四甲基脲酸對鎘損傷小鼠肝臟的保護(hù)作用

龔 頻， 皮思慧， 楊文娟， 王 蘭， 陳福欣

(1.陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 陜西 西安 710021； 2.西安科技大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院， 陜西 西安 710054)

四甲基脲酸對鎘損傷小鼠肝臟的保護(hù)作用

龔 頻1， 皮思慧1， 楊文娟1， 王 蘭1， 陳福欣2*

(1.陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 陜西 西安 710021； 2.西安科技大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院， 陜西 西安 710054)

從元素鎘、鋅、鐵、銅的變化水平研究四甲基脲酸對鎘損傷小鼠肝臟的保護(hù)作用，采用小鼠腹腔注射CdCl2，連續(xù)處理14 d，測定肝臟元素鎘、鋅、鐵、銅的含量.結(jié)果表明，鎘在肝臟中蓄積呈極顯著增加(###P<0.001)，同時影響鋅含量顯著減少(#P<0.05)，鐵含量增加，銅含量無顯著差異變化.四甲基脲酸可能通過清除過量自由基，降低了氧化損傷的程度，使元素含量呈現(xiàn)出劑量依賴，抑制鎘和鐵的增加，鋅和銅含量減少.

四甲基脲酸； 鎘； 微量元素； 氧化損傷

0 引言

重金屬鎘被廣泛的應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，極易通過食物鏈在人及動物體內(nèi)蓄積，具有致癌、致畸和致突變作用.之前的研究表明鎘的毒性作用能夠誘導(dǎo)肝臟損傷[1]，尋找一種有效的防治鎘的肝毒性藥物迫在眉睫.四甲基尿酸(theacrine，TC)是一類具有嘌呤環(huán)的天然生物堿類物質(zhì)，主要存在于普洱茶變種的苦茶嫩葉中[2].研究表明，四甲基脲酸具有抗抑郁、鎮(zhèn)靜催眠和抗炎鎮(zhèn)痛的藥理作用[3-5]，在化學(xué)、食品和醫(yī)藥方面引起了極大的反響.前期結(jié)果表明，四甲基脲酸對鎘誘導(dǎo)的肝臟損傷具有一定保護(hù)作用，但保護(hù)機(jī)制尚未明確.本研究擬通過構(gòu)建鎘誘導(dǎo)小鼠肝臟損傷模型，結(jié)合元素鎘、鋅、鐵、銅和谷胱甘肽、脂質(zhì)過氧化的含量變化，從新角度探究四甲基脲酸對鎘損傷小鼠肝臟保護(hù)作用的潛在機(jī)制，為苦茶產(chǎn)品的開發(fā)和深加工提供數(shù)據(jù)支持和理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實驗材料

氯化鎘(CdCl2)購自天津市福晨化學(xué)試劑廠；生理鹽水購自西安雙鶴制藥有限公司；濃硝酸購自天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠；濃鹽酸購自北京化工廠；5，5-二硫代-2-硝基苯甲酸(DTNB)購自Alfa Aesar公司，三氯乙酸、硫代巴比妥酸均購自上海山浦化工有限公司;其它試劑均為分析純.

1.2 實驗動物與模型構(gòu)建

雄性昆明小鼠35只，購買自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，體重20±2 g.隨機(jī)將小鼠分成5組，每組7只，給藥方式按表1所示，CdCl2溶液濃度為2 mg/(kg·d)，胃飼不同濃度四甲基脲酸溶液.每天給藥1次，持續(xù)給藥14 d，四甲基脲酸濃度分別為10 mg/(kg·d)、20 mg/(kg·d)、30 mg/(kg·d)，末次注射后禁食24 h，斷頸處死解剖，取肝臟樣品，保存于-70 ℃的冰箱中待用.

表1 構(gòu)建鎘損傷小鼠模型給藥方式

注：CdCl2溶液濃度為2 mg/(kg·d).

1.3 小鼠臟器系數(shù)測定

小鼠處死前后，分別稱量體重和肝臟的重量，按文獻(xiàn)[6]中公式，計算肝臟臟器系數(shù).

1.4 元素含量檢測

使用干灰化法[7]進(jìn)行樣品前處理.準(zhǔn)確稱取待測肝臟組織，定性濾紙充分吸干水分，置于瓷坩堝中.馬弗爐中500 ℃灰化6～8 h，過夜冷卻，稀混酸充分溶解灰分.使用偏振塞曼原子吸收光度計，采用火焰法[8]測定鎘、鋅、鐵、銅的標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時檢測樣品中的鎘、鋅、鐵、銅元素的含量(μg/g tissue).

1.5 酶學(xué)指標(biāo)測定及方法

準(zhǔn)確稱量肝臟樣品，制備成10%組織勻漿，采用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白含量，5，5-二硫代-2-硝基苯甲酸(DTNB)法測定還原型谷胱甘肽(GSH)[9]，硫代巴比妥酸法測定脂質(zhì)過氧化指標(biāo)丙二醛(MDA)含量[10].

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)方法

所有的實驗數(shù)據(jù)都表示為“mean ± SE”.平均值用單向方差分析法(one-way analysis of variance,ANOVA)和相應(yīng)的t-檢驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析.統(tǒng)計學(xué)上P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義.

2 結(jié)果與討論

2.1 鎘損傷和四甲基脲酸保護(hù)對小鼠體重的影響

如圖1所示，2 mg/(kg·d) CdCl2損傷14 d，使Cd組小鼠體重明顯低于空白組(##P<0.01)，當(dāng)四甲基脲酸劑量為10 mg/(kg·d)、20 mg/(kg·d)、30 mg/(kg·d)時，給藥第四天體重增長持續(xù)上升；鎘損傷組從第六天開始呈下降趨勢；而低、中劑量保護(hù)組第六天也呈下降趨勢，第十二天下降趨勢得到控制；這可能是保護(hù)藥的濃度過低，并不能有效的抑制體內(nèi)由鎘競爭抑制金屬元素帶來的改變及氧化應(yīng)激的作用[11].高劑量四甲基脲酸組明顯抑制了下降趨勢，并在保護(hù)藥給予十天后呈現(xiàn)顯著增加趨勢(*P<0.05)，而低、中劑量四甲基脲酸組沒有顯著性差異.

2.2 鎘損傷和四甲基脲酸保護(hù)對小鼠肝臟相對系數(shù)的影響

如圖2所示，與空白組相比，鎘損傷組臟器系數(shù)呈顯著增加(##P<0.01).當(dāng)四甲基脲酸的濃度為30 mg/(kg·d)時，能夠抑制增加(*P<0.05).這是由于肝是機(jī)體中重要的解毒器官，任何藥物或毒物進(jìn)入體內(nèi)后都要在其中進(jìn)行代謝，肝臟臟器系數(shù)的升高可能是器官損傷的一種代謝補償效應(yīng)[12].

(n=7；與Control組相比，##P<0.01；與Cd-treatment組相比，*P<0.05)圖1 鎘損傷和四甲基脲酸保護(hù)對小鼠體重的影響

(n=7；與Control組相比，##P<0.01；與Cd-treatment組相比，*P<0.05)圖2 鎘損傷和四甲基脲酸保護(hù)對小鼠肝臟相對系數(shù)的影響

2.3 鎘損傷和四甲基脲酸保護(hù)對小鼠肝臟中Cd、Zn、Fe、Cu的影響

CdCl2損傷14天，肝臟中元素含量的變化如圖3所示.損傷組與空白組比較，鎘的蓄積呈極顯著(###P<0.001)增加，保護(hù)組與損傷組比較，鎘含量有下降趨勢，沒有統(tǒng)計學(xué)意義；損傷組與空白組比較，鋅含量減少，具有統(tǒng)計學(xué)意義(#P<0.05)，TC濃度為30 mg/(kg·d)時顯著抑制其減少(*P<0.05)；損傷組與空白組比較，鐵含量增加，沒有統(tǒng)計學(xué)意義；TC濃度為10 mg/(kg·d)時，鐵含量增加具有統(tǒng)計學(xué)意義(*P<0.05)，TC濃度為20、30 mg/(kg·d)，鐵含量減少.銅含量在不同組別間沒有顯著性變化.

(n=7；與Control組相比，###P<0.001，#P<0.05；與Cd-treatment組相比，*P<0.05)圖3 鎘損傷和四甲基脲酸保護(hù)對小鼠肝臟中Cd、Zn、Fe、Cu的影響

體內(nèi)的微量元素之間既有拮抗又有協(xié)同作用的存在，重金屬鎘的攝入對它們的影響是極其復(fù)雜的相互關(guān)系.鎘在肝臟內(nèi)的大量蓄積，使得鎘置換出線粒體關(guān)鍵酶中的鐵元素，從而干擾線粒體的正常功能，同時鐵離子的游離，誘導(dǎo)體內(nèi)發(fā)生Fenton反應(yīng)，產(chǎn)生過量的氧自由基，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的發(fā)生.鎘通過活化黃嘌呤氧化酶、血紅素氧化酶使機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生過量的超氧化自由基，消耗大量的鋅離子參與抗氧化酶的合成，以減少機(jī)體的氧化損傷[13].

2.4 鎘損傷和四甲基脲酸保護(hù)對小鼠肝臟中GSH和MDA的影響

谷胱甘肽作為機(jī)體內(nèi)重要活性物質(zhì)，具有清除自由基、促進(jìn)鐵質(zhì)吸收等功能.脂質(zhì)過氧化物是機(jī)體的氧化應(yīng)激標(biāo)志，其含量增加會影響細(xì)胞生長，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性.如圖4所示，鎘損傷組與空白組相比，谷胱甘肽呈顯著下降(##P<0.01)，脂質(zhì)過氧化物呈增加趨勢(#P<0.05)，有統(tǒng)計學(xué)意義；四甲基脲酸劑量為30 mg/(kg·d)時，抑制脂質(zhì)過氧化物的增加趨勢(*P<0.05)，谷胱甘肽在不同劑量保護(hù)下，沒有顯著性變化.

(a)谷胱甘肽

(b)脂質(zhì)過氧化(n=7；與Control組相比，##P<0.01,#P<0.05；與Cd-treatment組相比，*P<0.05)圖4 鎘損傷和四甲基脲酸保護(hù)對小鼠肝臟中GSH和MDA的影響

3 結(jié)論

本實驗通過構(gòu)建鎘損傷小鼠肝臟模型，從元素含量變化研究四甲基脲酸的保護(hù)作用.實驗結(jié)果表明,肝臟內(nèi)鎘的累積增加了鐵離子的含量，減少了鋅、銅含量.四甲基脲酸通過清除過量產(chǎn)生的自由基，降低了氧化損傷的程度.為進(jìn)一步闡明鎘對肝臟毒性機(jī)制提供了新的思路，也為進(jìn)一步開發(fā)苦茶中四甲基脲酸提供了數(shù)據(jù)支持.

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【責(zé)任編輯：蔣亞儒】

Protective effects of theacrine against cadmium-induced hepatotoxicity in mice

GONG Pin1, PI Si-hui1, YANG Wen-juan1, WANG Lan1, CHEN Fu-xin2*

(1.School of Food and Biological Engineering, Shaanxi University of Science & Technology, Xi′an 710021, China； 2.School of Chemistry and Chemical Engineering, Xi′an University of Science and Technology, Xi′an 710054, China)

The elementals analysis on the level of cadmium,zinc,iron and copper in mice liver exposed to cadmium chloride (Cd(Ⅱ)) and the protective effect of theacrine against Cd(Ⅱ)-induced hepatic injury were investigated.After injected with CdCl2(ip) for 14 days,the oxidative damage of liver was evaluated through measurement of cadmium,zinc,iron,copper contents.The results showed that cadmium accumulated in the liver was significantly increased (###P<0.001),while the zinc content significantly reduced (#P<0.05),the iron content increased,the copper content shows no significant difference.Theacrine may clear the way by an excess of free radicals,reducing the degree of oxidative damage,so that the element content showed a dose-dependent inhibition of cadmium and iron increased tendency and reduce the downward trend in zinc and copper.

theacrine; cadmium; trace elements; oxidative damage

2016-12-17 基金項目：國家自然科學(xué)基金項目(21407104,81402815)

龔 頻(1983-)，女，湖南邵陽人，副教授，博士，研究方向：藥理生理

陳福欣(1981-)，男，河北吳橋人，副教授，博士，研究方向：天然產(chǎn)物化學(xué)，chenfuxin@xust.edu.cn

1000-5811(2017)02-0131-04

R99

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