CRISPR/Cas系統(tǒng)研發(fā)進展及展望

王友華, 鄒婉儂, 康宇立, 唐巧玲, 孫國慶

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所, 農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)基因組學(xué)重點實驗室(北京), 北京 100081

CRISPR/Cas系統(tǒng)研發(fā)進展及展望

王友華, 鄒婉儂, 康宇立, 唐巧玲, 孫國慶*

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所, 農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)基因組學(xué)重點實驗室(北京), 北京 100081

成簇間隔的短回文重復(fù)序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences，CRISPR)發(fā)現(xiàn)至今已有20年，但從第一個CRISPR/Cas基因編輯的成功應(yīng)用至今，其在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、環(huán)保等領(lǐng)域短時間內(nèi)即有了迅猛發(fā)展。歸納總結(jié)了CRISPR/Cas系統(tǒng)的分類和應(yīng)用進展，闡述了該技術(shù)的研發(fā)現(xiàn)狀、研究熱點與發(fā)展態(tài)勢，并對CRISPR/Cas技術(shù)的應(yīng)用前景提出展望。

CRISPR/Cas；系統(tǒng)分類；應(yīng)用領(lǐng)域

CRISPR是一種RNA引導(dǎo)的獲得性免疫系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)于細菌和古生菌中，用于抵御外來病毒入侵細菌體，并在自身基因組中留下外來基因片段作為記憶，用以抵抗外來病毒或噬菌體的入侵[1]。該系統(tǒng)由成簇間隔的短回文重復(fù)序列和Cas基因(CRISPR-associated genes)組成。研究人員根據(jù)其特性進行相應(yīng)的改造后，開發(fā)出可在哺乳動物等生物體的活體細胞內(nèi)實現(xiàn)基因組編輯的技術(shù)。該技術(shù)具有可同時編輯多個位點、編輯效率高、設(shè)計過程簡單易操作等優(yōu)點，使其迅速成為分子生物學(xué)的研究熱點，并被全球眾多研發(fā)機構(gòu)廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、工業(yè)等領(lǐng)域。短短幾年內(nèi)，研究對象囊括了大腸桿菌、酵母、水稻、玉米、小麥、煙草、牧草、斑馬魚、小鼠和豬等多種生物體，技術(shù)類型涵蓋了單/多基因敲除、外源基因插入、基因靶向替換、基因靶向修復(fù)和調(diào)控基因表達等。

1 CRISPR/Cas系統(tǒng)分類

1.1 CRISPR/Cas結(jié)構(gòu)分類

近五年來，科學(xué)家對不同CRISPR系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)及功能特征進行了大量研究，研究顯示這些系統(tǒng)存在多個同源組件以及相同的機制，同時又具有各自的特性機制?；诓煌男?yīng)蛋白，CRISPR/Cas系統(tǒng)被分為兩類，每類分別包含3個類型和19個亞型。1類CRISPR/Cas系統(tǒng)利用多個蛋白效應(yīng)器復(fù)合物(multi-protein effector complexes),而2類CRISPR/Cas系統(tǒng)利用單個蛋白效應(yīng)器。在不同的CRISPR/Cas系統(tǒng)中，負責(zé)適應(yīng)步驟的模塊基本一致，并由Cas1和Cas2基因組成[2]。Cas1和Cas2基因?qū)τ讷@取間隔序列是必不可少的。

1類系統(tǒng)包括Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型3種類型，主要存在于細菌和古細菌中，包含由4～7個Cas蛋白質(zhì)亞基組成的效應(yīng)器復(fù)合物。其中Ⅰ型效應(yīng)器復(fù)合物的大多數(shù)亞基含有RNA結(jié)合RRM(RNA識別基序)結(jié)構(gòu)域的變體[3,4]。Ⅰ型和Ⅲ型效應(yīng)器復(fù)合物具有共同的起源。但Ⅲ型復(fù)合物的Cas10亞基可能是DNA聚合酶-核苷酸環(huán)化酶超家族的活性酶，這有別于不具活性的Ⅰ型對應(yīng)亞基Cas8[5]。

2類CRISPR/Cas系統(tǒng)是從1類系統(tǒng)進化而來，包括Ⅱ型、Ⅴ型和Ⅵ型3種類型，大部分僅存在于細菌中，并被開發(fā)為基因組編輯工具。目前該類系統(tǒng)中的Cas9、Cpf1和C2c1被證實可以對DNA進行切割，C2c2則被證明能夠切割RNA[6]。其中CRISPR/Cas9系統(tǒng)廣泛存在于眾多原核生物基因中，Cas9內(nèi)切酶在向?qū)NA分子的引導(dǎo)下可以對特定位點的DNA進行切割，形成雙鏈的DNA缺口，然后細胞會借助同源重組機制或者非同源末端連接機制對斷裂的DNA進行修復(fù)，實現(xiàn)基因敲除或敲入效果[1]。CRISPR/Cpf1是一種即插即用的系統(tǒng)，不需要其他的元件。Cpf1蛋白具有一個以往在這一酶家族中從未觀察到的特征，該酶具有對RNA和DNA的雙重切割活性。不同于CRISPR/Cas9，CRISPR/Cpf1系統(tǒng)能夠克服Cas9靶向多個基因位點的限制，使用單個定制的CRISPR陣列，自身加工前體crRNA，在單鏈向?qū)NA引導(dǎo)下特異性地靶向和切割DNA，不需要宿主來源的核糖核酸酶(RNase)及tracrRNA，這使得它成為了迄今為止已知最簡單的CRISPR免疫系統(tǒng)[7,8]。CRISPR/C2c1系統(tǒng)對獨特目標(biāo)DNA的識別和切割方式不同于Cas9和Cpf1，其可對雙鏈DNA切割，并形成7核苷酸粘性末端，該粘性末端為當(dāng)前發(fā)現(xiàn)的CRISPR/Cas系統(tǒng)所能產(chǎn)生的最長粘性末端，有望降低基因編輯過程中的脫靶現(xiàn)象，更有助于開發(fā)新的基因組編輯工具，提高切割后的連接效率[5]。與前幾類CRISPR系統(tǒng)不同，CRISPR/C2c2系統(tǒng)是一種靶向RNA的新型CRISPR系統(tǒng)，可特意降解目標(biāo)RNA，用于RNA功能研究[9]。

1.2 CRISPR-Cas遺傳操作技術(shù)分類

目前，CRISPR技術(shù)已經(jīng)成功地用于DNA敲除、DNA敲入、DNA修復(fù)、RNA修飾、DNA標(biāo)記、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等研究中，使得該技術(shù)被廣泛地應(yīng)用于不同的領(lǐng)域。

在DNA敲除方面，通過刪除某些特定基因獲得目標(biāo)性狀生物體。該技術(shù)可應(yīng)用于基因缺失動物模型的構(gòu)建，進而開展基因功能機理研究和基因疾病研究，如白化病和帕金森綜合征等[10]；也可用于敲除某些抑制類基因，提高被抑制目標(biāo)性狀。如敲除肌肉生長抑制素基因獲得肌肉生長型豬，或敲除豬基因組中可能有害的病毒基因，解決豬器官用于人體移植的免疫排斥反應(yīng)等[11]。

在DNA敲入方面，常用于通過插入同源或異源基因獲得特定目標(biāo)性狀生物體，目前科研人員已經(jīng)利用該系統(tǒng)培育了擁有優(yōu)良性狀的牲畜、水產(chǎn)、植物和微生物等。敲入技術(shù)也在不斷優(yōu)化， Kohichi等通過改造提升了CRISPR/Cas系統(tǒng)的長基因插入效率，成功在小鼠受精卵的基因組中定向插入了包含EGFP(增強型綠色熒光蛋白)的長基因盒，這一系統(tǒng)的長基因盒插入效率高達50%[12]。

在DNA修復(fù)方面，利用CRISPR技術(shù)在基因組中的突變位置進行剪切，并替換上正常序列拷貝，從而能夠?qū)崿F(xiàn)DNA修復(fù)。利用該技術(shù)糾正由定點突變導(dǎo)致的各類疾病已成為人類疾病臨床治療的研究熱點。如利用CRISPR技術(shù)修復(fù)人體干細胞中導(dǎo)致鐮狀細胞貧血病的基因，恢復(fù)血紅蛋白正常血氧運輸?shù)墓δ躘13]；將CRISPR技術(shù)運用于人類二倍體胚胎來修復(fù)遺傳性缺陷基因，基因修復(fù)效果顯著優(yōu)于其他技術(shù)[14]。

DNA轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)方面， CRISPR技術(shù)可以用于真核細胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究。利用缺失核酸內(nèi)切酶活性的Cas9(dCas9) 與一種向?qū)NA( guide RNA，gRNA) 共表達，產(chǎn)生CRISPR干擾(CRISPRi)，能有效抑制靶向基因的表達，在該系統(tǒng)中加入可誘導(dǎo)啟動子還可人為地控制干擾過程。且該系統(tǒng)同時具有高度特異性、可靶向干擾單個或多個基因、有效避免脫靶效應(yīng)等優(yōu)點。另外，在不同的調(diào)控功能元件的效應(yīng)位點加入dCas9，能促進其轉(zhuǎn)錄的抑制或激活。該技術(shù)在基因表達調(diào)控的操作上具有簡單、高效、穩(wěn)定等特性，可促進生物學(xué)基礎(chǔ)研究與技術(shù)產(chǎn)業(yè)應(yīng)用的發(fā)展[15]。

在RNA修飾方面，由于DNA編輯會造成細胞基因組永久性的改變，利用靶向RNA而非DNA的新型CRISPR系統(tǒng)CRISPR/C2c2，可通過靶向降解目標(biāo)RNA，實現(xiàn)基因表達的上調(diào)或下調(diào)的短暫型改變，相比現(xiàn)有的RNA干擾技術(shù)具有更好的特異性，利用該系統(tǒng)能夠加速了解、治療和預(yù)防疾病的進程[9]。

2 CRISPR的應(yīng)用進展

由于CRISPR技術(shù)具有設(shè)計簡單以及操作簡便的特性，其已被全球數(shù)以千計的實驗室廣泛地運用于生命科學(xué)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥和工業(yè)等領(lǐng)域?？茖W(xué)家們曾經(jīng)利用基因編輯技術(shù)在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中構(gòu)建疾病動物模型，在臨床治療中攻克各種疑難雜癥，在農(nóng)業(yè)發(fā)展中加速動物和植物的遺傳育種等，尤其在CRISPR/Cas9出現(xiàn)以后，低成本和操作的簡便性又為基因治療打開了一扇大門。

2.1 基礎(chǔ)科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用

2.1.1理解基因功能，探索生命進化歷程，解決生命科學(xué)中的共性技術(shù)問題 如利用CRISPR技術(shù)來制備模式生物，以此推進基因功能的探索與鑒定。利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建小鼠模型，可以將成本和時間降低80%以上，從而極大地推動了基因工程小鼠的應(yīng)用。南京大學(xué)利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)獲得世界首只基因定向敲除食蟹猴。由于基因組序列和生理特征相似，靈長類動物被公認(rèn)為是模擬人類疾病最好的動物模型，為高效建立由多基因控制的復(fù)雜疾病模型提供了可能，對于研究人類重大疾病的發(fā)病機制與藥物研發(fā)有著重要的意義[16,17]。

2.1.2驗證科學(xué)實驗結(jié)果準(zhǔn)確與否 隨著CRISPR技術(shù)逐漸普及，不少實驗室利用CRISPR技術(shù)做出的實驗結(jié)果與此前用其他類似技術(shù)獲得的研究結(jié)果不一致。麻省大學(xué)醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)家Lawson發(fā)現(xiàn)利用兩種基因編輯工具——鋅指核酸酶技術(shù)和嗎啉反義寡聚核苷酸技術(shù)對斑馬魚模型的研究結(jié)果存在50%～80%的不一致[18]，這使其成為了第一批系統(tǒng)比較不同基因工具研究結(jié)果的科學(xué)家。相對于RNA干擾技術(shù)可能存在潛在的“脫靶效應(yīng)”而言，CRISPR技術(shù)的結(jié)果更為準(zhǔn)確，該技術(shù)可用于檢驗利用其他技術(shù)得出的實驗結(jié)論，使科學(xué)數(shù)據(jù)更為準(zhǔn)確可信。

2.1.3探索生命進化過程中的基因變遷歷史

Neil Shubin和Ted Daeschler等借助CRISPR基因編輯技術(shù)在斑馬魚中敲除Hox13家族，來觀察他們對斑馬魚魚鰭發(fā)育的影響，相關(guān)結(jié)果為鰭條與指骨之間的遺傳關(guān)聯(lián)提供了證據(jù)，推動了生物的四肢演化歷程研究[19]。Axel等利用CRISPR基因編輯技術(shù)，構(gòu)造了控制“刺猬因子”蛋白的增強子ZRS缺失的小鼠胚胎，并用人、鼠、腔棘魚、蟒和眼鏡王蛇含有的ZRS進行回補，發(fā)現(xiàn)“刺猬因子”在四肢發(fā)育的過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[20]。麻省理工學(xué)院利用CRISPR/Cas9技術(shù)記錄人類細胞中的DNA變化歷史，可用于研究干細胞在胚胎發(fā)育期間如何產(chǎn)生多種組織，細胞如何對環(huán)境條件作出反應(yīng)以及它們生長過程中導(dǎo)致疾病產(chǎn)生的基因變化，從而深入認(rèn)識生物體內(nèi)的基因變遷歷史[21]。

2.2 種植業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用

該技術(shù)在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用主要集中在以提高抗逆性、營養(yǎng)品質(zhì)、籽粒性狀改良等為目標(biāo)的定向育種，利用CRISPR技術(shù)對一些關(guān)鍵性狀基因的編輯能夠大大加快良種的育種速度，改良生態(tài)環(huán)境。

如在抗逆性狀方面，2014年中國科學(xué)院遺傳發(fā)育研究所高彩霞研究團隊利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)對小麥MLO基因進行定向突變，獲得了對白粉病具有廣譜抗性的小麥[22]。2015年該團隊又利用CRISPR/Cas可特異識別外源DNA這一特性，將CRISPR切割系統(tǒng)引入植物，在植物中建立了DNA 病毒防御體系[23]。2016年Sun等[24]率先通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的同源重組，對水稻ALS基因的兩個氨基酸位點同時進行定點替換，獲得了大量F1代純合的抗除草劑水稻，并通過后代分離，獲得了不含有任何轉(zhuǎn)基因片段的抗除草劑水稻。這一技術(shù)的研發(fā)和應(yīng)用，將使得由于自然變異或長期人工選擇保留下來的具有SNP的優(yōu)良性狀基因得以直接改良，大大加快了農(nóng)作物的育種進程。Shi等[25]利用CRISPR技術(shù)培育了一種新型玉米，這種新型的玉米對干旱表現(xiàn)出了更好的抗性。

在營養(yǎng)品質(zhì)改良方面，美國仍然走在世界前列，除去多例CRISPR/Cas9 基因編輯農(nóng)作物產(chǎn)品正在等待產(chǎn)業(yè)化外，目前至少有2個產(chǎn)品已經(jīng)獲得美國農(nóng)業(yè)部(United States Department of Agriculture, USDA)的批準(zhǔn)，一例是由賓州州立大學(xué)研發(fā)的抗褐化蘑菇(CRISPR-edited mushroom)，通過CRISPR/Cas9剔除蘑菇基因組的多酚氧化酶(PPO)的基因，使其能夠減緩褐化的速度。另一例為杜邦先鋒種子公司基因編輯的糯玉米(CRISPR-edited waxy corn)，糯玉米淀粉含量較高，不但可被研磨用于許多日常消費食品，也是制酒業(yè)的重要原料，同時還具有廣泛的工業(yè)用途，其支鏈淀粉可以被廣泛應(yīng)用于紡織、造紙、粘合劑等工業(yè)部門。2014年Liang等[26]利用CRISPR/Cas9對玉米中植酸合成的關(guān)鍵酶基因ZmIPK進行突變，以降低玉米中植酸的合成，從而改良玉米營養(yǎng)品質(zhì)。

2.3 畜牧領(lǐng)域的應(yīng)用

CRISPR技術(shù)在畜牧領(lǐng)域的應(yīng)用目前主要集中在改良品質(zhì)、提高抗病能力、生物反應(yīng)器等方面。品質(zhì)改良上，Crispo等[27]利用CRISPR/Cas9人工改造了雙臀肌羊的MSTN基因，使其肌肉含量提高了20%以上。Wang等[28]利用CRISPR/Cas9獲得了MSTN雙等位基因敲除豬，所獲得的基因編輯豬表現(xiàn)出了“雙肌”表型。在抗病能力提升上，藍耳病是對全世界養(yǎng)豬業(yè)危害最大的傳染病之一， Whitworth 等[29]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)獲得了分別敲除CD163 和CD1D的基因編輯豬，該基因編輯豬表現(xiàn)出對藍耳病良好的抗性。作為生物反應(yīng)器的研發(fā)上成果顯著，Jeong等[30]利用CRISPR/Cas9技術(shù)將人成纖維細胞生長因子基因?qū)氲脚Ｄ遗?，在細胞和胚胎水平實現(xiàn)了hFGF2基因的穩(wěn)定表達，為最終獲得表達人成纖維細胞生長因子的基因編輯牛奠定了基礎(chǔ)[31]。Peng等[32]利用CRISPR/Cas9技術(shù)在豬白蛋白的基因區(qū)域插入了人白蛋白的編碼DNA，使得豬不再產(chǎn)生豬白蛋白，而只產(chǎn)生人白蛋白。

2.4 醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用

近幾年在醫(yī)藥領(lǐng)域，CRISPR技術(shù)的應(yīng)用主要集中在疾病治療、藥物研發(fā)和器官移植等方面。利用CRISPR技術(shù)修復(fù)突變基因成為疾病治療的研發(fā)重點。主要包括癌癥(如白血病、肺癌等)、罕見遺傳性疾病(血友病、杜氏肌肉萎縮癥、地中海貧血癥等)及感染性疾病(艾滋病、乙肝)等。在癌癥治療方面，利用CRISPR/Cas9技術(shù)修飾T細胞，進而調(diào)動患者的免疫系統(tǒng)，增強腫瘤微環(huán)境抗腫瘤能力，達到殺傷腫瘤細胞的目的。2016年6月，NIH批準(zhǔn)美國Juno首個CRISPR應(yīng)用于人體的臨床試驗，該試驗利用CRISPR技術(shù)對癌癥患者免疫系統(tǒng)的T細胞進行基因修飾，并將基因修飾后的T細胞輸回病人體內(nèi)，以實現(xiàn)靶向摧毀腫瘤細胞的目的[33]。2016年10月，中國科學(xué)家開展了全球首個CRISPR應(yīng)用人體臨床試驗，首名患者接受了經(jīng)CRISPR技術(shù)改造的T細胞(敲除PD-1基因)治療并表示治療進展順利[34]。遺傳病治療方面，研究人員通過從患者體內(nèi)分離血細胞，體外利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)治療鐮狀細胞病(SCD)和β地中海貧血,為血液病的治療提供了新的思路和方法[35]。

CRISPR技術(shù)在藥物靶點的篩選方面也發(fā)揮著重要作用。通過與庫中的sgRNA和篩選標(biāo)記結(jié)合在一起，可以快速的篩選出全基因組范圍內(nèi)潛在的靶點基因?？茖W(xué)家們在剛地弓形蟲細胞中進行了全基因組范圍的CRISPR/Cas9篩選，并找到了潛在的影響寄生蟲的必需基因，在RNF43突變的胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)細胞中進行了全基因組范圍的CRISPR/Cas9篩選，借此尋找治療相應(yīng)疾病的潛在基因藥物[36]。

在器官移植方面，豬被認(rèn)為是人體異種器官來源的首選動物，通過基因編輯來解決豬器官用于人類存在免疫排斥反應(yīng)和豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒的風(fēng)險是當(dāng)前的研發(fā)重點[31]。2015年來自哈佛大學(xué)等的研究人員利用CRISPR/Cas9對基因工程化的豬在62個位點進行了遺傳編輯，之后就可以鈍化豬基因組中的天然的反轉(zhuǎn)錄病毒[11], 這一技術(shù)或?qū)榛颊吆团R床醫(yī)生帶來巨大希望。

2.5 其他應(yīng)用領(lǐng)域

CRISPR技術(shù)除了在生命科學(xué)、農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用之外，在能源、物種保護、分子檢測、模擬記憶儲存等領(lǐng)域的應(yīng)用也取得了一定進展。

能源方面，加州大學(xué)河濱分校利用CRISPR技術(shù)編輯了解脂耶氏酵母中的基因，提高了酵母生成這些產(chǎn)物的能力，這種酵母將糖轉(zhuǎn)化為可用于替代石油的脂肪和油，為可持續(xù)生物燃料的發(fā)展提供了一定的條件[37]。中國科學(xué)院青島能源所徐健團隊以微擬球藻作為底盤生物，建立了基于Cas9-gRNA的工業(yè)產(chǎn)油微藻基因組編輯技術(shù)，該技術(shù)有助于鑒定微擬球藻基因組上各編碼或非編碼位點的功能鑒定，對于能源微藻的分子育種將產(chǎn)生深遠的影響[38]。

物種保護方面，加州大學(xué)圣克魯斯分校Ben Novak等將滅絕的候鴿博物館標(biāo)本DNA與現(xiàn)存鴿子進行序列比對，并通過CRISPR技術(shù)嘗試對現(xiàn)存鴿子進行基因改造，以使這些鴿子變得更接近滅絕的候鴿[39]。

分子檢測方面，張鋒等[40]改造了靶向RNA的CRISPR系統(tǒng)，使其成為了快速、便宜且高度靈敏的診斷工具，該工具能夠指示目標(biāo)RNA或DNA分子中單分子的存在，未來可被用于應(yīng)對病毒和細菌爆發(fā)，監(jiān)測抗生素耐藥性和癌癥。

另外，用CRISPR編輯蚊子基因組，使其獲得特異抗體控制瘧原蟲傳播[41]，提高魚類生長速度和抗低溫能力的應(yīng)用，寵物大小、毛色定制化等的研究和應(yīng)用也在不斷展開[39]。

3 展望

3.1 CRISPR技術(shù)系統(tǒng)應(yīng)用領(lǐng)域?qū)⒉粩嗤貙?/h3>

CRISPR技術(shù)的發(fā)展初期，主要集中在生命科學(xué)基礎(chǔ)研究、醫(yī)藥與農(nóng)業(yè)領(lǐng)域。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，CRISPR技術(shù)體系的完善升級，其應(yīng)用領(lǐng)域也在逐漸拓展，能源、環(huán)保、健康等領(lǐng)域應(yīng)用將會迅速鋪開。同時該技術(shù)將不斷與其他類型技術(shù)相融合，如與基因測序、基因表達的分析、疾病的模型、藥物遞送等技術(shù)相結(jié)合，使得這些技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域更加廣泛。CRISPR技術(shù)將在基因功能解析、靶向藥物研制、人類疾病動物模型的創(chuàng)建、人類基因治療以及家畜育種等方面發(fā)揮重要作用，具有廣闊的應(yīng)用前景[42]。另外，研究表明CRISPR系統(tǒng)還參與細菌生長代謝的調(diào)控，這說明CRISPR系統(tǒng)的功能還有更多拓寬的可能，對于技術(shù)本身的研究還需要更加深入，以期在更加廣闊的領(lǐng)域中加以應(yīng)用。

3.2 CRISPR技術(shù)系統(tǒng)將不斷完善

雖然CRISPR技術(shù)近年來發(fā)展迅猛，但其技術(shù)效能仍然存在一些問題，科研人員正通過改造修飾編輯蛋白、使用直系同源酶、利用物質(zhì)輔助等一系列措施來完善該技術(shù)。完善方向主要有：①致力于進一步提高該技術(shù)的修復(fù)精確性，拓展目前僅限于將胞嘧啶更換為胸腺嘧啶的局限性，以期能實現(xiàn)對核苷酸更加精確隨意的替換；②打破PAM(protospacer adjacent motif，PAM)識別序列的限制，通過對復(fù)合蛋白改造和擴大PAM 識別范圍，進一步擴大CRISPR/Cas技術(shù)的應(yīng)用范圍；③通過改造蛋白復(fù)合體提高與靶向序列的精準(zhǔn)結(jié)合，或改變sgRNA的長度，增加sgRNA的穩(wěn)定性來降低脫靶現(xiàn)象；④突破馬賽克現(xiàn)象(mosacism)，解決基因編輯時出現(xiàn)的帶有不同編輯類型的嵌合個體；⑤加強CRISPR系統(tǒng)對不同物種和不同基因進行編輯時的穩(wěn)定性和普適性。

3.3 CRISPR技術(shù)知識產(chǎn)權(quán)保護難題有待解決

CRISPR技術(shù)不斷創(chuàng)新的同時，圍繞該技術(shù)的核心專利爭奪戰(zhàn)最終塵埃落定。美國專利及商標(biāo)局認(rèn)為，麻省理工大學(xué)和哈佛大學(xué)的博德研究所張鋒等申請的CRISPR基因編輯專利在有核細胞(如人類細胞)領(lǐng)域應(yīng)用具有獨創(chuàng)性，與加州大學(xué)伯克利分校Jennifer Doudna等所持有的CRISPR專利不相沖突，雙方均可持有各自專利權(quán)。拋開專利申請規(guī)則可能帶來的后果，CRISPR是源于細菌及古菌中的一種后天性免疫系統(tǒng)，本身并不能實現(xiàn)專利保護?？茖W(xué)家通過人為改造細菌中自然存在的CRISPR/Cas9系統(tǒng)，利用該技術(shù)來增加、修改或者刪除相應(yīng)的DNA序列完成基因編輯，故科研人員利用該系統(tǒng)原理實現(xiàn)獨特創(chuàng)新的科研成果可以申請專利保護。但同時，利用CRISPR剪切后，基因通過自我修復(fù)程序自動把剪切留下的空檔連接上，如果不涉及到外源的基因或其他外源遺傳物質(zhì)加入，所獲得的生物就沒有任何標(biāo)記可以證明它來自CRISPR編輯技術(shù)。其產(chǎn)生的基因編輯生物與突變育種獲得的生物在結(jié)果上看并無差別，這就為該技術(shù)的知識產(chǎn)權(quán)保護帶來了難題。

3.4 CRISPR技術(shù)應(yīng)用的安全監(jiān)管亟待加強

科學(xué)家對CRISPR技術(shù)應(yīng)用的安全性主要包括以下幾個方面，一是該技術(shù)的快速推進可能引發(fā)的倫理問題。如科學(xué)家利用CRISPR改造人類胚胎引發(fā)了關(guān)于是否以及如何使用CRISPR使人類基因組產(chǎn)生可遺傳的變異的激烈爭辯。二是，對自然界中的生物體過度的基因編輯來獲取某些性狀將可能擾亂整個生態(tài)系統(tǒng)的平衡。三是，基因編輯技術(shù)可以在不引入標(biāo)記基因的情況下插入某些特定基因，但就目前檢測手段來說無法獲知插入的基因信息，這為后續(xù)安全監(jiān)管帶來技術(shù)難題。鑒于上述問題，后續(xù)需要提出全球范圍的一個監(jiān)管框架，來指導(dǎo)與約束利用CRISPR技術(shù)進行基因操作的研究及產(chǎn)業(yè)化等各個環(huán)節(jié)[43]。

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ProgressandProspectofCRISPR/CasSystemResearchandDevelopment

WANG Youhua, ZOU Wannong, KANG Yuli, TANG Qiaoling, SUN Guoqing*

TheMinistryofAgricultureKeyLaboratoryforAgriculturalGenomics(Beijing),BiotechnologyResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100081,China

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) has been found for 20 years until now. But since the successful application of the first CRISPR/Cas gene editing, CRISPR achieves rapid development in the pharmaceutical, agriculture and environmental protection in a short time. This paper summarized the progress on classification and application of CRISPR/Cas system. We also reviewed the status, hotspot, trend of research and development in current field, and put forward the expectation for future of CRISPR/Cas technology application.

CRISPR/Cas; system classification; application field

2017-07-17;接受日期2017-08-28

中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(1610392016011)資助。

王友華，助理研究員，主要從事科技管理、知識產(chǎn)權(quán)研究。E-mail:wangyouhua@caas.cn。*通信作者：孫國慶，研究員，主要從事科技管理、知識產(chǎn)權(quán)研究。E-mail:sunguoqing01@caas.cn

10.19586/j.2095-2341.2017.0091