水稻矮桿突變體D814基因圖位克隆與功能分析

陳新兵, 黃榮峰, 王 娟

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所, 北京 100081

水稻矮桿突變體D814基因圖位克隆與功能分析

陳新兵, 黃榮峰*, 王 娟*

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所, 北京 100081

水稻株高對(duì)作物產(chǎn)量有著重要的影響，在水稻整個(gè)生長發(fā)育過程中，株高受到多因素的調(diào)控，而植物激素乙烯就是重要的影響因素之一。用10 mg/m3乙烯處理水稻幼苗，對(duì)水稻突變體庫進(jìn)行篩選，獲得了3個(gè)根伸長生長對(duì)乙烯敏感性降低的突變體，其中1個(gè)突變體D814表現(xiàn)出植株矮化、分蘗數(shù)減少、千粒重下降等特征。圖位克隆將其定位在1號(hào)染色體上1 cM的區(qū)間內(nèi)，該區(qū)間有6個(gè)已報(bào)道的矮桿突變基因，通過對(duì)這6個(gè)基因測(cè)序，發(fā)現(xiàn)其中1個(gè)基因OsBRI1(LOC_Os01g52050)發(fā)生了點(diǎn)突變(編碼區(qū)第1 837位G突變?yōu)門)。并在D814中分別對(duì)OsBRI1的2個(gè)同源基因(OsBRL1和OsBRL3)進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)這2個(gè)基因均無突變。利用已報(bào)道的OsBRI1等位突變體gsor300084進(jìn)行乙烯處理，發(fā)現(xiàn)gsor300084與D814一樣，表現(xiàn)出根對(duì)乙烯敏感性降低。OsBRI1是植物激素油菜素內(nèi)酯(brassinosteroid，BR)的信號(hào)受體，經(jīng)檢測(cè)，BR信號(hào)途徑響應(yīng)基因在D814突變體中的表達(dá)也有變化，說明D814是OsBRI1的1個(gè)等位突變體。功能分析發(fā)現(xiàn)，D814參與乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控途徑和植物鹽脅迫應(yīng)答途徑。研究結(jié)果為探究乙烯調(diào)控水稻生長發(fā)育及耐逆性的分子機(jī)理提供了研究材料，也為進(jìn)一步探討油菜素內(nèi)酯與乙烯協(xié)同調(diào)控水稻生長發(fā)育機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)。

水稻；乙烯；矮桿；圖位克??；鹽脅迫應(yīng)答

水稻矮化是植物生長發(fā)育過程中的一個(gè)重要考察指標(biāo)，對(duì)于作物產(chǎn)量、光合速率等具有重要的影響。矮化變異可作為一種穩(wěn)定性狀標(biāo)記，用于新品種培育、作物遺傳改良等生產(chǎn)實(shí)踐[1]。根據(jù)矮化程度不同，可將水稻分為：半矮桿、矮桿、極矮桿3種表型，其中矮桿是指水稻株高表型比正常株高矮一半的矮桿突變體[2]。按照慣例，矮桿和極矮桿基因統(tǒng)一用符號(hào)d來命名，而半矮桿基因用符號(hào)sd來命名。目前在國家水稻數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站上(www.ricedate.cn)已鑒定出的矮桿基因有幾十個(gè)，其中分布在1號(hào)染色體上的矮桿基因有6個(gè)，分別為sd1、d2、d10、d18、d61、gid1。在這6個(gè)基因當(dāng)中，d61是較早被發(fā)現(xiàn)的一個(gè)矮桿基因，是編碼植物激素油菜素內(nèi)酯(brassinosteroid，BR)的一個(gè)受體激酶BRI1。在水稻中，OsBRI1有2個(gè)同源基因，OsBRL1與OsBRL3，OsBRI1主要通過控制細(xì)胞分裂以及細(xì)胞伸長來調(diào)控器官發(fā)育，但對(duì)器官的起始不是必需的，而OsBRL1和OsBRL3主要是在根部響應(yīng)BR信號(hào)的應(yīng)答[3]。除此之外，OsBRI1在水稻的生長發(fā)育過程中起多種作用，包括節(jié)間伸長、葉傾角、暗形態(tài)建成等[4]。近年來通過正向遺傳學(xué)等手段也發(fā)現(xiàn)了許多OsBRI1的等位突變基因，例如半矮桿突變體Fn189(d54)的點(diǎn)突變導(dǎo)致OsBRIl激酶活性降低[5]。另外一個(gè)點(diǎn)突變體gsor300084，其點(diǎn)突變導(dǎo)致第444位的色氨酸突變?yōu)榫彼?，從而?dǎo)致對(duì)BR信號(hào)的鈍感表型[6]。OsBRI1除了參與植物生長發(fā)育以外，在逆境脅迫應(yīng)答中也發(fā)揮著重要的作用。例如：鹽脅迫下，OsBRI1的表達(dá)量會(huì)顯著上升，從而導(dǎo)致植物體內(nèi)BR信號(hào)增強(qiáng)；隨著氧化脅迫強(qiáng)度的上升，BR能夠通過促進(jìn)植物體內(nèi)H2O2的積累來使植物抵御這一傷害[7]。

對(duì)于BR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，在擬南芥中已經(jīng)研究的十分清楚[8,9]。在水稻中，目前為止只鑒定出了一些與擬南芥相似的BR信號(hào)成分。OsBAK1與擬南芥中BAK1同源[10]，OsBZR1與擬南芥中BZR1的功能類似[11]。而擬南芥BIN2的同源基因OsGSK2，在水稻中同樣是BR信號(hào)的負(fù)調(diào)控因子[12]。除此之外，近年來BR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中一些新的轉(zhuǎn)錄因子也陸續(xù)被鑒定出來：OsOFP8作為OsGSK2的作用底物參與BR信號(hào)途徑[13]；OsBUL1作為一個(gè)正調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子參與BR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[14]。隨著生物學(xué)的發(fā)展，水稻中越來越多的BR信號(hào)途徑新組分被鑒定出來，豐富和發(fā)展著BR信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。在水稻生長發(fā)育的過程中，乙烯對(duì)植物的株高以及地下部生長發(fā)育具有十分重要的影響。挖掘乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的新組分是研究乙烯在植物體內(nèi)作用的分子基礎(chǔ)，也是目前常規(guī)的流行方法。作為重要的植物激素之一，乙烯在雙子葉植物體內(nèi)的作用主要表現(xiàn)為典型的三重反應(yīng)：抑制根的伸長生長、抑制下胚軸的伸長生長以及促進(jìn)頂端彎曲；而在單子葉植物中乙烯只表現(xiàn)出二重反應(yīng)：抑制根的伸長生長和促進(jìn)胚芽鞘的伸長生長[15]。研究表明，乙烯在植物體內(nèi)的這種作用主要是通過乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑實(shí)現(xiàn)的[16～21]。除了調(diào)控植物生長發(fā)育作用外，乙烯還參與植物鹽脅迫、病原菌侵染等逆境脅迫條件下的應(yīng)答過程[22]。其中在鹽脅迫應(yīng)答中，乙烯可以通過調(diào)節(jié)水稻根系Na+/K+的轉(zhuǎn)運(yùn)或者通過下游轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控耐鹽相關(guān)基因的表達(dá)[23]。

本研究用10 mg/m3乙烯處理水稻幼苗，對(duì)水稻突變體庫進(jìn)行篩選，獲得了3個(gè)根對(duì)乙烯敏感性降低突變體，其中1個(gè)突變體D814表現(xiàn)出植株矮化、分蘗數(shù)減少、千粒重下降等顯著特征。圖位克隆將其定位在1號(hào)染色體上1 cM的區(qū)間內(nèi)，該區(qū)間有6個(gè)已報(bào)道的矮桿突變基因，通過對(duì)這6個(gè)基因測(cè)序發(fā)現(xiàn)其中1個(gè)基因OsBRI1(LOC_Os01g52050)發(fā)生點(diǎn)突變(第1 837位G突變?yōu)門)。同時(shí)檢測(cè)到D814中OsBRI1的2個(gè)同源基因(OsBRL1和OsBRL3)均無突變，且已報(bào)道的d61等位突變體gsor300084也表現(xiàn)出根對(duì)乙烯敏感性降低，而D814中BR響應(yīng)基因的表達(dá)也有所變化，上述結(jié)果說明該突變體很可能是OsBRI1基因點(diǎn)突變所致。進(jìn)一步的功能分析發(fā)現(xiàn)，D814參與了乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控途徑和植物鹽脅迫應(yīng)答途徑。本研究為探究乙烯調(diào)控水稻生長發(fā)育及耐逆性的分子機(jī)理提供了研究材料，也為進(jìn)一步探討B(tài)R與乙烯協(xié)同調(diào)控水稻生長發(fā)育奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與生長條件

1.1.1試驗(yàn)材料 野生型02428和培矮64(PA64)水稻種子由本實(shí)驗(yàn)室保存，3 000份以02428為背景的甲基磺酸乙酯(ethyl methane sulfonate，EMS)誘變水稻突變體材料庫由本實(shí)驗(yàn)室創(chuàng)建，乙烯敏感性降低矮桿突變體D814由本次實(shí)驗(yàn)篩選并保存。用于D814突變體基因圖位克隆的F2群體由本實(shí)驗(yàn)室創(chuàng)建。

1.1.2生長條件 2015年和2016年，連續(xù)2年在試驗(yàn)基地(39.6°N，116.2°E)進(jìn)行種植。土培幼苗：種植在土培盒中，在水稻培養(yǎng)溫室中(30℃,16 h白天/8 h黑夜)生長2周左右；水培幼苗：種植在鐵絲網(wǎng)架上，放入溫室培養(yǎng)4～5 d左右。

1.1.3試驗(yàn)試劑 Trizol試劑盒購自天根生化有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自諾唯贊有限公司；用于熒光定量PCR的SYBR Green Mix購自翌圣生物科技有限公司。

1.2 乙烯篩選

選取萌發(fā)一致的水稻幼苗，種植在鐵絲網(wǎng)架上，每個(gè)鐵網(wǎng)格種植30粒水稻種子，每個(gè)株系種植3格，將網(wǎng)架放入10 L的塑料密閉培養(yǎng)箱中，加入5 L的水，使水面距離種子約1 cm處，封蓋，注入終濃度為10 mg/m3的乙烯氣體，長日照條件下培養(yǎng)4 d，進(jìn)行表型觀察并統(tǒng)計(jì)初生根長，實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。

1.3 表型分析及農(nóng)藝性狀統(tǒng)計(jì)

在水稻幼苗期，選取土培2周左右的幼苗進(jìn)行拍照；在水稻成熟期，分別對(duì)野生型02428和突變體D814植株進(jìn)行觀察統(tǒng)計(jì)：隨機(jī)選取10株成苗，測(cè)量統(tǒng)計(jì)其株高、分蘗數(shù)、各節(jié)間長度等主要農(nóng)藝性狀；等種子成熟后，分別稱取野生型02428和突變體D814千粒重，并進(jìn)行3次重復(fù)。

1.4 基因初步定位

將D814與PA64進(jìn)行雜交獲得F1代后加繁一代得到F2代群體。選取飽滿度大致相同的F2群體以及親本野生型02428和PA64水稻種子，萌發(fā)后土培種植，在水稻溫室中培養(yǎng)2周左右，選取矮化表型幼苗單株，根據(jù)CTAB法提取基因組DNA后，首先隨機(jī)選取10個(gè)單株F2基因組DNA，按等濃度混勻構(gòu)成DNA混池，同時(shí)分別以野生型親本02428以及PA64的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR鑒定，PCR反應(yīng)程序?yàn)?95℃ 10 min；95℃ 15 s，55℃ 15 s，72℃ 15 s，共45個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。PCR反應(yīng)體系為:模板1 μL，正反向引物各0.5 μL，2×PCR Mix 10 μL, 用H2O補(bǔ)齊到20 μL。PCR引物根據(jù)水稻基因組數(shù)據(jù)庫中水稻品種02428和PA64的Indel分子標(biāo)記進(jìn)行設(shè)計(jì)，PCR產(chǎn)物用4%(w/V)瓊脂糖凝膠電泳。通過交換率分析確定D814突變基因所在染色體區(qū)域。再根據(jù)國家水稻數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站(http:rapdb.dna.affrc.go.jp/)對(duì)該區(qū)域基因的注釋與分析，選取候選基因。最后設(shè)計(jì)引物，將PCR產(chǎn)物測(cè)序后確定突變基因。

1.5 耐鹽性表型試驗(yàn)

選取萌發(fā)一致的水稻種子，種植在裝有草炭土的種植盒中，每盒種植20粒水稻種子，每個(gè)株系種植8盒，分為對(duì)照組和處理組，封土，蓋好保鮮膜保濕，放在溫室中培養(yǎng)，待種子出苗后揭開保鮮膜，繼續(xù)培養(yǎng)2周左右，選取長勢(shì)一致的水稻幼苗放入150 mmol/L NaCl溶液中生長，每天觀察，待葉片萎蔫后進(jìn)行復(fù)水處理，每天觀察并統(tǒng)計(jì)復(fù)水存活率,實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Q-PCR)

分別剪取生長2周左右的野生型02428和突變體D814植株幼苗葉片，按Trizol試劑盒說明書步驟操作提取水稻總RNA，再用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。通過熒光定量PCR(IQ5 multicolor Real Time PCR Detection System)檢測(cè)乙烯信號(hào)途徑關(guān)鍵基因的表達(dá)。PCR反應(yīng)程序?yàn)?95℃ 10 min；95℃ 10 s，58℃ 30 s，72℃ 20 s，共45個(gè)循環(huán)；以每30 s上升0.5℃的速率從55℃升至95℃來做為溶解曲線程序。PCR反應(yīng)體系為:模板1 μL，正反向引物各0.5 μL，SYBR Green Mix 10 μL, 用H2O補(bǔ)齊到20 μL。所用引物序列見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙烯不敏感突變體篩選

通過對(duì)野生型02428進(jìn)行EMS誘變，獲得了3 000份水稻突變體材料，用10 mg/m3乙烯對(duì)其進(jìn)行篩選，得到3個(gè)根伸長生長對(duì)乙烯敏感性降低的突變體，分別是D848、D814以及D841(圖1，彩圖見圖版一)。用已報(bào)道的水稻乙烯不敏感突變體ein2(日本晴背景)作為對(duì)照，在黑暗條件下水培4 d。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，在10 mg/m3乙烯處理下，野生型日本晴(Nip)和ein2初生根長分別縮短為原來的35.45%和76.72%。野生型02428的初生根長在10 mg/m3乙烯處理下縮短為正常條件下的31.69%，而D848、D814和D841突變體經(jīng)同樣處理后，初生根長度分別縮短為原來的43.35%、65.50%、41.88%，該結(jié)果表明這3個(gè)突變體的根伸長生長對(duì)乙烯敏感性均有所降低，其中D814根的伸長生長對(duì)乙烯的不敏感性最明顯。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物序列Table 1 Sequences of the primers used in the experiment.

圖1 根對(duì)乙烯敏感性降低的水稻突變體篩選Fig.1 The screening of rice mutants with root decreased sensitivity to ethylenein.注：圖中為黑暗下生長4 d的幼苗在乙烯處理下的表型。其中，CK為對(duì)照組，未進(jìn)行乙烯處理；C2H4為處理組，進(jìn)行乙烯處理。(彩圖見圖版一)

2.2 D814參與調(diào)控乙烯信號(hào)途徑

為了進(jìn)一步研究D814突變體根對(duì)乙烯敏感性降低的分子機(jī)制，在水稻幼苗期進(jìn)行乙烯處理后，通過Q-PCR分別檢測(cè)了乙烯合成途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的下游調(diào)控基因的表達(dá)情況。對(duì)于乙烯合成家族基因，當(dāng)外源施加乙烯處理水稻幼苗時(shí)，無論是野生型還是突變體，基因表達(dá)量都顯著升高(圖2A)，而對(duì)于乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的下游調(diào)控基因，當(dāng)外源施加乙烯處理水稻幼苗時(shí)，OsSHR5和OsERF063的基因表達(dá)量只在野生型中有所上升，而在突變體中并未有明顯變化(圖2B)。該結(jié)果表明D814突變體阻斷了乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，而對(duì)乙烯合成途徑無影響，從而說明D814是通過乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來調(diào)控植物根對(duì)乙烯的敏感性降低。

2.3 D814突變體表型分析

圖2 D814調(diào)控乙烯信號(hào)途徑基因的表達(dá)Fig.2 D814 regulates the expression of ethylene signaling-related genes.注：A：乙烯合成途徑中的關(guān)鍵酶編碼基因表達(dá)；B：乙烯信號(hào)下游基因OsSHR5和乙烯信號(hào)下游轉(zhuǎn)錄因子OsERF063的基因表達(dá)。CK為對(duì)照組，未進(jìn)行乙烯處理； C2H4為處理組，進(jìn)行乙烯處理。相對(duì)定量以ACTIN2為內(nèi)參基因。**表示與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)。

d61突變體典型的表型就是株高變矮，其成熟期突變體高度相對(duì)野生型高度只有60%～70%左右，除此之外，d61突變體還會(huì)表現(xiàn)出直立葉、葉色深、突變體種子變黑等系列特征，其他的表型特征還包括葉夾角、葉鞘長度、分蘗數(shù)等[3～5]。分別對(duì)D814突變體在不同時(shí)期的表型進(jìn)行了觀察。在幼苗期，D814突變體與02428相比表現(xiàn)出株高顯著變矮(圖3A、3B,彩圖見圖版一)；在成熟期，D814突變體與02428相比，在株高、花期、葉型、葉夾角、粒長、粒寬等主要農(nóng)藝性狀方面都存在顯著差異(圖3C～圖3I)，尤其是突變體平均株高為野生型的50.44%，OsBRI1的等位突變體d61-2以及gsor300084等都表現(xiàn)出相似的表型。除此之外，D814也像其他OsBRI1等位突變體一樣，表現(xiàn)出典型的直立葉、葉色深黑以及褐粒等。對(duì)D814突變體成熟期的各個(gè)節(jié)間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)D814突變體株高變矮的原因主要是第一、第三和第四節(jié)間變短造成的。同時(shí)由于D814突變體粒長顯著小于野生型、粒寬略小于野生型，其千粒重也明顯低于野生型(表2)。這些結(jié)果表明D814能夠調(diào)控水稻的生長發(fā)育，而且D814在株高及種子的發(fā)育過程中具有十分重要的作用。

圖3 D814突變體與野生型表型比較Fig.3 Comparison of the phenotypes between D814 mutant and wild type.A：幼苗期植株；B：幼苗期根部；C：成熟期植株；D：成熟期節(jié)間長度；E：成熟期旗葉； F：成熟期穗部；G：成熟期穗頸及第一節(jié)間；H：成熟期籽長；I：成熟期粒寬(彩圖見圖版一)

2.4 D814突變基因定位

表2 D814突變體與野生型農(nóng)藝性狀比較Table 2 Comparison of agronomic traits between wild type and D814 mutant.

注：*和**分別表示同組數(shù)據(jù)中突變體與野生型相比差異顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)。

利用D814的矮桿表型對(duì)其突變基因進(jìn)行定位，在D814與培矮64(PA64)雜交的F2群體中篩選出了204株具有矮桿性狀的突變體單株。提取這些單株基因組DNA后，利用圖位克隆基因定位技術(shù)，首先將突變區(qū)間鎖定在1號(hào)染色體上，初步定位在2個(gè)標(biāo)記(rm1-33和rm1-34)之間，該區(qū)間的遺傳距離為1 cM(圖4A)。通過水稻數(shù)據(jù)庫(http://rice.plant)查閱發(fā)現(xiàn)該區(qū)間已報(bào)道的矮桿基因有6個(gè)，分別為：調(diào)控赤霉素信號(hào)途徑中的GA20氧化酶基因sd1，參與獨(dú)角金內(nèi)酯合成途徑的細(xì)胞色素P450蛋白CYP90D2基因d2，類胡蘿卜素裂解雙加氧酶編碼基因d10，編碼赤霉素3β-羥化酶的基因d18，編碼油菜素內(nèi)酯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的BR受體激酶的基因d61，以及編碼赤霉素信號(hào)途徑的GA受體的基因gid1。為了確定D814突變體矮化表型是否是由于這些基因引起的，分別提取野生型02428、突變體D814以及F2群體中隨機(jī)2個(gè)矮桿單株基因組DNA進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明只有d61(OsBRI1，LOC_Os01g52050)在其編碼區(qū)第1 837位堿基發(fā)生了點(diǎn)突變(由G突變?yōu)門)(圖4B)，導(dǎo)致其蛋白第613位氨基酸由甘氨酸變成了纈氨酸(G613V)(圖4C)。以上結(jié)果表明，D814突變體矮化表型可能是由于1號(hào)染色體上的d61等位突變引起。

圖4 突變基因D814在1號(hào)染色體上的定位圖Fig.4 Mapping of mutated gene D814 on chromosome 1.A、B：D814突變基因初步定位圖與測(cè)序結(jié)果；C：d61等位突變

為了進(jìn)一步驗(yàn)證該突變體是否由OsBRI1基因突變引起的，首先利用野生型以及突變體基因組DNA對(duì)其同源基因OsBRL1與OsBRL3啟動(dòng)子及基因組全長進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)只有OsBRI1基因在其CDS區(qū)第1 837位發(fā)生了堿基突變(由G突變?yōu)锳)，而其同源基因并沒有發(fā)生突變。另一方面，由于突變體D814是在水稻突變體庫中用乙烯處理篩選出來的，于是利用已經(jīng)報(bào)道的以野生型松前為背景的d61水稻突變體gsor300084，與突變體D814一起進(jìn)行乙烯處理，并觀察統(tǒng)計(jì)水稻根長，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，突變體gsor300084與D814一樣，初生根都表現(xiàn)出對(duì)乙烯的敏感性降低(圖5，彩圖見圖版一)。野生型02428和松前的初生根長在乙烯處理下分別縮短為正常條件下的26.47%和22.03%，而突變體D814和gsor300084分別縮短為57.14%和64.40%。從而進(jìn)一步表明D814突變體可能是d61的等位突變體。

圖5 d61等位突變體gsor300084乙烯表型Fig.5 Comparison of the ethylene insensitive phenotypes between D814 and d61 mutant.注：圖中為光下生長4 d的幼苗在乙烯處理下的表型。CK為對(duì)照組，未進(jìn)行乙烯處理； C2H4為處理組，進(jìn)行乙烯處理。(彩圖見圖版一)

2.5 D814參與BR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑

為了驗(yàn)證D814參與BR信號(hào)途徑，提取水培3 d的水稻幼苗總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后檢測(cè)BR信號(hào)響應(yīng)基因的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OsBRI1及其同源基因OsBRL1與OsBRL3基因表達(dá)量相對(duì)于野生型并沒有明顯變化，BR信號(hào)傳導(dǎo)途徑基因OsBAK1，其表達(dá)量相對(duì)于野生型也沒有明顯變化。而對(duì)于BR信號(hào)下游響應(yīng)基因OsOFP8、OsBLE1和OsBUL1，在突變體D814中其基因表達(dá)水平相對(duì)于野生型02428顯著降低，而BR信號(hào)途徑負(fù)調(diào)控因子OsGSK2的基因表達(dá)略有升高(圖6)。該結(jié)果表明D814參與BR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，也進(jìn)一步證明了D814突變體很可能就是d61等位突變體。

2.6 D814參與植物鹽脅迫應(yīng)答

圖6 D814調(diào)控BR信號(hào)途徑基因的表達(dá)Fig.6 D814 regulates the expression of BR signaling-related genes.注：相對(duì)定量以ACTIN2為內(nèi)參基因。*表示與野生型02428相比差異顯著(P<0.05)；**表示與野生型02428相比差異極顯著(P<0.01)。

鹽脅迫是植物非生物脅迫的一個(gè)重要方面，植物在抵御鹽脅迫過程中，一方面通過Na+/K+轉(zhuǎn)移等離子通道，另一方面通過調(diào)控體內(nèi)一些植物激素水平來減輕鹽脅迫對(duì)植物造成的傷害。之前的研究[24]表明，乙烯作為一種重要的植物激素，能夠負(fù)調(diào)控水稻耐鹽性，因此比較了突變體D814和野生型02428的耐鹽性。觀察發(fā)現(xiàn)，使用150 mmol/L NaCl處理7 d后，水稻幼苗開始出現(xiàn)葉片卷曲，其中突變體發(fā)生卷曲的葉片數(shù)少于野生型(圖7A，彩圖見圖版二)。拍照統(tǒng)計(jì)后對(duì)處理組幼苗進(jìn)行復(fù)水，復(fù)水5 d后拍照并統(tǒng)計(jì)成活率。結(jié)果顯示，野生型水稻幼苗復(fù)水后成活率為9.14%，而突變體復(fù)水后成活率為56.08%(圖7B)。說明D814突變體對(duì)高鹽脅迫的耐受力明顯高于野生型，并進(jìn)一步表明D814能參與調(diào)控水稻鹽脅迫應(yīng)答。

3 討論

隨著對(duì)植物激素乙烯的深入研究，越來越多的乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的新組分被挖掘出來。例如在水稻中篩選到的乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑突變體mhz6等[25]，這些新組分的篩選不但闡明和完善了乙烯在植物體內(nèi)的信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，而且為育種學(xué)家培育新品種提供了理論基礎(chǔ)。

圖7 D814突變體與野生型鹽脅迫表型比較Fig.7 Comparison of mutants D814 and wild type in response to salt stress.注：A：野生型和突變體幼苗鹽處理表型。B：野生型和突變體幼苗鹽處理后復(fù)水成活率。**表示同組數(shù)據(jù)與野生型相比極顯著(P<0.01)。(彩圖見圖版二)

本研究首先用10 mg/m3濃度乙烯處理2周左右的水稻幼苗，對(duì)實(shí)驗(yàn)室突變體庫進(jìn)行篩選，獲得了3個(gè)根對(duì)乙烯敏感性降低的突變體：D841、D814和D848，從而為后續(xù)探究乙烯在植物體內(nèi)的作用及分子機(jī)理提供了寶貴的材料。由于突變體D814初生根的伸長生長對(duì)乙烯的敏感性最低，因此選擇D814突變體作為進(jìn)一步的研究材料。表型觀察發(fā)現(xiàn)D814在整個(gè)植株生長發(fā)育的過程中，都表現(xiàn)出植株矮化、分蘗數(shù)減少、千粒重下降等顯著特征，與大多數(shù)OsBRI1基因的等位突變體相似，具有直立葉、葉色深等表型，說明D814可能是BR信號(hào)途徑有關(guān)的突變體，能夠參與水稻生長發(fā)育的調(diào)控，也說明D814在調(diào)控水稻生長發(fā)育過程中具有十分重要的作用，特別是在調(diào)控水稻株高方面。通過圖位克隆，將D814突變基因初步定位在1號(hào)染色體上遺傳距離為1 cM的區(qū)間內(nèi)，并通過基因測(cè)序表明其中的d61基因在編碼區(qū)1 837位堿基發(fā)生了點(diǎn)突變(由G變成T)，導(dǎo)致氨基酸的改變。從而說明D814突變基因很可能是d61的等位突變。之前的研究報(bào)道了d61的2個(gè)等位突變體d61-1和d61-2也都是點(diǎn)突變體(圖4)。d61編碼一個(gè)BR受體蛋白激酶，突變后會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)BR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受阻，從而表現(xiàn)出節(jié)間伸長被抑制、葉片直立等典型特征[26]。在水稻中，BR不僅能夠單獨(dú)調(diào)控植物的生長發(fā)育，BR也能參與植物激素乙烯的合成與調(diào)控。例如BR與乙烯相互拮抗來共同調(diào)節(jié)下胚軸的生長[27]，也可以通過增強(qiáng)乙烯合成限速酶ACS5蛋白的穩(wěn)定性來調(diào)控乙烯的生物合成[28]。BR處理后，可以提高乙烯不敏感突變體ein2在鹽脅迫下種子的發(fā)芽率[29]。而D814作為BR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受阻的突變體，幼苗期根部表現(xiàn)出對(duì)乙烯敏感性降低的特征，表明D814可作為一個(gè)良好的材料，對(duì)其深入研究將會(huì)為闡明油菜素內(nèi)酯與乙烯協(xié)同調(diào)控水稻生長發(fā)育機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

由于初定位的遺傳距離1 cM的區(qū)間范圍太大，在該區(qū)間內(nèi)是否還有其他基因發(fā)生突變尚不清楚，同時(shí)為了進(jìn)一步的驗(yàn)證D814突變基因確實(shí)是OsBRI1，首先通過對(duì)同源基因OsBRL1和OsBRL3啟動(dòng)子和基因組序列全長進(jìn)行測(cè)序發(fā)現(xiàn)，其同源基因并沒有發(fā)生任何突變，只有OsBRI1基因在其CDs區(qū)發(fā)生了點(diǎn)突變(圖4)，進(jìn)一步推測(cè)，如果突變基因確實(shí)是OsBRI1，那么D814突變體就應(yīng)該和已報(bào)道的d61等其他突變體一樣具有相似的表型，于是對(duì)已報(bào)道的d61等位點(diǎn)突變體gsor300084進(jìn)行乙烯處理，觀察D814與gsor300084突變體根部表型，通過統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)D814和gsor300084一樣，根部都表現(xiàn)出對(duì)乙烯敏感性降低(圖5)，從而進(jìn)一步說明D814很可能是OsBRI1的一個(gè)新的等位突變體。最后，進(jìn)一步檢測(cè)了D814突變體中BR信號(hào)響應(yīng)基因的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)突變體中這些基因的表達(dá)量與02428野生型有顯著差異(圖6)，進(jìn)一步說明D814參與BR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，但還需要進(jìn)一步的精細(xì)定位以及遺傳數(shù)據(jù)等來證明。

乙烯功能的發(fā)揮最終都是將乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)給下游一些轉(zhuǎn)錄因子，從而啟動(dòng)乙烯相關(guān)基因的表達(dá)。在水稻中，乙烯處理能顯著誘導(dǎo)乙烯信號(hào)下游基因OsSHR5(LOC_Os08g10310)與OsERF063(LOC_Os09g11480)超高量表達(dá)[30]。而在D814突變體中，基因OsSHR5與OsERF063的表達(dá)量在乙烯處理前后并沒有顯著的差異，表明D814參與乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而使突變體D814表現(xiàn)出根對(duì)乙烯的敏感性下降。之前研究表明，在水稻中乙烯能夠負(fù)調(diào)控水稻的耐鹽性[31]，并且發(fā)現(xiàn)D814表現(xiàn)出耐鹽性增加，進(jìn)一步表明D814通過阻斷乙烯信號(hào)途徑提高了植物的耐鹽性。以上研究對(duì)闡明乙烯在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育和鹽脅迫應(yīng)答中發(fā)揮功能的分子機(jī)制具有十分重要的意義。

綜上所述，本研究鑒定了3個(gè)乙烯敏感性降低的水稻突變體，這些突變體的根都呈現(xiàn)了對(duì)乙烯的鈍感表型。通過圖位克隆方法初步鑒定D814可能為BR途徑的受體激酶OsBRI1點(diǎn)突變。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，D814突變體呈現(xiàn)耐鹽性增加，揭示了乙烯可能通過BR途徑調(diào)控根生長和鹽脅迫反應(yīng)的機(jī)制。這些研究對(duì)于揭示水稻乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制具有重要意義，為探究乙烯調(diào)控水稻生長發(fā)育及耐逆性的機(jī)理提供了研究材料，也為進(jìn)一步探討油菜素內(nèi)酯與乙烯協(xié)同調(diào)控水稻生長發(fā)育機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)。

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Map-basedCloningandFunctionAnalysisofRiceDwarfMutantD814

CHEN Xinbing, HUANG Rongfeng*, WANG Juan*

BiotechnologyResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100081,China

Plant height confers important effects on crop yield in rice, which is regulated by many aspects in the growth and development process. Ethylene is one of important factors for regulating plant growth and stress response. In this research, we identified a mutantD814 from the mutants insensitive to ethylene in roots growth.D814 mutants showed the dwarf phenotype, decreased effective tilling numbers and reduced 1000-grain weight. Map-based cloning indicated thatD814 located in 1 cM range on chromosome 1, in which there contained six genes contributed to dwarf phenotype in the previous researches. Sequencing analyses demonstrated thatOsBRI1(LOC_Os01g52050) has a point mutation at 1 837 bp downstream of ATG, in which the G is changed to T. There were two homologous genes ofOsBRI1 in rice,OsBRL1 andOsBRL3, of which the sequences have no mutation inD814 mutants. A reported mutant ofOsBRI1,gsor300084, also showed decreased sensitivity to ethylene in root. Due to the function of OsBRI1 was a receptor in brassinosteroid (BR) signal pathway, we found the expressions of BR-response genes were affected inD814, which indicated thatD814 was an allele mutant ofOsBRI1. Moreover, our analyses showed thatD814 affected the expression levels of ethylene signaling-related genes and displayed increased salt tolerance. Thus our research provided a novel research material for exploring the molecular mechanism of ethylene regulating rice growth and stress tolerance, and laid a foundation for investigating the interplay of ethylene and brassinosteroid in growth and development.

rice; ethylene; dwarf; map-based cloning; salt stress response

2017-05-10;接受日期2017-07-10

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31470366)資助。

陳新兵，碩士研究生，研究方向?yàn)樗拘禄虬l(fā)掘與功能研究。E-mail:chenxinbing_caas@163.com。*通信作者：黃榮峰，研究員，主要從事植物激素與逆境脅迫應(yīng)答研究。E-mail:rfhuang@caas.cn；王 娟，助理研究員，主要從事作物蛋白質(zhì)功能研究。E-mail:wangjuan@caas.cn

10.19586/j.2095-2341.2017.0040