家雞全基因組測序研究進展

李東華 王鑫磊 李轉見 孫桂榮 康相濤 閆峰賓

（河南農(nóng)業(yè)大學牧醫(yī)工程學院 河南省家禽種質資源創(chuàng)新工程研究中心，鄭州 450002）

家雞全基因組測序研究進展

李東華 王鑫磊 李轉見 孫桂榮 康相濤 閆峰賓

（河南農(nóng)業(yè)大學牧醫(yī)工程學院 河南省家禽種質資源創(chuàng)新工程研究中心，鄭州 450002）

雞具有獨特的生物學特性。全基因組測序是即對一種生物的基因組中的全部基因進行測序，主要包括de novo 測序和全基因組重測序。近年來，由于測序技術的飛速發(fā)展，雞全基因組研究取得了很多重要的進展，為解釋雞的生物學特性和縮短分子育種周期發(fā)揮了重要作用。重點闡述了不同品種雞全基因組de novo 測序的完成、全基因組重測序技術在解析品種遺傳多樣性、揭示進化機制、質量性狀遺傳機制廣泛應用，討論了雞全基因組測序工作存在的問題及其展望，旨在為家雞種質資源的改良和分子育種提供重要的參考資料。

雞；基因組；測序

家雞（Gallus domesticus）屬于鳥綱，雞形目，雉科，原雞屬。研究表明，南亞、東南亞和我國北方地區(qū)是重要家雞起源地［1］。我國幅員遼闊，地形復雜，加之各民族間的不同文化以及勞動人民長期自然選擇和人工選擇，雞種體型外貌如羽色、羽型、膚色、冠型、爪型及生產(chǎn)性狀方面差異顯著，是家禽遺傳資源的重要組成部分。據(jù)2011年出版的《中國畜禽遺傳資源志家禽志》一書收錄雞品種116個，其中地方品種雞107個［2］。

1977年，Sanger等［3］發(fā)明的DNA雙脫氧鏈終止測序法標志著基因組學研究的開端。經(jīng)過科研人員持續(xù)不斷的技術改良和革新測序手段和平臺，以Roche公司的454技術（2005年）、Illumina公司的Solexa技術（2006年）和ABI公司的SOLiD技術（2007年）為標志的第二代高通量測序技術（Nextgeneration sequencing，NGS）相繼誕生，對動物基因組重測序的發(fā)展起到了重要的作用［4］。雞既是重要的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟動物，能夠為人類生活提供優(yōu)質的蛋和肉等禽產(chǎn)品，同時也是研究遺傳多樣性和進化選擇機制的模式生物之一，是分子生物學和現(xiàn)代醫(yī)學研究的重要素材［5，6］。本文將介紹雞基因組測序的發(fā)展歷程，概述雞基因組測序研究內(nèi)容，討論雞基因組測序工作的遇到問題以及展望。旨為家雞種質資源的改良和分子育種提供重要的參考資料。

1 雞全基因組de novo測序

全基因組de novo測序亦稱為從頭測序，是指不參考或者依賴某物種現(xiàn)有序列和其他物種的資料，對某物種直接進行基因組測序，然后應用生物信息學手段對測序序列進行拼接和組裝，完成一個完整的基因組序列，從而繪制該物種的全基因組序列圖譜。對研究物種的基因組結構和功能基因信息，闡明和解釋物種的進化及其生物學特性具有重要的意義［7］。

在“人類基因組計劃”（Human genome project，HGP）進行得如火如荼的同時，家禽科學領域也進行著場類似的革命，并且取得了大的成功。2004年，《Nature》雜志報道了雞de novo全基因組組裝工作的結果，首次發(fā)表了其完整基因組序列，標志著這一物種學科發(fā)展的新開端?！半u基因組測序工程”中測序文庫的基因組DNA均來自于一只雌性近交系的紅色原雞，具有Z和W性染色體，含有常染色體50%的基因組。所有序列組裝拼接是在6.6倍整個基因組shotgun序列覆蓋率的情況下完成的；序列拼接程序為PCAP，拼接是在一個基于BAC文庫的物理圖譜和遺傳圖譜的指導下完成，拼裝序列含有1.05 Gb個堿基對，其中contigs的N50長度是36 kb，總覆蓋率為98%，堿基替代率為0.02%［8］。雞基因組測序計劃的完成，不僅為遺傳學、發(fā)育生物學的相關研究提供了大量重要的信息，也為理解脊椎動物的進化提供了一個關鍵物種的信息，其所有可利用的信息資源都為后基因組學的研究奠定了基礎

藏雞是一種分布于青藏高原的古老雞種，經(jīng)過長期的自然選擇和人工選擇作用，對青藏高原特殊環(huán)境表現(xiàn)出很強的適應性，這是其他雞種所不具備的獨特種質特性。2015年，中國科學院昆明動物研究所張亞平課題組對一只雌性藏雞進行de novo測序，繪制完成高質量的藏雞基因組序列圖譜，標志著中國地方雞種遺傳資源的開發(fā)利用進入一個更高的層面。并且對5只紅原雞和其他27只不同地區(qū)的家雞（10只藏雞，8只本地雞，8只西雙版納斗雞和1只羅曼商品代母雞）進行了全基因組重測序，通過比較基因組學和群體基因組學手段揭示了藏雞的高原適應性進化的遺傳機制。分析結果顯示藏雞分成兩個群體，兩個群體之間沒有基因交流，推斷這兩支藏雞可能分別來自兩個獨立的世系。隨后分別對兩支藏雞群體進行有效群體規(guī)模研究和選擇信號檢測發(fā)現(xiàn)，兩個群體中受到選擇作用的基因在鈣離子信號通路中出現(xiàn)富集，說明鈣離子通路在藏雞的高原適應中有著重要的作用。該研究在基因組水平對藏雞品種資源進行了初步的評估，揭示了藏雞高原適應的潛在遺傳機制，對藏雞品種資源的保護和培育均具有理論指導意義，而且對研究人類高原缺氧反應提供了重要的線索［9］。

隨著測序技術和生物信息學的飛速發(fā)展，一個物種基因組計劃的完成，意味著這一物種學科的新開端，不同種屬雞基因組的破譯使人們可以更好的了解不同品種雞的生物學特性，豐富了品種的多樣性，根據(jù)不同的特點，做好保種的同時，加快不同品種的選育進程。

2 雞全基因組重測序

全基因組重測序是指對基因組信息已知參考基因組的物種不同個體進行的整個基因組測序，通過生物信息學的分析，并在個體或群體水平進行序列差異性分析的測序方法。具有分析結果快速、準確、靈敏度高和自動化的技術特點。可以檢測到大量與性狀關聯(lián)的遺傳變異信息（包括SNP、Indel、SV和CNV甚至新基因等）。通過變異信息注釋、系統(tǒng)進化和群體遺傳結構分析等方法，不僅可以預測動物重要性狀候選基因；同時能夠利用SNPs研究物種的遺傳多樣性、遺傳圖譜構建、進化歷史、環(huán)境適應性、自然選擇等生物學問題，為分子遺傳育種奠定了數(shù)據(jù)基礎，進而縮短分子育種的實驗周期［10，11］。

2.1 雞全基因組重測序解析品種遺傳多樣性

受國外品種的沖擊，我國優(yōu)良地方品種雞數(shù)量不斷下滑，品種資源流失嚴重。隨著雞全基因組序列的公布，雞全基因重測序研究取得了較大進展。Shibolet等［12］利用全基因組重測序鑒別家雞在進化過程中可能存在的突變。對家雞及其野生祖先紅原雞進行了全基因組重測序，共發(fā)現(xiàn)了7 000 000個SNPs，1 300個缺失突變和若干選擇性清除，并且發(fā)現(xiàn)TSHR基因在該研究的所有家雞中均存在選擇性清除，該基因在脊椎動物的代謝調(diào)節(jié)及生殖過程中發(fā)揮著重要作用。Seo等［13］采用Illumina HiSeq 2000測序平臺對韓國不同羽色的本地雞種進行重測序分析，獲得36 660 731 136±1 257 159 120 bp的原始序列，從29號染色體和Z染色體上共獲得4 006 068± 97 534個SNPs，在這些已鑒別的SNPs中有2 948 648± 81 414個是已知，其中被定義的SNPs有1 181± 150個；新發(fā)現(xiàn)的SNPs是1 047 951± 14 956個，未被定義的SNPs有8 238± 1 019個。同義突變的SNPs有26 266±1 456，錯義突變有11 467 ± 604個和特征改變有8 180± 458個。

Yi等［14］基于全基因組重測序基礎研究了12只來源于不同品種雞的全基因組CNV，發(fā)現(xiàn)了8 840個CNVs區(qū)域，覆蓋了98.2 Mb，占雞基因組的9.4%，這些CNVs大小從1.1-268.8 kb不等，平均長度為11.1 kb?？偣差A測到2 214個CNVs跨越2 216個具有特定生物學功能相關的基因。同時被部分CNVs覆蓋的區(qū)域發(fā)現(xiàn)了FZD6L基因和IMS1基因，這兩個基因與疾病易感性和抗病性相關。Fan等［15］對一只絲羽烏骨雞和一只臺灣本地雞進行了深度為23X和25X的全基因組重測序，共鑒定出大約760萬個SNPs和8 839個CNVs，其中42% SNPs為新發(fā)現(xiàn)；13 537個基因的編碼區(qū)存在27 852個非同義突變，分析了這些檢出變異與表型的可能關系，選擇清除分析發(fā)現(xiàn)ROHO2、ARID4B、NELL1等與生長相關、食欲和代謝調(diào)節(jié)等途徑相關的基因被確認。

2.2 雞全基因組重測序揭示進化機制

2010年，Rubin等［16］利用全基因組測序的方法研究家雞在馴化過程中受選擇的位點，首先對蛋雞、肉雞等8個品種的家雞的基因組進行混池測序，鑒定出約700萬個SNPs和1 300個缺失，應用標準化雜合度方法篩選雞馴化過程受選擇的基因，鑒定出了一些與繁殖、生長和代謝有關的位點。Wang等［17］利用全基因組重測序技術對5只紅色原雞和8只云南本地雞進行測序，平均測序深度18.9×。一共獲得17 115 375 個SNPs，約一半位于基因間區(qū)。其中70 990個SNPs引起氨基酸非同義替代，174 748個引起同義替代。有445個基因發(fā)生終止密碼子的缺失與獲得?；蚪M數(shù)據(jù)分析意外發(fā)現(xiàn)大量視覺相關基因在家雞馴化過程中受到正選擇作用，而非選擇壓力放松；結合家雞和紅原雞的視網(wǎng)膜、大腦皮層、紋狀體、視葉和小腦蚓部的轉錄組數(shù)據(jù)，揭示了家雞視覺退化的遺傳機制。Qanbari等［18］利用商用雞的重測序數(shù)據(jù)，基于位點的雜合度發(fā)現(xiàn)IGF1、INSR、LEPR等基因受選擇影響。

2.3 雞全基因組重測序揭示質量性狀遺傳機制

Jin等［19］通過興義矮腳雞為研究材料，組建Cp基因型分離家系，采用全基因組重測序及生物信息分析，首次揭開了雞匍匐性狀形成的基因之謎，其由7號染色體上21 798 705-21 810 600 bp區(qū)域IHH基因的缺失所引起，有助于對我國地方雞品種資源的保護、開發(fā)和利用。Wang等［20］通過對東鄉(xiāng)雞、盧氏綠殼蛋雞和美國的一個綠殼蛋品種Araucana雞全基因組重測序等研究，發(fā)現(xiàn)雞綠殼蛋色的形成是由SLCOIB3基因上游EAV-HP序列的插入而引起的。SLCOIB3基因及其突變是迄今為止世界上第一個被發(fā)現(xiàn)的與蛋殼顏色形成相關的基因突變。雞絲羽表型是由常染色體上的隱性基因控制的單基因遺傳性狀，是一些品種特有的表型性狀。Feng等［21］通過高通量測序分析發(fā)現(xiàn)，雞絲羽表型是由雞3號染色體上PDSS2基因的一個順式調(diào)控SNP位點突變所引起的，建立了絲羽性狀的DNA分子標記。Wright等［22］通過連鎖分析和重測序分析等方法發(fā)現(xiàn)，在SOX5基因的一段非編碼序列拷貝數(shù)的增加形成了豆冠表型，揭開了雞豆冠的分子機制。Eriksson等［23］通過研究發(fā)現(xiàn)雞黃色皮膚形成是由個或多個順式調(diào)控和組織特異性調(diào)控的突變進而影響B(tài)CDO2基因的表達造成的。

3 雞全基因組測序研究面臨的問題和展望

近年來，第二代高通量測序技術發(fā)展迅猛，技術不斷進行改進，檢測成本不斷降低，測序通量和讀長都得到明顯改善，如Illumina公司發(fā)布的Hiseq X Ten測序平臺、Pacific Biosciences公司的PacBio測序。雖然二代測序技術解決了以前的很多研究難題，給全基因組測序技術帶來更新突破的同時也使得其局限性和挑戰(zhàn)性日益凸顯。其后期巨大的數(shù)據(jù)量對生物信息學分析能力的要求也越來越高以及如何方便準確地儲存、分析、傳遞及利用數(shù)據(jù)是一個亟待解決的問題［24，25］。再者，雖然與第一代測序技術相比價格有了明顯的降低，但全基因組重測序其受限樣品量，較適合大規(guī)模的測序，總體價格有望更低，有效利用這些數(shù)據(jù)，從海量的數(shù)據(jù)中充分挖掘出其中的生物學意義，檢索和交換數(shù)據(jù)成為一個重大課題。以單分子測序為特點的單分子DNA測序技術等經(jīng)濟實惠的第三代測序技術也已經(jīng)發(fā)展起來［26］，增加了測序讀長和通量，并且無DNA擴增環(huán)節(jié)，極大地降低了測序成本，在全基因組測序方面都得到了很好的應用［27］，將有利于展開雞全基因基因組測序工作，促進基因組學研究的發(fā)展。

我國地方雞遺傳資源非常豐富。首先從頭測序方面，只是破譯了藏雞的基因組序列，如斗雞等特殊雞的品種全基因組信息還未知，更應該深度開發(fā)我國特殊性狀物種的測序，促進重要基因資源的挖掘、保護和利用；其次，科研人員雖然在不同群體發(fā)現(xiàn)SNPs、InDels和CNVs等大量的變異信息，但對很多雞品種核心種質的重測序工作還未開展，開展核心種質資源重測序對雞遺傳資源保護及特殊種質資源的開發(fā)保護利用具有重要科學意義。然后通過開展從單一基因研究深入到全基因組關聯(lián)分析研究中，大力推動我國基因組學在基因克隆與分子育種領域的應用研究，提高育種能力和水平。最后加強與轉錄組學、代謝組學、蛋白質組學和降解組學的等多組學的相關研究，促進基因組學生物信息的共享與利用。

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（責任編輯 李楠）

Research Advances on Whole Genome Sequencing of Chicken

LI Dong-hua WANG Xin-lei LI Zhuan-jian SUN Gui-rong KANG Xiang-tao YAN Feng-bin
（College of Animal Science and Veterinary Medicine，Henan Agricultural University，Henan Innovative Engineering Research Center of Poultry Germplasm Resource，Zhengzhou 450002）

Chicken possesses unique biological traits. Whole genome sequencing is the sequencing of all genes in a biological genome，mainly including de novo sequencing and whole genome re-sequencing. With the rapid development of sequencing technology in recent years，there have been great progresses in chicken genome research，which plays a critical role in explaining the biological characteristics of chicken and shortening the period of molecular breeding. This paper mainly describes the de novo sequencing completion of whole genome in different chicken cultivars，as well as the wide application of whole genome re-sequencing technology in analyzing genetic diversity，revealing evolutionary mechanisms and genetic mechanisms of quality traits，and further discusses the existing issues and potential prospects in the chicken whole genome sequencing. The aim is to provide a resource for genetic improvement and breeding programs.

chicken；genome；sequencing

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0194

2017-03-14

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系建設專項資金（CARS-41-K04），教育部創(chuàng)新團隊（IRT16R23），河南省科技重大專項（151100110800）

李東華，女，博士研究生，研究方向：家禽遺傳育種；E-mail：2802335621@qq.com

閆峰賓，男，博士，講師，研究方向：家禽遺傳育種與生產(chǎn)教學與科研；E-mail： yanfb790811@sina.com