發(fā)酵乳中氨基甲酸乙酯的測定

袁小美，金 尉，陳 娟

（1.蘇州出入境檢驗(yàn)檢疫局，江蘇蘇州 215104；2.蘇州世標(biāo)檢測技術(shù)有限公司，江蘇蘇州 215104）

發(fā)酵乳中氨基甲酸乙酯的測定

袁小美1，2，金 尉1，2，陳 娟1，2

（1.蘇州出入境檢驗(yàn)檢疫局，江蘇蘇州 215104；2.蘇州世標(biāo)檢測技術(shù)有限公司，江蘇蘇州 215104）

建立發(fā)酵乳中氨基甲酸乙酯含量測定的氣相色譜質(zhì)譜方法。發(fā)酵乳樣品除蛋白后，取清液進(jìn)行硅藻土柱富集凈化，二氯甲烷洗脫，氣相色譜-質(zhì)譜儀選擇離子模式測定。為保證回收率，以氨基甲酸乙酯-D5為內(nèi)標(biāo)。氨基甲酸乙酯在10～500 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9。按信噪比3∶1確定檢出限為2 μg/kg，信噪比10∶1確定定量限為5 μg/kg?；厥章试?5%～109%，RSD＜8.7。此方法可應(yīng)用于發(fā)酵乳中氨基甲酸乙酯的測定。

氨基甲酸乙酯；硅藻土柱；內(nèi)標(biāo)法；氣相色譜質(zhì)譜法；發(fā)酵乳

發(fā)酵食品在加工與儲(chǔ)存過程中產(chǎn)生大量的氨基甲酸乙酯（Ethyl carbamate，EC）前體，如氫氰酸、尿素、瓜氨酸等，這些前體在一定條件下與發(fā)酵產(chǎn)生的乙醇發(fā)生反應(yīng)生成EC。EC是一種水溶性致癌物質(zhì)，可導(dǎo)致肺癌、淋巴癌、肝癌和皮膚癌等疾病[1]。美國、加拿大、日本等國都對(duì)其最高允許含量做了限制[2]。例如，加拿大1985年設(shè)定了各類酒中的限量標(biāo)準(zhǔn)，其中佐餐葡萄酒中EC含量不得超過30 μg/L，美國食品和藥品管理局（USFDA）規(guī)定1988年以后生產(chǎn)的佐餐葡萄酒（酒精度≤14%）中EC含量不能超過15 μg/L，日本清酒規(guī)定其含量不得超過100 μg/L[3]。在我國，EC已成為目前國內(nèi)食品安全重要監(jiān)測項(xiàng)目之一，但仍沒有相關(guān)限量法規(guī)出臺(tái)。但目前我國建立了酒和醬油中EC的檢測方法，發(fā)酵乳中EC含量雖然不高[4]，但作為常見的發(fā)酵產(chǎn)品，在日常生活中接觸很多，存在一定的風(fēng)險(xiǎn)，因此有必要對(duì)其進(jìn)行監(jiān)控。試驗(yàn)在前人研究的基礎(chǔ)上[1-6]，對(duì)發(fā)酵乳中EC的分析方法進(jìn)行驗(yàn)證和優(yōu)化，建立簡單、有效的發(fā)酵乳中EC的測定。

1 設(shè)備與材料

1.1 主要試劑

正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙腈，均為色譜純，F(xiàn)isher公司提供；鹽酸、氯化鈉、無水硫酸鈉，均為分析純，國藥試劑公司提供。

氨基甲酸乙酯（EC），純度98.5%；氨基甲酸乙酯-D5（EC-D5）標(biāo)準(zhǔn)品，純度99%；Dr.Ehrenstorfer GmbH。

硅藻土柱：AgilentChemElut5mL，P/N:12198006。

1.2 設(shè)備

Agilent GC-MS 7890N5975C型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、電子轟擊源（EI）、H2050R型高速離心機(jī)、N-EVAP型氮吹儀、渦旋混合儀、AE100型電子天平、Milli-Q型超純水器等。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別稱取標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)0.01 g（精確到0.1 mg）至10mL容量瓶中，乙腈溶解，定容，配制成1000mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，于4℃下避光保存。再分別移取100 μL至10 mL容量瓶中，乙腈定容，配制成10 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液，于4℃下避光保存。標(biāo)準(zhǔn)曲線用乙酸乙酯配制，氨基甲酸乙酯質(zhì)量濃度為10，50，100，200，500 μg/L，或根據(jù)需要配制；內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度為100 μg/L。

2 分析步驟

2.1 樣品前處理

移取樣品20 g，加入適量內(nèi)標(biāo)，2 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH值為2左右沉淀蛋白，離心取上清液，沉淀中加入8 mL水，振搖提取，離心后合并上清液，定容至20 mL，取5 mL備用。

2.2 凈化

備用液加入硅藻土柱，靜置吸附10 min。20 mL正己烷淋洗，棄去淋洗液，二氯甲烷洗脫，收集洗脫液20 mL。洗脫液經(jīng)無水硫酸鈉除水后氮吹至近干，加入1 mL乙酸乙酯，過膜后進(jìn)行氣相色譜質(zhì)譜檢測。

2.3 色譜條件

AgilentVF-WAXms型色譜柱，0.25mm×0.25μm× 30 m；色譜柱溫度：于60℃下保持1 min，以5℃/min升至150℃，以25℃/min升到230℃，在230℃下運(yùn)行5 min；載氣：氮?dú)猓?.0 mL/min；進(jìn)樣量：1 L；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣。

2.4 質(zhì)譜條件

進(jìn)樣口溫度220℃，接口溫度240℃，離子源溫度230℃，溶劑延遲14 min；檢測方式選擇離子監(jiān)測模式。

3 分析與討論

3.1 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

僅采用溶劑提取會(huì)導(dǎo)致基質(zhì)效應(yīng)明顯，且檢出限相應(yīng)較高，而乳制品中氨基甲酸乙酯本身含量不是很高，不利于方法的實(shí)際應(yīng)用。因此，采用固相萃取方法進(jìn)行處理。

分別比較乙酸乙酯、乙醚、5%乙酸乙酯-乙醚溶液、二氯甲烷[1]、10%甲醇-二氯甲烷溶液洗脫效果，20 mL二氯甲烷洗脫效果最好。

上樣后待測液自然滲入硅藻土柱，待測液和洗脫液均依靠重力作用從硅藻土柱中流出。結(jié)果表明，EC能得到很好保留，淋洗和洗脫后可以得到較好的回收效果。

發(fā)酵液體乳制品蛋白含量高，試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)若直接離心后進(jìn)行固相萃取凈化容易出現(xiàn)堵塞，影響方法穩(wěn)定性。因此，采用稀酸調(diào)節(jié)pH值沉淀蛋白質(zhì)，離心后取清液再進(jìn)行固相萃取凈化。

3.2 內(nèi)標(biāo)物的選擇

發(fā)酵乳含有大量的蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、酸等雜質(zhì)，基質(zhì)黏稠、干擾多，僅用外標(biāo)法很難達(dá)到回收率的要求，且回收率穩(wěn)定性也比較差。同位素內(nèi)標(biāo)稀釋法越來越多的用在微量化合物的檢測，可以對(duì)樣品中待測物含量進(jìn)行有效的校正，提供更好的檢測靈敏度和穩(wěn)定性[4]?？紤]到內(nèi)標(biāo)物與目標(biāo)化合物性質(zhì)越相近越好，該方法采用氨基甲酸乙酯-D5作為內(nèi)標(biāo)，價(jià)格也可以接受。

3.3 色譜條件的優(yōu)化

根據(jù)質(zhì)譜定性檢測要求、離子強(qiáng)度、樣品測定抗干擾性，分別選擇62 m/z，64 m/z作為EC和ECD5的定量離子，74 m/z，89 m/z作為EC的定性離子，76 m/z，94 m/z為EC-D5的定性離子。采用基質(zhì)匹配溶液配制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

EC和EC-D5定量及定性選擇離子見表1，EC和EC-D5標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的選擇離子色譜圖見圖1，EC標(biāo)準(zhǔn)品的選擇離子質(zhì)譜圖（62，74，89 m/z）見圖2，EC-D5標(biāo)準(zhǔn)品的選擇離子質(zhì)譜圖（64，76，94 m/z）見圖3。

表1 EC和EC-D5定量及定性選擇離子

3.4 方法檢出限和回收率

根據(jù)樣液中被測物的含量情況，選定質(zhì)量濃度與樣液相近的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和樣液中氨基甲酸乙酯的響應(yīng)值，均應(yīng)在儀器檢測線性范圍內(nèi)。在陰性基質(zhì)中進(jìn)行加標(biāo)試驗(yàn)，按信噪比3∶1確定檢出限，信噪比10∶1確定定量限。確定發(fā)酵乳中檢出限為2 μg/kg，定量限為5 μg/kg。氨基甲酸乙酯在10～500 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9，線性方程式為Y=1.088X-0.014 11。

為驗(yàn)證方法的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性，分別進(jìn)行定量限、2倍定量限和10倍定量限加標(biāo)回收試驗(yàn)，計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。結(jié)果表明，發(fā)酵乳中EC的回收率在85%～109%，RSD＜8.7%。

發(fā)酵乳樣品中EC加標(biāo)回收率及RSD（n=6）見表2。

4 結(jié)論

采用內(nèi)標(biāo)法測定發(fā)酵乳中氨基甲酸乙酯含量，該方法簡單、有效、穩(wěn)定，檢測靈敏度高，回收率好。試驗(yàn)對(duì)現(xiàn)有檢測方法進(jìn)行了優(yōu)化，能夠滿足日常檢測需求。

圖1 EC和EC-D5標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的選擇離子色譜圖

圖2 EC標(biāo)準(zhǔn)品的選擇離子質(zhì)譜圖（62，74，89 m/z）

圖3 EC-D5標(biāo)準(zhǔn)品的選擇離子質(zhì)譜圖（64，76，94 m/z）

表2 發(fā)酵乳樣品中EC加標(biāo)回收率及RSD（n=6）

[1]譚波濤，郝媛媛，趙杰，等.GC-MS法測定發(fā)酵食品中氨基甲酸乙酯的含量 [J].分析實(shí)驗(yàn)室，2011，30（12）：31-33.

[2]朱志鑫，吳惠勤，黃曉蘭，等.發(fā)酵食品中氨基甲酸乙酯的分析方法 [J].食品科技，2009，34（6）：287-290.

[3]李鳳華，曹艷平，王錫寧.GC-MS法測定酒中的氨基甲酸乙酯 [J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2009，19（6）：1 240-1 241.

[4]李杰，于瑞祥，許卓妮，等.同位素稀釋-氣相色譜-質(zhì)譜法測定發(fā)酵乳中氨基甲酸乙酯 [J].質(zhì)譜學(xué)報(bào)，2015，36（3）：268-273.

[5]石維妮，劉曉毅，趙玉琪，等.發(fā)酵性食品中的氨基甲酸乙酯含量調(diào)研 [J].中國釀造，2009（11）：124-126.

[6]嚴(yán)成.南瓜雙歧發(fā)酵乳的工藝研究 [J].西南科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2003（4）：65-68.◇

Determination of Ethyl Carbamate Residues in Fermented Milk

YUAN Xiaomei1，2，JIN Wei1，2，CHEN Juan1，2
（1.Suzhou Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Suzhou，Jiangsu 215104，China；2.Suzhou World Standard Testing Technology Co.，Ltd，Suzhou，Jiangsu 215104，China）

A method for determination of ethyl carbamate residues in fermented food by GC-MS is developed.By means of diatomaceous earth column，ethyl carbamate is enriched and purified.The target substance is eluted by dichloromethane.The identification is performed by GC-MS in selected ion monitoring（SIM） mode.Ethyl carbamate-D5 is used as internal standard.Good linear at 10～500 μg/L，the correlation coefficient R2=0.999 9.The limit of determination is 2 μg/kg，the limit of quantitation is 5 μg/kg.The recovery rate is 85%～109%，RSD＜8.7.This method can be applied to the detection of EC in fermented food.

ethyl carbamate；diatomaceous earth column；internal standard method；GC-MS；fermented milk

TQ225

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.01.053

1671-9646（2017）01b-0053-03

2016-12-10

袁小美（1990— ），女，本科，檢驗(yàn)員，研究方向?yàn)槭称窓z驗(yàn)。