溶栓治療對心肌梗死患者Th17及Treg細胞的影響

鄭三福 陳宇翔 郭偉溪 王 羽

(廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院杏林院區(qū)內(nèi)科，廈門361003)

溶栓治療對心肌梗死患者Th17及Treg細胞的影響

鄭三福 陳宇翔①郭偉溪②王 羽③

(廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院杏林院區(qū)內(nèi)科，廈門361003)

目的：觀察心肌梗死患者溶栓前后體內(nèi)Th17、Treg細胞及相關(guān)因子含量，從而探討三者的相關(guān)性。 方法：提取外周血單個核細胞，流式細胞術(shù)檢測Th17及Treg含量，ELISA方法檢測上清IL-17及TGF-β含量變化，實時定量PCR檢測RORγT及Foxp3含量。 結(jié)果：與對照組相比，實驗組患者在溶栓前、后體內(nèi)Th17細胞，IL-17及RORγT含量均顯著升高；Treg細胞、TGF-β及Foxp3含量顯著降低(P<0.05)。與實驗組患者溶栓前相比，溶栓后7 d體內(nèi)Th17細胞，IL-17及RORγT含量顯著降低；Treg細胞、TGF-β及 Foxp3含量顯著升高(P<0.05)。結(jié)論：與對照組相比，心肌梗死患者體內(nèi)中存在Th17及相關(guān)因子升高，Treg及相關(guān)因子降低，溶栓治療后可使Th17及相關(guān)因子降低，Treg及相關(guān)因子升高。

Th17；Treg；溶栓治療；心肌梗死

急性心肌梗死為冠脈血管斑塊破裂形成血管急性堵塞，從而導(dǎo)致血流急性中斷，越來越多的研究表明免疫在心梗發(fā)病機制中的重要作用，而臨床中的溶栓治療也是急性心肌梗死的有效措施之一[1,2]。Th17及Treg細胞是近年來新近研究和發(fā)現(xiàn)的免疫細胞，其在調(diào)節(jié)免疫穩(wěn)態(tài)中起著重要作用。已有研究發(fā)現(xiàn)，Th17及Treg細胞參與急性心肌梗死疾病的發(fā)生發(fā)展[3]，然而國內(nèi)對此兩種細胞是否參與心肌梗死溶栓治療的機制研究較少，因此本研究選取我院心內(nèi)科接受溶栓治療的心肌梗死患者，觀測Th17/Treg的變化，來探討Th17/Treg的在疾病發(fā)生及治療中的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 一般資料

(1)實驗組：選取2013年7月到2014年12月在我院心內(nèi)科就診的心肌梗死患者50例，其中男性20例，女性30例，年齡為50～71，平均(57.1±9.4)歲?；颊呔蟇HO制定的急性心肌梗死診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]，且均接受溶栓治療，治療后根據(jù)相關(guān)診斷[4]判定為冠脈再通，排除自身存在風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性血管炎等其他風(fēng)濕性免疫性疾病的患者。(2)對照組：選取健康志愿者50例，其中男性21例，女性29例，年齡為51～72，平均(58.2±9.5)歲。健康志愿者不存在心梗的臨床癥狀，并且影像學(xué)檢查未見異常，心肝功能基本正常。排除標(biāo)準(zhǔn)同實驗組。實驗組與對照組在性別、年齡等方面差異不存在統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本調(diào)查程序符合本單位的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)并得到批準(zhǔn)，且已得到患者與家屬的知情同意。

1.1.2 主要試劑 流式抗體CD3抗體、CD4單抗、CD25單抗、IL-17A單抗、Foxp3單抗及Th17專用固定劑，Th17專用透膜劑，F(xiàn)oxp3專用固定透膜劑、IL-17A ELISA試劑盒及TGF-β ELISA試劑盒均購于Ebioscience公司。TRIZOL裂解液、PrimeScriptTMRT reagent Kit (Perfect Real Time)及TaKaRa SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒均購于TaKaRa公司。佛波酯(PMA)及離子霉素均購于Sigma公司。

1.1.3 標(biāo)本采集 分別收集對照組及實驗組溶栓前、溶栓后3、5、7 d血液標(biāo)本9 ml，肝素抗凝。

1.2 方法

1.2.1 血清細胞因子檢測 將3 ml血液標(biāo)本高速離心后取上清-80℃保存，批量檢測。IL-17A及TGF-β的含量采用酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心法(ELISA)檢測，操作步驟嚴(yán)格按照說明書進行。

1.2.2 PBMC的分離培養(yǎng) 將6 ml血液標(biāo)本與PBS緩沖液倍比稀釋混勻，嚴(yán)格按照說明書進行操作，將混合液輕輕置于淋巴細胞分離液上，4℃，3 000 r/min，離心30 min。輕輕取出離心管，此時會出現(xiàn)分層，將第二層白膜細胞洗出置于另一離心管中，加入PBS清洗，獲得PBMC單個核細胞備用。用RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整PBMC密度為3×106ml-1，取2 ml/孔置于6孔板中培養(yǎng)，加入PMA(25 ng/ml)、離子霉素(1 μg/ml)共培養(yǎng)5 h。收集細胞進行流式檢測及mRNA 表達檢測。

1.2.3 Th17細胞分析 取刺激后的PBMC，PBS反復(fù)洗滌，配置成100 μl的單細胞懸液，向上述懸液中加入抗CD4單抗10 μl，避光染色30 min。經(jīng)PBS洗滌1次后，加入Th17專用固定劑，室溫孵育15 min，PBS混勻洗滌后，應(yīng)用透膜劑，室溫避光孵育20 min，PBS重懸洗滌進行胞內(nèi)染色。向流式管內(nèi)加入APC標(biāo)記的抗IL-17A單抗及同種型抗體10 μl，混勻后室溫避光孵育30 min，經(jīng)PBS洗滌一次后，加入300 μl溶液，斡旋混勻后，上FAC Scan流式細胞儀檢測，應(yīng)用FlowJo軟件分析。

1.2.4 Treg細胞分析 取刺激后的PBMC，PBS反復(fù)洗滌，配置成100 μl的單細胞懸液，向上述懸液中加入抗CD4及CD25單抗10 μl，避光染色30 min。經(jīng)PBS洗滌一次后，加入新鮮的Foxp3專用固定透膜劑，4℃避光孵育30 min，孵育后，加入新鮮配置的專用緩沖液重懸細胞，然后加入抗Foxp3單抗及同種型抗體10 μl，混勻后室溫避光孵育30 min，經(jīng)PBS洗滌一次后，加入300 μl溶液，斡旋混勻后，上FAC Scan流式細胞儀檢測，應(yīng)用FlowJo軟件分析。

1.2.5 mRNA 表達檢測 實驗所需器械均經(jīng)高壓去RNA酶處理，并經(jīng)0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水處理，且實驗均在冰塊上操作，降低溫度對結(jié)果的影響。取PBMC，加入1 ml TRIZOL裂解5 min，一次加入三氯甲烷、異丙醇及75%乙醇進行獲取RNA，10 μl DEPC水溶解RNA沉淀，紫外分光光度儀測定濃度及純度。應(yīng)用TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit (Perfect Real Time)，嚴(yán)格按照說明書，將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并應(yīng)用TaKaRa SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒，進行PCR體系的擴增及反應(yīng)。其中，引物序列為：β-actin： 5′-GATCATTGCTCCTCCTGAGC-3′和5′-TGTGGACTTGGGAGAGGACT-3′；Foxp3：5′-GCACAAGTGCTTTGTGCGAGT-3′和5′-TGTCTGTGGTTGCAGAC-GTTAT-3′；RORγT： 5′-GCAGCGCTCCAACATCTTCT-3和5′-ACGTACTGAATGGCCTCGGT-3′試驗時每個樣本和基因做2個相同的復(fù)孔。

2 結(jié)果

2.1 各組對象體內(nèi)Th17/Treg亞群分析 與對照組相比，實驗組患者在溶栓前，溶栓后3、5及7 d體內(nèi)CD4+IL-17+T細胞(即Th17細胞)表達量顯著升高，CD4+CD25+Foxp3+T細胞(即Treg細胞)表達量顯著降低，各組差異均存在統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與實驗組患者在溶栓前相比，溶栓后7d體內(nèi)Th17細胞表達量顯著降低，Treg細胞表達量顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，具體見表1及圖1、2。

2.2 各組對象體內(nèi)細胞因子分泌 與對照組相比，實驗組患者在溶栓前，溶栓后3、5及7 d體內(nèi)IL-17含量顯著升高，TGF-β含量顯著降低，各組差異均存在統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與實驗組患者在溶栓前相比，溶栓后5 d及7 d體內(nèi)IL-17含量顯著降低，TGF-β含量顯著升高，各組差異均存在統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，具體見表2。

GroupsCD4+IL-17+CD4+CD25+Foxp3+Experimentalgroup-beforethrombolysis15.7±5.71)5.9±3.01)Afterthrombolysis3d14.4±5.11)6.4±3.41)Afterthrombolysis5d12.4±5.31)6.9±3.11)Afterthrombolysis7d10.1±5.51)2)7.8±2.91)2)Normalcontrolgroup7.9±5.29.7±3.0

Note：Vs normal control group,1)P<0.05;vs before thrombolysis,2)P<0.05.

圖1 各組對象體內(nèi)Th17亞群分析Fig.1

圖2 各組對象體內(nèi)Treg亞群分析Fig.2

2.3 各組對象體內(nèi)細胞因子分泌 各組對象轉(zhuǎn)錄因子表達與對照組相比，實驗組患者在溶栓前，溶栓后3、5及7 d體內(nèi)RORγT含量顯著升高，F(xiàn)oxp3含量顯著降低，各組差異均存在統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與實驗組患者溶栓前相比，溶栓后5 d及7 d體內(nèi)RORγT含量顯著降低，溶栓后7 d體內(nèi)Foxp3含量顯著升高，各組差異均存在統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，具體見圖3。

GroupsIL-17TGF-βExperimentalgroup-Beforethrombolysis311.7±15.71)123.8±11.11)Afterthrombolysis3d313.5±14.31)132.7±10.91)Afterthrombolysis5d267.8±11.31)2)224.8±11.71)2)Afterthrombolysis7d220.7±13.21)2)260.5±12.11)2)Normalcontrolgroup160.8±14.5312.3±12.6

Note：Vs normal control group,1)P<0.05;vs before thrombolysis,2)P<0.05.

圖3 各組對象轉(zhuǎn)錄因子表達Fig.3 Relative transcription factor expression level in each groupNote: Vs normal control group,#.P<0.05;vs before thrombolysis,*.P<0.05.

3 討論

急性心肌梗死是心肌的急性缺血壞死，是在冠脈病變的基礎(chǔ)上，發(fā)生的冠脈血液的急性減少或中斷，從而造成心肌的急性損傷。作為一種嚴(yán)重危害人類健康的疾病，多種致病因素均可誘導(dǎo)其發(fā)病，免疫因素已被越來越多的研究證明與心梗發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。其中，免疫學(xué)方面有關(guān)發(fā)病機制的研究主要包括以下幾點：①多種因素導(dǎo)致的炎癥和免疫細胞的趨化和浸潤，如補體系統(tǒng)的激活；②多種細胞因子的共同作用；③病理性自身免疫應(yīng)答參與的心肌損傷，多種因素共同作用導(dǎo)致心肌組織的壞死與損傷[5,6]。然而，確切病因及免疫調(diào)節(jié)因素至今未明。

Th17及Treg細胞是近年來發(fā)現(xiàn)的新型免疫細胞，具有獨立的分化和調(diào)節(jié)機制，且互相抑制，Th17的產(chǎn)生可抑制Treg的分化及發(fā)育，兩者可通過多種途徑影響和參與機體穩(wěn)態(tài)的構(gòu)建。在機體正常情況下，Th17及Treg細胞保持動態(tài)平衡，以利于機體多種免疫反應(yīng)的進行[7,8]。Th17/Treg比例失衡則導(dǎo)致炎性反應(yīng)過度，參與多種心血管疾病的發(fā)生。已有研究表明[9,10]，在動脈粥樣硬化患者外周血中存在Th17/Treg比例失衡，Th17和Treg細胞對急性心肌梗死不穩(wěn)定性斑塊的早期形成具有重要作用[11]，尤其IL-17在冠狀動脈平滑肌細胞中可以引起炎癥反應(yīng)，促進了動脈粥樣斑塊的形成，加速冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的發(fā)生和發(fā)展[12,13]。本研究選取我院心內(nèi)科接受溶栓治療的心肌梗死患者進行分析，觀測Th17/Treg的變化，來探討Th17/Treg在疾病發(fā)生及治療中的意義。

本研究可以看出，與對照組相比，實驗組患者在溶栓前、后體內(nèi)Th17細胞，IL-17及RORγT含量顯著升高，Treg細胞，TGF-β及Foxp3含量顯著降低，各組差異均存在統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；針對實驗組患者，與溶栓前相比，溶栓后7 d體內(nèi)Th17細胞，IL-17及RORγT含量顯著降低，Treg細胞，TGF-β及Foxp3含量顯著升高(P<0.05)。以上結(jié)果均說明溶栓改善疾病病情的機制與調(diào)節(jié)Th17/Treg比例有密切關(guān)系。Th17細胞及Treg細胞在免疫調(diào)節(jié)功能中互相拮抗與制約，兩者平衡狀態(tài)決定了疾病的發(fā)展方向。已有研究發(fā)現(xiàn)，IL-17可通過分泌多種物質(zhì)重構(gòu)心室，刺激纖維膠原和細胞外基質(zhì)分泌，同時還可與其他因子協(xié)同反應(yīng)加大炎性反應(yīng)。其中Treg細胞保護疾病的機制可能與分泌的TGF-β密切相關(guān)，其可抑制炎性反應(yīng)，調(diào)控免疫的耐受性，抑制金屬蛋白酶活性，調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)的形成，從而促進組織的修復(fù)[14]。我們的研究結(jié)果與這些研究[9,10]基本吻合，同時臨床研究也發(fā)現(xiàn)，急性心?；颊唧w內(nèi)外周血存在Th17及IL-17的增高，以及與Treg平衡的打破，均說明了Th17細胞及其分泌的細胞因子具有促進疾病發(fā)生發(fā)展，而Treg細胞具有減緩疾病發(fā)生發(fā)展的作用。因此調(diào)節(jié)Th17/Treg的比值在治療疾病中具有重要意義，因此臨床和科研可通過調(diào)節(jié)兩者的比例來治療與改善疾病。

綜上所述，相對于對照者，心肌梗死患者體內(nèi)存在Th17及相關(guān)因子的增高，Treg及相關(guān)因子的降低，Th17及Treg細胞參與了疾病的發(fā)生發(fā)展，而溶栓治療后可緩解這一狀況，提示免疫因素在疾病的發(fā)病及治療中具有重要作用。

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[收稿2016-07-13 修回2016-08-26]

(編輯 倪 鵬)

Thrombolytic therapy on function of Th17 and Treg in patients with myocardial infarction

ZHENGSan-Fu,CHENYu-Xiang,GUOWei-Xi,WANGYu.

DepartmentofMedicine，theFirstAffiliatedHospitalXianmenUniversityXinglinBranch,Xiamen361003,China

Objective:To investigate Th17,Treg and related factors before and after myocardial infarction,and explore the correlations among them.Methods: Extracted mononuclear cell in peripheral blood,and used fluorescence-activated cell sorting analysis to detect the contect of Th17 and Treg.Enzyme-linked immunosorbent assay was used to detect cytokine production of IL-17 and TGF-β；real-time PCR was used to detect the contect of RORγT and Foxp3.Results: Compared with the control group,experimental group (both before and after thrombolysis) had increased expressions of Th17,IL-17 and RORγT(P<0.05);the expressions of Treg,TGF-β and Foxp3 had decreased(P<0.05).Compared with the group of before thrombolysis,the group of after thrombolysis 7 d had decreased expressions of Th17,IL-17 and RORγT(P<0.05);increased expressions of Treg,TGF-β and Foxp3(P<0.05).Conclusion: Compared with the control group,patients with myocardial infarction have the high levels of Th17 and the related factors,the decreased levels of Treg and the related factors.Thrombolytic therapy can decrease the levels of Th17 and the related factors,and increase levels of Treg and the related factors.

Th17；Treg；Thrombolytic therapy;Myocardial infarction

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.03.027

鄭三福(1979年-)，男，碩士，主治醫(yī)生，主要從事血管內(nèi)科方面研究。

R541.4

A

1000-484X(2017)03-0441-04

①廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗科，廈門361003。

②廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外科，廈門361003。

③廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院超聲影像科，廈門361003。