蝙蝠葛葉總黃酮提取工藝優(yōu)化及體外抗氧化活性研究

孔 陽(yáng)， 馬養(yǎng)民， 彭 歡

(1.陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 陜西 西安 710021; 2.陜西科技大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院， 陜西 西安 710021)

蝙蝠葛葉總黃酮提取工藝優(yōu)化及體外抗氧化活性研究

孔 陽(yáng)1， 馬養(yǎng)民2， 彭 歡1

(1.陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 陜西 西安 710021; 2.陜西科技大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院， 陜西 西安 710021)

對(duì)超聲波輔助提取蝙蝠葛葉總黃酮的最佳工藝條件以及總黃酮的抗氧化活性進(jìn)行了研究.采用正交試驗(yàn)法篩選蝙蝠葛葉總黃酮最佳提取工藝.結(jié)果表明，最佳超聲波提取工藝是功率150 W，乙醇濃度60%，料液比1∶20，提取時(shí)間60 min.抗氧化活性結(jié)果顯示蝙蝠葛葉總黃酮具有較好的DPPH自由基清除能力.

蝙蝠葛; 黃酮; 正交試驗(yàn)法; 抗氧化活性

0 引言

蝙蝠葛(MenispermumdahuricumDC.)系防己科蝙蝠屬植物，又名蝙蝠藤、山豆秧、黃條香、野

豆根等，為多年生草本攀緣植物.在我國(guó)主要分布于東北、華北、華中、華東等地，陜西省北部及秦嶺北坡也有分布，多生于海拔1 500 m以下的田邊或石礫灘地，《本草綱目拾遺》稱其干燥根莖為“北豆根”[1,2].

研究表明，北豆根中含有蝙蝠葛堿、蝙蝠葛諾林堿、蝙蝠葛新諾林堿、蝙蝠葛可林堿、蝙蝠葛蘇林堿、N-去甲基蝙蝠葛堿、粉防己堿、青藤堿等三十多種生物堿及異槲皮素、黃芪苷等多種黃酮類化學(xué)成分[3,4].北豆根性味苦寒，有小毒，具有清熱解毒，消腫利咽，抗癌、祛風(fēng)止痛等功效.臨床廣泛用于治療癌癥、咽喉腫痛、風(fēng)濕痹痛、心腦血管疾病等病癥[5-13].北豆根藥用價(jià)值顯著，原料的需求量很大.然而，人們只取其根部作藥用卻廢棄莖葉部分，資源破壞嚴(yán)重.文獻(xiàn)表明，蝙蝠葛莖葉中也含有黃酮類、生物堿、萜類等多種有效成分[14,15]，但是有關(guān)蝙蝠葛葉中總黃酮提取工藝的研究還未見(jiàn)報(bào)道.超聲波作用于液體產(chǎn)生空化作用，能夠使生物細(xì)胞壁破壞，從而加強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)擴(kuò)散到溶劑中[16].因此本實(shí)驗(yàn)對(duì)超聲波輔助提取蝙蝠葛葉總黃酮的最佳提取工藝進(jìn)行研究，并對(duì)所得總黃酮的抗氧化活性進(jìn)行了考察.

1 材料與方法

1.1 材料

蝙蝠葛于2015年8月采自西安翠華山，經(jīng)楊文娟講師鑒定為蝙蝠葛(MenispermumdauricumDC.)，新鮮的蝙蝠葛葉片經(jīng)120 ℃殺青10 min后，在35 ℃烘干粉碎過(guò)20目篩備用.

1.2 儀器與試劑

(1)主要儀器：BILON-1000CT型多用途恒溫超聲波提取機(jī)(上海比朗儀器有限公司)，HF2000酶標(biāo)儀(北京華安麥科生物技術(shù)有限公司)，S200 baygene移液槍(北京百晶生物技術(shù)有限公司)，3590 costar 96孔酶標(biāo)板(美國(guó)Corning Costar公司)，HC-3618R型高速冷凍離心機(jī)(安徽中科儀器有限公司)，RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠).

(2)主要試劑：蘆丁對(duì)照品(中國(guó)國(guó)藥集團(tuán))，DPPH和維生素C(天津市博迪化工有限公司)，其余試劑均為分析純.

1.3 超聲波輔助提取總黃酮方法

1.3.1 超聲提取工藝流程

蝙蝠葛葉粉→加入溶劑→超聲波處理→離心→收集上清液→減壓蒸餾→粗黃酮浸膏.

1.3.2 供試品溶液制備

精密稱取陰干蝙蝠葛莖葉5 g，加入100 mL 60%乙醇，超聲波提取60 min后過(guò)濾得濾液，定量轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶?jī)?nèi)，用60%乙醇定容至刻度，搖勻，即得供試品溶液.

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密吸取對(duì)照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 、6.0 mL置于25 mL容量瓶中，各加5% NaNO2溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加1% (ρ) AlCl3溶液3 mL，搖勻，放置6 min，加4% (ρ) NaOH溶液10 mL，搖勻，放置15 min，加水至刻度，第一個(gè)樣品為空白對(duì)照，在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以蘆丁對(duì)照品的質(zhì)量濃度(ρ)為橫坐標(biāo)，吸收度(A)為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行線性回歸.

1.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液適量，按標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下操作顯色，10 min后測(cè)定其吸光度，以不同的時(shí)間間隔測(cè)定樣品的吸光度，觀察其穩(wěn)定性[17].

1.3.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取供試品溶液0.5 mL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下操作顯色，測(cè)定吸光度5次，計(jì)算總黃酮得率，結(jié)果為2.54%，2.53%，2.54%，2.53%，2.54%，蝙蝠葛莖葉中總黃酮的平均得率為2.54%，RSD=0.19%.

1.3.6 樣品總黃酮含量的測(cè)定

總黃酮含量以蘆丁為對(duì)照品，采用NaNO2-Al(NO3)3比色法測(cè)定[17-19],按照公式(1)計(jì)算總黃酮含量：

x=y×V×F/M

(1)

式(1)中：x—樣品中總黃酮含量(mg/g);y—由回歸方程算得的樣液濃度(mg/mL);V—定容體積(mL);F—稀釋倍數(shù)；M—樣品量(g).

1.3.7 單因素考察

分別研究乙醇濃度、超聲功率、提取時(shí)間、提取溫度、料液比5個(gè)因素對(duì)蝙蝠葛總黃酮得率的影響.考察因素的選取范圍，超聲功率100～200 W，乙醇濃度0%～80%(V)，提取時(shí)間40～80 min，提取溫度40 ℃～100 ℃，料液比1∶8～1∶24.

1.3.8 正交試驗(yàn)優(yōu)選提取工藝

通過(guò)單因素考察，確定正交試驗(yàn)中提取溫度設(shè)定在80 ℃,以保證得率并避免溫度過(guò)高導(dǎo)致蝙蝠葛葉中部分黃酮類化合物在高溫下分解.在單因素考察結(jié)果的基礎(chǔ)上，確定乙醇濃度、超聲波功率、提取時(shí)間、料液比四個(gè)因素作為得率的影響因子，設(shè)計(jì)L9(34)4因素3水平正交試驗(yàn)，篩選最佳提取工藝，如表1所示.

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

1.4 抗氧化活性試驗(yàn)方法

以Vc作為參照，對(duì)蝙蝠葛葉總黃酮進(jìn)行抗氧化性測(cè)試[20]，抗氧化性能強(qiáng)弱根據(jù)樣品對(duì)DPPH自由基清除率來(lái)判斷，清除率可由公式(2)進(jìn)行計(jì)算：

(2)

式(2)中：E—自由基清除率，A0—DPPH和甲醇混合溶液吸光度，A1—第二排1-11孔所對(duì)應(yīng)的吸光度，A2—第一排1-11孔所對(duì)應(yīng)的吸光度.

按照公式(2)計(jì)算出不同樣品濃度下的自由基清除率，以濃度為橫坐標(biāo)，清除率為縱坐標(biāo)，繪制清除率變化曲線，對(duì)其增長(zhǎng)部分進(jìn)行線性擬合，按照擬合方程計(jì)算出樣品對(duì)DPPH自由基率的IC50值，Vc按照同樣方法進(jìn)行檢測(cè).

2 結(jié)果與討論

2.1 超聲波輔助提取工藝優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，以蘆丁對(duì)照品的質(zhì)量濃度(ρ)為橫坐標(biāo)，吸收度A為縱坐標(biāo)得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖1所示)，并進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程：

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為：

y=12.054x+0.000 5R2=0.999 8

y—對(duì)照品溶液吸光度，x—對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度，蝙蝠葛葉總黃酮濃度為0.01～0.07 mg/ml時(shí)呈良好的線性關(guān)系.

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，對(duì)照品蘆丁與供試品在30 min之內(nèi)穩(wěn)定性良好，但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，供試品的吸光值均逐漸減小， 40 min后，供試品吸光值顯著降低，說(shuō)明供試品較對(duì)照品更不穩(wěn)定，因此吸光值的測(cè)定應(yīng)在30 min以內(nèi)完成.

圖2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.3 單因素考察結(jié)果

(1)超聲波功率對(duì)得率的影響

超聲波功率對(duì)蝙蝠葛葉總黃酮得率的影響如圖3所示，蝙蝠葛葉中總黃酮的得率隨超聲波功率的增大而明顯增大，在200 W處達(dá)到了最大值.

圖3 超聲波功率對(duì)得率的影響

(2)乙醇濃度對(duì)得率的影響

乙醇濃度對(duì)蝙蝠葛葉總黃酮得率的影響如圖4所示.總黃酮的得率隨乙醇濃度的升高明顯增加，在乙醇濃度60%處得率達(dá)到最大，之后逐漸降低.

圖4 乙醇濃度對(duì)得率的影響

(3)料液比對(duì)得率的影響

料液比對(duì)得率的影響結(jié)果如圖5所示.蝙蝠葛葉中總黃酮的得率隨料液比的增加而逐漸增加，當(dāng)料液比達(dá)到1∶20后，得率變化不大，同時(shí)考慮到料液比過(guò)高會(huì)增加后期藥液濃縮的難度，因此在正交試驗(yàn)中設(shè)定三個(gè)水平為1∶10、1∶15、1∶20.

圖5 料液比對(duì)得率的影響

(4)提取時(shí)間對(duì)得率的影響

提取時(shí)間對(duì)得率的影響如圖6所示.蝙蝠葛葉中總黃酮的得率隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，80 min時(shí)得率最大，之后隨著時(shí)間的增加得率有所下降.

圖6 提取時(shí)間對(duì)得率的影響

(5)提取溫度對(duì)得率的影響

提取溫度對(duì)得率的影響如圖7所示.隨著提取溫度的升高，蝙蝠葛莖葉中總黃酮的得率隨之上升且增加幅度較大，80 ℃時(shí)得率最高，溫度繼續(xù)升高時(shí)得率有所下降，分析其原因可能是由于溫度過(guò)高會(huì)影響總黃酮的穩(wěn)定性，因此在正交試驗(yàn)考察中選用80 ℃為提取溫度，以避免溫度過(guò)高導(dǎo)致部分黃酮類化合物分解.

圖7 溫度對(duì)得率的影響

2.1.4 正交試驗(yàn)法優(yōu)選提取工藝

精密稱取蝙蝠葛莖葉5 g，按表1 L9(34)正交試驗(yàn)因素水平表對(duì)蝙蝠葛莖葉進(jìn)行超聲波提取工藝優(yōu)化，結(jié)果如表2所示.

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

從極差分析表明，最佳的提取工藝為A3B2C3D3，所考察的因素影響程度為：乙醇濃度>超聲波功率>提取時(shí)間>料液比.對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，在條件A3B2C3D3下提取3次，總黃酮的得率分別是：3.70%、3.69%、3.67% ，平均得率為3.69%與正交試驗(yàn)結(jié)果相符.

方差分析結(jié)果如表3所示，超聲波功率和乙醇濃度對(duì)黃酮得率影響顯著(顯著性水平α=0.05)，而料液比和提取時(shí)間的影響不顯著.綜合比較得最佳工藝為超聲波功率250 W，乙醇濃度60%，料液比1∶20，提取時(shí)間80 min.

表3 正交試驗(yàn)及結(jié)果

2.2 蝙蝠葛葉總黃酮體外抗氧化活性測(cè)試結(jié)果

將提取得到的蝙蝠葛葉總黃酮進(jìn)行體外抗氧化活性試驗(yàn)，以Vc作對(duì)照，結(jié)果如表4所示.從表4可以看出，蝙蝠葛葉總黃酮對(duì)DPPH的自由基清除率IC50值(μg/mL)與維生素C相當(dāng)，具有較好抗氧化活性.

表4 DPPH自由基清除率測(cè)試結(jié)果

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明蝙蝠葛莖葉含有較為豐富的黃酮類化合物，具有較好的體外抗氧化活性，是良好的天然抗氧化劑.同時(shí)本文優(yōu)選出了最佳的超聲波提取工藝，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用蝙蝠葛資源提供了參考依據(jù).

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【責(zé)任編輯：陳 佳】

Study on optimum extraction and antioxidative activity of total flavonoids from the Leaf ofMenispermumdahuricumDC.

KONG Yang1， MA Yang-min2， PENG Huan1

(1.School of Food and Biological Engineering, Shaanxi University of Science & Technology, Xi′an 710021, China; 2.College of Chemistry and Chemical Engineering, Shaanxi University of Science & Technology, Xi′an 710021, China)

The paper is about the ultrasonic assisted extraction optimum process conditions and antioxidative activity of total flavonoids from Leaves ofMenispermumdahuricumDC.Orthogonal test method was used to select the optimum extraction technology.The results show the optimal process is power 150 W,ethanol concentration 60%,solid-liquid ratio 1∶20,extraction time 60 min.Antioxidant activity results show that the total flavonoids has good DPPH radical scavenging capacity.

MenispermumdahuricumDC.; flavonoids; orthogonality; antioxidative activity

2016-12-15 基金項(xiàng)目：陜西省教育廳自然科學(xué)專項(xiàng)科研計(jì)劃項(xiàng)目(2013JK0726)

孔 陽(yáng)(1980-)，女，山東曲阜人，講師，在讀博士研究生，研究方向：天然產(chǎn)物化學(xué)

1000-5811(2017)02-0121-05

R284.2

A