茯磚茶中咖啡堿與EGCG的HPLC檢測分析

秦俊哲， 劉凱利， 黃亞亞, 王亞麗, 胡 歆， 鄧永亮， 劉文軍

(1.陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 陜西 西安 710021; 2.陜西蒼山茶葉有限責(zé)任公司， 陜西 咸陽 710003)

茯磚茶中咖啡堿與EGCG的HPLC檢測分析

秦俊哲1， 劉凱利1， 黃亞亞2, 王亞麗1, 胡 歆2， 鄧永亮2， 劉文軍2

(1.陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 陜西 西安 710021; 2.陜西蒼山茶葉有限責(zé)任公司， 陜西 咸陽 710003)

利用高效液相等度洗脫法研究人工接種條件下茯磚茶中咖啡堿和EGCG的檢測條件及含量.結(jié)果表明，HPLC的檢測條件為：流動(dòng)相A 甲醇，B 5×10-5mol/L KH2PO4溶液 (pH=5)，A∶B =20∶80，咖啡堿和EGCG 的進(jìn)樣量在25～400μg 范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，r>0.999 0，咖啡堿和EGCG的平均加標(biāo)回收率及RSD分別為98.32%、97.18%、1.96%、1.73%，該方法分離效果好，重復(fù)性高，可用于同時(shí)測定茯磚茶中咖啡堿與EGCG的含量.在此基礎(chǔ)上，第一、二次汽蒸后接種及CK成品茶的咖啡堿含量分別為23.63 mg/g、20.08 mg/g、24.37 mg/g，其EGCG的含量分別為6.43 mg/g、3.79 mg/g、8.31 mg/g，第二次汽蒸后接種最適宜.

茯磚茶； 高效液相色譜法； 咖啡堿； EGCG

0 引言

茯磚茶是最具特色的黑茶系類產(chǎn)品，加工工藝長而復(fù)雜，屬后發(fā)酵茶[1]，含有多種功效成分，其中最主要的成分有表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、咖啡堿及茶氨酸等[2].現(xiàn)階段對(duì)于咖啡堿及EGCG的檢測方法有高效液相色譜法、薄層掃描法、近紅外光譜法及紫外分光光度法等[3-6]，其中高效液相色譜法穩(wěn)定可靠，簡便快速，應(yīng)用最廣泛.

目前，多數(shù)進(jìn)行EGCG、咖啡堿單個(gè)成分的高效液相檢測，在實(shí)踐中費(fèi)時(shí)費(fèi)工，能否同時(shí)檢測茯磚茶中的咖啡堿和EGCG尚未報(bào)道，因此本文采用HPLC法對(duì)人工接種發(fā)花過程中的咖啡堿與EGCG含量進(jìn)行檢測，并選擇茯磚茶的兩個(gè)不同生產(chǎn)工段進(jìn)行人工接種，優(yōu)化發(fā)花工藝，探明人工接種的最佳時(shí)機(jī)，一方面為茯磚茶中咖啡堿和EGCG的檢測提供借鑒，另一方面為茯磚茶人工接種發(fā)花生產(chǎn)提供一些理論依據(jù).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

(1)主要材料：咖啡堿(CAF)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、L-茶氨酸為標(biāo)品，北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司；甲醇(色譜純)，酒石酸鉀鈉、蒽酮、濃硫酸、乙酸乙酯、正丁醇等均為分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司.

(2)主要儀器：P1201型高效液相色譜儀，大連依利特分析儀器有限公司；FW100型高速萬能粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司；KQ5200型超聲波清洗機(jī)，昆山市超聲儀器有限公司；SP-756PC型紫外分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司；LS-C50L型立式壓力蒸汽滅菌器，江陰濱江醫(yī)療設(shè)備廠.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法

圖1是茯磚茶加工工藝及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)流程，取拼配料30 kg，分成75份.如圖1所示，在第一次汽蒸后和第二次汽蒸后各接種冠突散囊菌純菌種發(fā)酵劑25塊，其余為對(duì)照，壓制后送入發(fā)花室.從第2 d開始，每2 d取樣一次，每次取樣各取2塊，分別對(duì)樣品中的茶多酚、EGCG及咖啡堿含量進(jìn)行檢測.

發(fā)酵劑制備：將長滿斜面的冠突散囊菌菌落制成菌懸液，然后接種于麩皮培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)8 d后，45 ℃烘干，粉碎過篩，即得冠突散囊菌純菌種發(fā)酵劑.

圖1 茯磚茶加工工藝及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)流程

1.2.2 檢測方法

咖啡堿與EGCG采用高效液相色譜法[7]；

茶多酚總量采用GB/T8313-2002(酒石酸亞鐵比色法)[8].

1.2.3 色譜條件

P1201型高效液相色譜儀,色譜柱Sino Chrom ODS-BP (C18，250 mm×4.6 mm，5.0μm)；流動(dòng)相：甲醇(A)-5×10-5mol/L KH2PO4溶液(B,磷酸調(diào)pH為5)(20∶80)；柱溫30 ℃，流速1.0 mL/min；檢測波長210 nm，進(jìn)樣20μL.

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線

準(zhǔn)確稱取2種標(biāo)準(zhǔn)品，純水溶解，配置濃度400μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，逐級(jí)稀釋，標(biāo)準(zhǔn)系列為400、200、100、50、25μL.按1.2.3色譜條件分別進(jìn)樣各質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行測定，各做3次平行，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線圖譜、回歸方程及r值.

1.2.5 樣品處理

茶葉樣品粉碎過80μm(80目)篩，準(zhǔn)確稱取0.25 g茶葉，加入70%乙醇12.5 mL，超聲浸提45 min，待其冷卻后離心10 min，轉(zhuǎn)速5 000 r/min，取上清液；在茶葉殘?jiān)屑尤?0%乙醇12.5 mL,再超聲提取45 min，相同轉(zhuǎn)速下離心，取上清液，合并兩次上清液，混勻.將上清液經(jīng)0.45μm濾膜過濾兩次，濾液用純水定容至50 mL，搖勻，即得供試液.

1.2.6 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

在已知含量的茶樣浸取液中添加一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，做加標(biāo)回收試驗(yàn)，檢驗(yàn)該方法的準(zhǔn)確度.準(zhǔn)確量取一定量的咖啡堿和EGCG茶樣提取液2份，分別添加一定體積的125μg/mL的咖啡因和EGCG的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，混勻，按1.2.3色譜條件平行測定3次，計(jì)算回收率.

1.2.7 精密度

取50μg/mL 的咖啡堿與EGCG標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別連續(xù)進(jìn)樣6次，測定咖啡堿與EGCG標(biāo)準(zhǔn)品峰面積的RSD值.

1.2.8 樣品測定

分別精密吸取1.2.5中得到的供試液20μL，按1.2.3色譜條件進(jìn)樣，測定其峰面積，在此條件下，咖啡堿與EGCG可以很好地被分離，色譜圖如圖2所示.

2 結(jié)果與討論

2.1 線性關(guān)系

咖啡因和EGCG在25～400μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，如表1所示.

表1 2種標(biāo)準(zhǔn)品的回歸方程及相關(guān)系數(shù)

2.2 色譜圖

在1.2.3色譜條件下，得到咖啡堿與EGCG兩種標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間，分別為咖啡堿32.1 min， EGCG 51.7min，如圖2(a)、(b)、(c)所示.茶樣提取液進(jìn)樣后得到的譜圖如圖2(d)所示.

(a)咖啡堿標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照譜圖

(b)EGCG標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照譜圖

(c)咖啡堿和EGCG混標(biāo)譜圖

(d)茯磚茶樣品譜圖圖2 高效液相色譜圖

2.3 回收率

咖啡堿與EGCG平均加標(biāo)回收率分別為98.32%和97.18%，結(jié)果較理想.

2.4 精密度

咖啡堿與EGCG標(biāo)準(zhǔn)品峰面積的RSD值分別為1.96%和1.73%，結(jié)果表明系統(tǒng)的精密度良好.

2.5 茯磚茶加工過程中咖啡堿含量結(jié)果分析

由圖3可知，發(fā)花前中期(2 d～8 d)，咖啡堿含量變化不明顯，發(fā)花第12 d之后，三種不同工藝茶磚的咖啡堿含量逐漸下降，其中第二次汽蒸后接種茶磚的咖啡堿含量下降速度最快，原因是第二次汽蒸后接種茶磚的發(fā)花效果最好，即冠突散囊菌的數(shù)量最多，有利于咖啡堿的轉(zhuǎn)化.發(fā)花前中期(8 d之前)，汽蒸1、汽蒸2及CK茶磚的咖啡堿含量變化趨勢基本一致，含量分別降低了9.08%、11.66%、7.83%；發(fā)花第10 d至成品茶，第二次汽蒸后茶磚的咖啡堿含量下降最顯著，減少至20.08 mg/g，下降了43.37%，CK減少了31.27%.咖啡堿含量的降低與茯磚茶中冠突散囊菌的活動(dòng)息息相關(guān)[9]，冠突散囊菌活動(dòng)越劇烈，咖啡堿含量下降越明顯，因?yàn)榭Х葔A化學(xué)性質(zhì)雖穩(wěn)定，但在微生物酶促作用及濕熱環(huán)境條件下，咖啡堿會(huì)轉(zhuǎn)化成可可堿或其他茶葉堿等，還可以與多酚類物質(zhì)復(fù)合，與酸生成鹽等.咖啡堿是茶葉中主要的苦味物質(zhì)，有多種保健功效，少量咖啡堿的攝入有助于提神、抗菌、抗癌等作用，過多的攝入則會(huì)產(chǎn)生毒害作用[10].

圖3 茯磚茶加工過程中咖啡堿含量的變化

2.6 茯磚茶加工過程中EGCG含量結(jié)果分析

由圖4可知，茯磚茶加工過程中EGCG的含量均呈現(xiàn)下降趨勢，其中第二次汽蒸后接種茶磚的EGCG含量下降最明顯，減少了87.88%，汽蒸1與CK的下降變化相當(dāng)，分別減少79.62%、73.66%.兩次汽蒸相比，第二次汽蒸后接種茶磚的EGCG含量下降速度更快，EGCG含量的減少有助于茶葉澀味的降低，從EGCG含量的變化及發(fā)花效果可知：第二次汽蒸后接種比第一次汽蒸后要好.EGCG含量下降的原因是：酯型兒茶素在濕熱作用及水解作用下分解成簡單兒茶素和沒食子酸，簡單兒茶素再通過自動(dòng)氧化及微生物酶促作用轉(zhuǎn)化成茶褐素、茶黃素和茶紅素等物質(zhì)[11]，使茶湯滋味由苦澀變醇和，湯色由暗黃變紅橙，湯味也更加濃純有味，提高了茶葉的品質(zhì).

兩種加工階段接種茶磚的EGCG含量變化情況存在差異，這與冠突散囊菌的生長繁殖代謝也有密切關(guān)系，冠突散囊菌的數(shù)量越多，其酶促作用越強(qiáng)，EGCG含量的下降速度也就越明顯.研究表明，EGCG具有抗癌、抗氧化、抗突變、調(diào)理內(nèi)分泌及免疫系統(tǒng)等生物活性[12]，還可以通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝而抑制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展[13].

圖4 茯磚茶加工過程中EGCG含量的變化

2.7 茯磚茶加工過程中茶多酚含量結(jié)果分析

由圖5可知，從拼配料到成品茶，茶多酚含量減少的順序?yàn)椋浩?>汽蒸1>CK，分別下降了31.98%、26.90%、25.22%，第二次汽蒸后接種茶磚的茶多酚含量下降趨勢最明顯，汽蒸1與CK的茶多酚含量下降趨勢相對(duì)較緩.拼配料中茶多酚的含量為20.76%，成品茶中茶多酚含量降低至14%～15%.茶多酚是茶葉中三大特征性成分之一，易發(fā)生自動(dòng)氧化，也會(huì)在微生物酶促作用下被降解分解，因此其含量是一直減少的[14].茶多酚具有很好的保健功效，如抗氧化、抗高血脂及延緩衰老等，有關(guān)茶多酚的研究目前也是藥學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[15-17].

圖5 茯磚茶加工過程中茶多酚含量的變化

3 結(jié)論

在茯磚茶生產(chǎn)加工的兩次汽蒸后進(jìn)行人工接種，并對(duì)加工過程中試驗(yàn)茶磚的咖啡堿和EGCG進(jìn)行檢測，得出HPLC的檢測條件如下：流動(dòng)相A甲醇，B 5×10-5mol/L KH2PO4溶液(pH=5)，A∶B=20∶80，柱溫30 ℃，流速為1.0 mL/min，檢測波長為210 nm，進(jìn)樣量為20μL，咖啡堿和EGCG 的進(jìn)樣量在25～400μg 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，r>0.999 0，咖啡堿和EGCG的平均加標(biāo)回收率及RSD分別為98.32%、97.18%、1.96%、1.73%，高效液相色譜法簡便準(zhǔn)確，分離效果好，重復(fù)性高，可作為茯磚茶中咖啡堿和EGCG含量同時(shí)測定的方法.通過測定咖啡堿和EGCG的含量，得出第一、二次汽蒸后接種及CK成品茶的咖啡堿和EGCG的含量分別為23.63 mg/g、20.08 mg/g、24.37 mg/g、6.43 mg/g、3.79 mg/g、8.31 mg/g，其中第二次汽蒸后接種茶磚的咖啡堿減少了43.37%，EGCG減少了87.98%，茶多酚減少了31.98%，其三種成分的減少量比CK、第一次汽蒸后接種更多，成分轉(zhuǎn)化最完全，茯磚茶中含有的人體易吸收的小分子物質(zhì)越多，茶磚質(zhì)量越好，因此第二次汽蒸后接種最適宜.

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【責(zé)任編輯：陳 佳】

Analysis of caffeine and EGCG in the Fu brick tea by HPLC

QIN Jun-zhe1, LIU Kai-li1, HUANG Ya-ya2, WANG Ya-li1, HU Xin2, DENG Yong-liang2, LIU Wen-jun2

(1.School of Food and Biological Engineering, Shaanxi University of Science & Technology, Xi′an 710021, China; 2.Shaanxi Cangshan Tea Industry Co., Ltd., Xianyang 710003, China)

Under the conditions of artificial inoculation,this paper researched the test conditions and content of caffeine and EGCG in the Fu brick tea through HPLC isocratic elution.The results showed that HPLC test conditions were as follows:mobile phase A is methanol,mobile phase B is 5×10-5mol/L KH2PO4solution (pH=5),A∶B=20∶80,the injection volume of caffeine and EGCG and peak area showed a good linear relationship in the range of 25～400μg,r>0.999 0,the average recoveries and RSD of caffeine and EGCG were 98.32%,97.18%,1.96% and 1.73% respectively,this method is of good separation effect and high repeatability,which can be used for simultaneous determination of the content of caffeine and EGCG in the Fu brick tea.On this basis,the content of caffeine in the first and the second steaming after inoculation and CK finished tea were 23.63 mg/g,20.08 mg/g and 24.37 mg/g respectively,and their EGCG content were 6.43 mg/g,3.79 mg/g and 8.31 mg/g respectively.After the second steaming inoculation was the most suitable.

Fu brick tea; HPLC; caffeine; EGCG

2016-12-20 基金項(xiàng)目：陜西省教育廳產(chǎn)業(yè)化培育計(jì)劃項(xiàng)目(14JF001)； 咸陽市國家農(nóng)業(yè)科技園區(qū)建設(shè)項(xiàng)目(2015K01-13)

秦俊哲(1957-)，男，陜西咸陽人,教授級(jí)高級(jí)工程師，研究方向：食品生物技術(shù)

1000-5811(2017)02-0110-04

TS272.5+4

A