水產(chǎn)品中孔雀石綠和隱形孔雀石綠殘留量的提取方法優(yōu)化

范芳芳，李 曉，吳 坤，李 婧，石旭東

（陜西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，陜西西安 710048）

水產(chǎn)品中孔雀石綠和隱形孔雀石綠殘留量的提取方法優(yōu)化

范芳芳，*李 曉，吳 坤，李 婧，石旭東

（陜西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，陜西西安 710048）

在GB/T 19857—2005基礎(chǔ)上，建立一種水產(chǎn)品中殘留的孔雀石綠和隱形孔雀石綠的提取及富集的優(yōu)化方法，并用高效液相色譜-紫外檢測(cè)器的方法對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行檢測(cè)?？疾炝搜趸X、鹽酸羥胺溶液和對(duì)-甲苯磺酸鈉溶液、氯化鈉、乙酸胺溶液及富集凈化的方法等因素對(duì)水產(chǎn)品中孔雀石綠和隱形孔雀石綠的回收率影響。結(jié)果表明，5 g左右樣品在用乙腈提取時(shí)，需加入2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的鹽酸羥胺溶液，1 mL濃度為1.0 mol/L的對(duì)-甲苯磺酸鈉溶液，2 mL濃度為0.1 mol/L的乙酸胺溶液（用冰乙酸調(diào)節(jié)pH值至4.5），8 g酸性氧化鋁，2 g氯化鈉；采用此法目標(biāo)物的回收率最高，其中孔雀石綠可達(dá)95.6%，隱形孔雀石綠可達(dá)101.2%。該法具有操作簡(jiǎn)單、回收率高、快速大批量處理等優(yōu)點(diǎn)。

水產(chǎn)品；孔雀石綠；隱形孔雀石綠；高效液相色譜-紫外檢測(cè)器法；回收率

0 引言

孔雀石綠（Malachite green，MG）又名孔雀綠、堿基綠，是一種具有金屬光澤的結(jié)晶體，通常以氯化物或者草酸鹽的形式存在，極易溶于水，水溶液呈藍(lán)綠色[1]。在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中，MG主要作為殺菌劑、驅(qū)蟲劑、防腐劑來預(yù)防和治療各類水產(chǎn)動(dòng)物的水霉病、鍶霉病及小瓜蟲病等[2]。

近年來，研究發(fā)現(xiàn)MG具有毒性化學(xué)官能團(tuán)三苯甲烷，對(duì)哺乳動(dòng)物和人類具有致畸、致癌、致突變等作用，同時(shí)含有MG的廢水排放會(huì)污染環(huán)境[3]。MG在魚類等生物體內(nèi)可迅速轉(zhuǎn)化為隱形孔雀石綠（Leucomalachite green，LMG），該代謝產(chǎn)物毒性更大[4]。鑒于MG的危害性，美國(guó)、日本、英國(guó)等許多國(guó)家已禁止將其用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)，我國(guó)也于2002年5月將MG列入《食品動(dòng)物禁用的獸藥及其化合物清單》中，禁止用于所有食品動(dòng)物[5-6]。

因此，加強(qiáng)對(duì)水產(chǎn)品中孔雀石綠及其代謝物的監(jiān)測(cè)，對(duì)于打擊違法犯罪、保障食品安全顯得格外重要。

目前，對(duì)MG和LMG的檢測(cè)主要采用液相色譜法[7]、分光光度法[8]、液相色譜質(zhì)譜法[9]、液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)法[10]、毛細(xì)管電泳法[11]及酶聯(lián)免疫法等[12]。樣品的前處理是分析化學(xué)的瓶頸問題，也是檢測(cè)誤差的主要來源之一。乙腈對(duì)細(xì)胞組織具有良好的滲透性，能夠去除蛋白釋放的MG和LMG，因此試驗(yàn)的前處理采用乙腈作為基本的提取液[13]。關(guān)于這方面的研究也有很多，如Zhang Y等人[14]采用乙腈-醋酸胺混合液體系，而Ascari J等人[15]采用檸檬酸-乙腈混合體系來對(duì)MG和LMG進(jìn)行提取純化。試驗(yàn)在乙腈-乙酸胺溶液作為提取液的基礎(chǔ)上，首次將無機(jī)鹽氯化鈉加入，然后乙腈和水形成的雙水相[16]與旋蒸結(jié)合的富集純化方法用于LG和LMG的富集純化，其結(jié)果采用高效液相-紫外檢測(cè)器（HPLC-UV）的方法進(jìn)行檢測(cè)。該法具有步驟簡(jiǎn)化、操作簡(jiǎn)單、回收率高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

孔雀石綠（草酸鹽）標(biāo)準(zhǔn)品和隱形孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自德國(guó)Dr.Ehrenstorfer Gmb H公司，其純度分別為95%和98%，生產(chǎn)批號(hào)分別為20201和30103。

乙腈購(gòu)自德國(guó)默克公司，色譜純；試驗(yàn)用水為超純水；所用試劑除指定外，均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

2998 TDQ型高效液相色譜儀，美國(guó)Waters公司產(chǎn)品，配有二聯(lián)泵、柱溫箱、UV2487檢測(cè)器、Waters色譜工作站；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海之信儀器有限公司產(chǎn)品；TG16-NS型離心機(jī)，湘儀離心機(jī)公司產(chǎn)品；KQ-250DE型超聲儀，昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；JA1003N型天枰，上海佑科公司產(chǎn)品。

1.3 主要溶液的配備

孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：100 μg/mL，準(zhǔn)確稱取0.01 g孔雀石綠（草酸鹽）標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL容量瓶中，用乙腈定容。

隱形孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：100 μg/mL，準(zhǔn)確稱取0.01 g隱形孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL容量瓶中，用乙腈定容。

稱取5.0 g左右不含MG和LMG的水產(chǎn)品粉碎樣于50 mL容量瓶中，量取一定量乙腈進(jìn)行混勻，經(jīng)超聲、離心后取上清液得到基質(zhì)溶液。

各取0.5 mL MG和LMG的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于10 mL容量瓶中，用基質(zhì)溶液定容至刻度線，配置成5 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

配制0.1 mol/L的乙酸胺溶液，并用冰乙酸調(diào)節(jié)pH值至4.5。

配制濃度為1.0 mol/L的對(duì)-甲苯磺酸鈉溶液和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的鹽酸羥胺。

1.4 色譜條件

色譜柱：Waters C18-ODS柱（5 μm，4.6 mm× 250mm），柱后接25%的二氧化鉛氧化柱；柱溫：25℃；流速：1.0 mL/min；流動(dòng)相：乙腈與0.1 mol/L的乙酸銨緩沖溶液（pH值4.5）體積之比為80∶20。

1.5 計(jì)算公式

目標(biāo)物的回收率用E來表示，計(jì)算公式為：

式中：X2——加標(biāo)樣品中目標(biāo)物的濃度，μm/mL；

X1——樣品中目標(biāo)物濃度，μm/mL；

X——加入的標(biāo)準(zhǔn)品濃度，μm/mL。

此計(jì)算公式適用于樣品和加標(biāo)樣品質(zhì)量相同的情況下。

1.6 試驗(yàn)方法

稱取5.00 g水產(chǎn)樣品于50 mL離心管中，加入15 mL乙腈，混勻，超聲時(shí)間5 min。首先考察乙酸胺溶液對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響；進(jìn)一步研究氧化鋁的屬性對(duì)目標(biāo)回收率的影響，并確定其最佳含量，以及與填充氧化鋁柱子的萃取效果進(jìn)行了比對(duì)；在此基礎(chǔ)上，繼續(xù)考察不同量的鹽酸羥胺和對(duì)-甲苯磺酸鈉溶液對(duì)結(jié)果的影響；在確定了提取方法后，試驗(yàn)對(duì)不同富集純化方法進(jìn)行比對(duì)；確定完上述參數(shù)后，繼續(xù)研究氯化鈉添加量對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響，從而得到最佳試驗(yàn)方法。

1.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

試驗(yàn)比較了Agilent的C18柱（5 μm，4.6 mm× 250 mm）與Waters-ODS的C18柱（5 μm，4.6 mm× 250 mm）分離情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，后者對(duì)目標(biāo)物的分離效果好、基線平穩(wěn)、雜峰干擾少。于波長(zhǎng)588 mm與618 mm處，孔雀石綠和隱形孔雀石綠在5.053 min和17.149 min時(shí)響應(yīng)值最大。

5 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)色譜見圖1。

圖1 5 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)色譜

1.8 工藝優(yōu)化試驗(yàn)說明

試驗(yàn)在GB/T 19857—2005[17]和目前報(bào)道的相關(guān)文獻(xiàn)[18-19]的方法基礎(chǔ)上，對(duì)鹽酸羥胺和對(duì)-甲苯磺酸鈉溶液的添加量、氧化鋁的屬性和添加量、乙酸胺溶液、氯化鈉的添加量和富集凈化方法等因素進(jìn)行研究，首次將雙水相技術(shù)[16]——無機(jī)鹽氯化鈉加入后乙腈和水形成的雙水相與旋蒸結(jié)合的方法用于LG和LMG的富集純化，其結(jié)果采用高效液相色譜-紫外檢測(cè)器（HPLC-UV）的方法進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 氧化鋁對(duì)目標(biāo)物回收率的影響

2.1.1 氧化鋁的屬性對(duì)目標(biāo)物的影響

氧化鋁對(duì)目標(biāo)物回收率的影響見表1。

表1 氧化鋁對(duì)目標(biāo)物回收率的影響/%

由表1可知，酸性氧化鋁能夠使目標(biāo)物的回收率大大提高，這是由于堿性氧化鋁與目標(biāo)物發(fā)生次級(jí)反應(yīng)，而酸性氧化鋁通過離子交換，可達(dá)到對(duì)MG和LMG的提純凈化作用[20-21]。

2.1.2 酸性氧化鋁添加量對(duì)目標(biāo)物回收率的影響

試驗(yàn)在2.1.1所述試驗(yàn)方法的基礎(chǔ)上，繼續(xù)考查分別添加2，4，6，8，10 g酸性氧化鋁，對(duì)目標(biāo)物回收率的影響。

酸性氧化鋁添加量對(duì)回收率的影響見圖2。

圖2 酸性氧化鋁添加量對(duì)回收率的影響

由圖2可知，隨著酸性氧化鋁添加量的升高，目標(biāo)物的回收率越來越高，當(dāng)酸性氧化鋁添加量為8 g時(shí)，目標(biāo)物的回收率升至最高，分別為81.77%和85.09%；隨著酸性氧化鋁添加量繼續(xù)增大，目標(biāo)物的回收率降低。這是由于過量的酸性氧化鋁中攜帶的過量陰離子會(huì)抑制MG和LMG向乙腈層的轉(zhuǎn)移。

2.1.3 與過酸性氧化鋁萃取的結(jié)果對(duì)比

試驗(yàn)將酸性氧化鋁直接加入溶液中與濾液過酸性氧化鋁萃取小柱2種方法的結(jié)果進(jìn)行了比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)酸性氧化鋁過萃取小柱MG和LMG的回收率分別為73.24%和78.99%，低于81.77%和85.09%。這是由于自制的氧化鋁小柱緊密性不夠，導(dǎo)致洗脫效果不好。

2.2 鹽酸羥胺和對(duì)-甲苯磺酸鈉對(duì)目標(biāo)物回收率的影響

由于MG和LMG容易見光見熱分解[22]，因此要加入還原劑鹽酸羥胺溶液，防止目標(biāo)物從提取液中分解出來；而且MG和LMG以離子形式存在于溶劑中，離子對(duì)試劑對(duì)-甲苯磺酸鈉的加入是為了與目標(biāo)物形成離子對(duì)，增加MG和LMG的穩(wěn)定性，從而提高目標(biāo)物的回收率[23]。同樣，在2.1所確定的試驗(yàn)參數(shù)基礎(chǔ)上，考查鹽酸羥胺和對(duì)-甲苯磺酸鈉溶液對(duì)目標(biāo)物回收率的影響。主要進(jìn)行如下 3個(gè)試驗(yàn)。

（1）不加鹽酸羥胺和對(duì)-甲苯磺酸鈉；

（2）加入1.5 mL 20%的鹽酸羥胺溶液和2.5 mL 1.0 mol/L的對(duì)-甲苯磺酸鈉溶液；

（3） 加入2 mL 20%的鹽酸羥胺溶液和1 mL 1.0 mol/L的對(duì)-甲苯磺酸鈉溶液。

鹽酸羥胺和對(duì)-甲苯磺酸鈉溶液添加量對(duì)回收率的影響見表2。

表2 鹽酸羥胺和對(duì)-甲苯磺酸鈉溶液添加量對(duì)回收率的影響/%

由表2可知，添加2 mL 20%的鹽酸羥胺溶液和1 mL 1.0 mol/L的對(duì)-甲苯磺酸鈉溶液是最佳試驗(yàn)條件。

2.3 富集凈化方法對(duì)目標(biāo)回收率的影響

通常，前處理中將目標(biāo)物富集純化的方法有旋蒸[24]、萃取上清液[18]和冷凍[25]等方法。試驗(yàn)步驟如下：

在2.2所確定的試驗(yàn)參數(shù)基礎(chǔ)上，分別用以下3種方法對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行富集和純化。

（1）將反復(fù)提取得到的上清液，在45℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，加入2 mL乙腈溶解殘?jiān)? min，靜置，取上清液，并用乙腈定容至刻度，過0.45 μm濾膜，濾液供液相色譜測(cè)定。

（2）取2.5 mL的上清液，加入1.2 mL吸水試劑水硫酸鈉，離心后取上清液，過0.45 μm濾膜，濾液供液相色譜測(cè)定。

（3）將反復(fù)提取得到的上清液在冰箱（-18℃）貯藏12 h，取未凍結(jié)的上清液，并用乙腈定容至一定刻度后過0.45 μm濾膜，濾液供液相色譜測(cè)定。

不同富集凈化方法對(duì)目標(biāo)物回收率的影響見表3。

由表3可知，方法1和方法2對(duì)目標(biāo)物均有較好的回收效果，甚至方法2的回收率更高，這是由于方法2較方法1減少了旋蒸，從而減少了目標(biāo)物的損失。同時(shí)還可以看出，方法2中LMG的回收率超過100%，這是由于一部分MG轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)MG[23]，其原因有待進(jìn)一步考證?？紤]到方法2將原有樣品中目標(biāo)物的濃度稀釋倍數(shù)太高，在實(shí)際測(cè)試中達(dá)不到痕量測(cè)試的要求，故優(yōu)先選擇方法1。

2.4 氯化鈉對(duì)目標(biāo)物回收率的影響

2.4.1 氯化鈉屬性對(duì)目標(biāo)物回收率的影響

試驗(yàn)考查氯化鈉添加量為0.1 g時(shí)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響。結(jié)果表明，MG回收率分別為88.63%和90.43%，LMG為85.77%和91.65%。這是由于氯化鈉的加入使乙腈和水形成了雙水相，水與乙腈臨界層存在一種張力[27]，促使分子或者離子的MG和LMG更多地移向乙腈層。

2.4.2 氯化鈉添加量對(duì)目標(biāo)物回收率的影響

在2.3所述試驗(yàn)方法1的基礎(chǔ)上，考查在提取過程氯化鈉分別為0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8，2.0，2.2，2.4 g時(shí)MG和LMG回收率的影響。

氯化鈉添加量對(duì)目標(biāo)物回收率的影響見圖3。

表3 不同富集凈化方法對(duì)目標(biāo)物回收率的影響/%

圖3 氯化鈉添加量對(duì)目標(biāo)物回收率的影響

由圖3可知，隨著氯化鈉添加量的增加，目標(biāo)物的回收率越高，當(dāng)氯化鈉添加量為2 g時(shí)，目標(biāo)物的回收率達(dá)到最高，MG和LMG分別為95.60%和101.2%；隨著氯化鈉添加量繼續(xù)升高，目標(biāo)物的回收率趨于平緩，甚至下降。這是由于乙腈經(jīng)旋蒸出去后，雞心瓶中剩下含有目標(biāo)物的氯化鈉溶液。向蒸發(fā)至近干的雞心瓶中加入乙腈，在氯化鈉離子的水化作用下，乙腈與水形成雙水相，并使MG和LMG在乙腈層富集，從而大大提高了目標(biāo)物的回收率；但過量添加氯化鈉又會(huì)產(chǎn)生鹽析作用，使目標(biāo)物與乙腈間產(chǎn)生粒子斥力，導(dǎo)致回收率有所降低[28-29]。

2.5 乙酸胺溶液（用冰乙酸調(diào)節(jié)pH值至4.5）對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響

試驗(yàn)還考查了不加乙酸胺溶液和加入2 mL的0.1 mol/L乙酸胺溶液（用冰乙酸調(diào)節(jié)pH值至4.5）對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響，結(jié)果表明不加入乙酸胺溶液時(shí)，樣品的曲線中MG的峰和旁邊的雜質(zhì)峰分不開，從而影響了試驗(yàn)對(duì)MG含量的測(cè)定，進(jìn)一步影響了試驗(yàn)對(duì)各個(gè)影響因素的影響判定。

3 試驗(yàn)方法的最終確定

通過試驗(yàn)，水產(chǎn)品中MG、LMG殘留量提取富集的方法最終優(yōu)化如下：

在GB/T 19857—2005基礎(chǔ)上，5 g左右樣品在用乙腈-乙酸胺溶液提取時(shí)，需加入2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的鹽酸羥胺溶液，1 mL濃度為1.0 mol/L的對(duì)-甲苯磺酸鈉溶液，2 mL的0.1 mol/L乙酸胺溶液（用冰乙酸調(diào)節(jié)pH值至4.5），8 g酸性氧化鋁，2 g氯化鈉。反復(fù)提取，合并上清液，旋蒸，用乙腈溶解殘?jiān)?。超聲時(shí)間5 min，靜置，取上清液，并用乙腈定容至刻度，其含量用高效液相色譜-紫外檢測(cè)器法進(jìn)行檢測(cè)。此方法得到的回收率最高，其中MG可達(dá)95.6%，LMG可達(dá)101.2%，且穩(wěn)定性好。

4 討論

（1）試驗(yàn)首次將氧化鋁、還原劑、離子對(duì)試劑、無機(jī)鹽和富集純化方法等因素綜合起來考察，并討論研究了這些因素分別對(duì)目標(biāo)物回收率的影響效果。

（2）試驗(yàn)建立了將雙水相萃取技術(shù)與高效液相色譜-紫外檢測(cè)器的方法結(jié)合用來提取、富集純化水產(chǎn)品中孔雀石綠和隱形孔雀石綠殘留的方法，該方法具有操作簡(jiǎn)單、凈化效果好、回收率高、穩(wěn)定性好、降低成本、適用于痕量分析和大批量處理等優(yōu)點(diǎn)，適合在食品檢測(cè)中推廣使用。

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Optimization Method of Extracting Malachite Green and Leucomalachite Green Residues in Fishery Products

FAN Fangfang，*LI Xiao，WU Kun，LI Jing，SHI Xudong
（Shaanxi Institute of Product Quality Supervision and Inspection，Xi'an，Shaanxi 710048，China）

On the basis ofGB/T 19857—2005，the aim of this research is to optimize the methods of extracting and concentrating LG and LMG from fishery products detecti by HPLC-UV.Some factors having effect on recovery rate have been studied，such as alumina，solution ofhydroxylamine hydrochloride，solution of p-toluene sulfonic acid，enrichment and purification methods，sodium chloride and buffer solution of ammonium acetate.The results of this investigation show that the specimen with about5 g have been extraced by acetonitrile on the condition when the dosage of solution of hydroxylamine hydrochloride is 2 mL，as well as solution of p-toluene sulfonic acid（1.0 mL/L）is 1 mL，buffer solution of ammonium acetate（20%）is 2 mL，acidic alumina should be 8 g and sodium chloride should be 2 g.The specimens have been successively separated and purified，while clear liquid in the upper level has been evaporated by rotating.It can be expected that the recovery would reach its peak value which MG is 95.6%as well as LMG is 101.2%.In addition，this is a high-recovery method which has simple pretreatment，and is applicable for quickly and accurate determination of large number of samples.

fishery products；malachite green；leucomalachite green；HPLC-UV；recovery

X52

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.01.056

1671-9646（2017）01b-0061-05

2016-12-13

范芳芳（1987— ），女，碩士，檢驗(yàn)員，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量安全。

*通訊作者：李 曉（1963— ），男，大專，工程師，研究方向?yàn)檗r(nóng)副產(chǎn)品質(zhì)量安全。