］Velikodvorskaya GA, Chekanovskaya LA, Lunina NA, et al.Family 28 carbohydrate-binding module of the thermostable endo-1, 4-beta-glucanase CelD from Caldicellulosiruptor bescii maximizes enzyme activity and irreversibly binds to amorphous cellulose［J］. Mol Biol, 2013, 47：581-586.

［15］Ye L, Su X, Schmitz GE, et al. Molecular and biochemical analyses of the GH44 module of CbMan5B/Cel44A, a bifunctional enzyme from the hyperthermophilic bacterium Caldicellulosiruptor bescii［J］. Appl Environ Microbiol, 2012, 78 ：7048-7059.

［16］Su X, Zhang J, Mackie RI, et al. Supplementing with non-glycoside hydrolase proteins enhances enzymatic deconstruction of plant biomass［J］. PLoS One, 2012, 7 ：e43828.

［17］Araki R, Karita S, Tanaka A, et al. Effect of family 22 carbohydratebinding module on the thermostability of Xyn10B catalytic module from Clostridium stercorarium［J］. Bioscience, Biotechnology,and Biochemistry, 2006, 70：3039-3041.

［18］Su X, Han Y, Dodd D, et al. Reconstitution of a thermostable xylandegrading enzyme mixture from the bacterium Caldicellulosiruptor bescii［J］. Appl Environ Microbiol, 2013, 79 ：1481-1490.

［19］ Xue X, Wang R, Tu T, et al. The N-terminal GH10 comain of a multimodular protein from Caldicellulosiruptor bescii is a versatile xylanase/beta-glucanase that can degrade crystalline cellulose［J］. Appl Environm Microbiol, 2015, 81：3823-3833.

［20］Lochner A, Giannone RJ, Rodriguez M Jr, et al. Use of label-free quantitative proteomics to distinguish the secreted cellulolytic systems of Caldicellulosiruptor bescii and Caldicellulosiruptor obsidiansis［J］. Appl Environ Microbiol, 2011, 77 ：4042-4054.

［21］Liang D, Gong L, Yao B, et al. Implication of a galactomannanbinding GH2 beta-mannosidase in mannan utilization by Caldicellulosiruptor bescii［J］. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2015, 467：334-340.

［22］Chen W, Supanwong K, Ohmiya K, et al. Anaerobic degradation of veratrylglycerol-beta-guaiacyl ether and guaiacoxyacetic acid by mixed rumen bacteria［J］. Appl Environ Microbiol, 1985, 50 ：1451-1456.

［23］ Chen W, Ohmiya K, Shimizu S, et al. Degradation of dehydrodivanillin by anaerobic bacteria from cow rumen fluid［J］. Appl Environ Microbiol, 1985, 49：211-216.

［24］Tanamura K, Abe T, Kamimura N, et al. Characterization of the third glutathione S-transferase gene involved in enantioselective cleavage of the beta-aryl ether by Sphingobium sp. strain SYK-6［J］. Biosci Biotechnol Biochem, 2011, 75：2404-2407.

［25］Reiter J, Strittmatter H, Wiemann LO, et al. Enzymatic cleavage of lignin beta-O-4 aryl ether bonds via net internal hydrogen transfer［J］. Green Chem, 2013, 15 ：1373-1381.

［26］Kataeva I, Foston MB, Yang SJ, et al. Carbohydrate and lignin are simultaneously solubilized from unpretreated switchgrass by microbial action at high temperature［J］. Energ Environ Sci,2013, 6：2186-2195.

［27］Brunecky R, Alahuhta M, Xu Q, et al. Revealing nature’s cellulase diversity：the digestion mechanism of Caldicellulosiruptor bescii CelA［J］. Science, 2013, 342：1513-1516.

［28］An J, Xie Y, Zhang Y, et al. Characterization of a thermostable,specific GH10 xylanase from Caldicellulosiruptor bescii with high catalytic activity［J］. J Mol Catal B-Enzym, 2015, 117：13-20.

［29］McKee LS, Pena MJ, Rogowski A, et al. Introducing endo-xylanase activity into an exo-acting arabinofuranosidase that targets side chains［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 2012, 109 ：6537-6542.

［30］Yokoyama H, Yamashita T, Morioka R, et al. Extracellular secretion of noncatalytic plant cell wall-binding proteins by the cellulolytic thermophile Caldicellulosiruptor bescii［J］. Journal of Bacteriology, 2014, 196：3784-3792.

［31］Blumer-Schuette SE, Alahuhta M, Conway JM, et al. Discrete and structurally unique proteins（tapirins）mediate attachment of extremely thermophilic Caldicellulosiruptor species to cellulose［J］. J Biol Chem, 2015, 290：10645-10656.

Research Progresses on Lignocellulose Degradation by a Thermophilic Anaerobic Bacterium Caldicellulosiruptor bescii

CHU Yin-di SU Xiao-yun
（Key Laboratory for Feed Biotechnology of the Ministry of Agriculture，F(xiàn)eed Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081）

As a gram-positive anaerobic bacterium isolated from hot spring，Caldicellulosiruptor bescii has strong ability in degrading lignocellulose. It can rapidly grow on a variety of model plant cell wall polysaccharide compounds such as the crystalline cellulose avicel，xylan or even on unpretreated lignocellulose such as switchgrass as sole carbon source. Moreover，this bacterium has an unusual ability of anaerobic degradation of lignin. The genomic annotation showed that most of the proteins encoded by this bacterium were multivariate bi-functional enzymes，i.e.，the N-terminal and C-terminus of the polypeptide chain were glycoside hydrolases of different families，with 2-3 carbohydrate binding domains. The genes encoding enzymes of degrading cellulose were concentrated in a plant cell wall polysaccharide degradation gene cluster，such as cellulase/xylanase，cellulase/mannanase，cellulase/xyloglucanase，etc. The xylanase of C. bescii belonged to the GH10 family，whose specificity of the enzyme was broad，and the homology of the amino acid sequence was between 18.7% and 59.5%. The genus Caldicellulosiruptor evolved a series of mechanisms that allowed glycoside hydrolyses to absorb better to substrates，bacteria and lignocellulose，thereby facilitating the enzymatic hydrolysis of lignocellulose. There were 12 proteins containing SLH domain，and the newly discovered adhesion protein Tāpirin in C. bescii may be involved in the absorption and utilization of lignocellulose. In this paper we review the current progresses in exploring the genome of C. bescii for novel glycoside hydrolases targeting plant cell wall and the associated molecular mechanisms，which are of great significance for the design and optimization of efficient and multi-function lignocellulose degradation enzymes.

lignocellulose；Caldicellulosiruptor bescii；glycoside hydrolase；biofuels

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0533

2017-06-28

國家自然科學(xué)基金面上項目（31672458），國家重點研發(fā)計劃（2016YFD0501409-02）

儲引娣，女，博士，研究方向：木質(zhì)纖維素降解機制；E-mail：cylah@163.com

蘇小運，男，博士，研究員，研究方向：木質(zhì)纖維素降解和利用；E-mail：suxiaoyun@caas.cn

（責(zé)任編輯 狄艷紅）