miR-122a抑制人喉癌細(xì)胞株Hep2細(xì)胞增殖的研究

陳云華 于亞峰

(常熟市第二人民醫(yī)院耳鼻咽喉科，常熟215500)

miR-122a抑制人喉癌細(xì)胞株Hep2細(xì)胞增殖的研究

陳云華 于亞峰①

(常熟市第二人民醫(yī)院耳鼻咽喉科，常熟215500)

目的：研究miR-122a對(duì)人喉癌細(xì)胞株Hep2細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期以及相關(guān)蛋白表達(dá)量的影響。方法：人喉癌細(xì)胞株Hep2細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR-122a寡聚核苷酸(A組)和miR-122a inhibitor(阻遏物)(B組)，同時(shí)設(shè)立阻遏物陰性對(duì)照( inhibitor negative control，miR-NC inhibitor)(C組)和空白對(duì)照(D組)。用RT-PCR、MTT法、流式細(xì)胞儀和Western blot技術(shù)評(píng)價(jià)各組細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的生物學(xué)特征。結(jié)果：轉(zhuǎn)染miR-122a寡聚核苷酸后，Hep2細(xì)胞中miR-122a表達(dá)顯著增加。同D組相比，A組細(xì)胞增殖水平明顯受到抑制，miR-122a寡聚核苷酸能夠有效誘導(dǎo)Hep-2細(xì)胞周期阻滯在G1/G0期，A組細(xì)胞分裂周期蛋白42表達(dá)水平明顯下調(diào)，細(xì)胞周期調(diào)控因子蛋白CDK4及細(xì)胞周期素D1蛋白表達(dá)水平明顯降低。結(jié)論：miR-122a寡聚核苷酸能夠顯著抑制喉癌細(xì)胞Hep2的增殖，miR-122a是潛在的人喉癌細(xì)胞基因治療的候選靶點(diǎn)。

喉腫瘤；miR-122a；細(xì)胞周期；Hep2細(xì)胞

喉癌作為頭頸部常見的惡性腫瘤之一，現(xiàn)階段常用的治療手段主要包括兩種，放療后全喉切除或者是直接手術(shù)治療。但是這兩種治療的方式影響了患者的術(shù)后喉功能和生活質(zhì)量[1，2]。因而需要研發(fā)新的治療策略，微小RNA(miRNAs，miRNA)分子治療因其對(duì)機(jī)體損傷較小的優(yōu)勢(shì)成為相關(guān)腫瘤的新治療模式。微小RNA是非編碼小RNA，大小為20～25個(gè)核苷酸(nucleotide，nt)。最近相關(guān)研究表明，miRNA能夠在細(xì)胞功能調(diào)控方面發(fā)揮巨大作用，同腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，例如，在腫瘤中某些miRNA呈特異性表達(dá)，表現(xiàn)出促癌或者抑癌的作用[3]。借助芯片技術(shù)的巨大優(yōu)勢(shì)，依托常熟市第二人民醫(yī)院和蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院大量的人喉癌標(biāo)本組織，美國LC Sciences公司提供通過測(cè)定分析正常人喉組織和人類喉癌細(xì)胞系中miRNA表達(dá)譜，研究結(jié)論發(fā)現(xiàn)多種人喉癌中表達(dá)特異性的miRNA(見表1)。miR-122a作為一個(gè)有代表性的miRNA，是抑癌性微小RNA，近期的研究結(jié)果證實(shí)miR-122a在許多腫瘤組織中表達(dá)量較低[4]，這其中就包括喉癌。本研究通過轉(zhuǎn)染人喉癌細(xì)胞，增加miR-122a在喉癌細(xì)胞中的表達(dá)量，觀察其對(duì)人喉癌瘤細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)量以及其增殖的影響，從而探究miR-122a對(duì)喉癌細(xì)胞生長增殖的生物學(xué)特征影響。本文旨在研究喉癌發(fā)生發(fā)展中miR-122a對(duì)喉癌的影響作用機(jī)制，最后能夠?yàn)閙iR-122a作為喉癌診斷以及治療靶點(diǎn)提供合理的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 通過miRNAs目標(biāo)靶基因數(shù)據(jù)庫(http://www.mirbase.org/)查詢獲得miR-122a基因序列，并且委托華大基因公司設(shè)計(jì)合成；胎牛血清由杭州四季青生物工程材料有限公司提供，1640培養(yǎng)基由美國Hyclone提供，Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑由美國Invitrogen 公司提供，寡聚核苷酸由上海華大基因科技有限公司提供，TaqMan microRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒由寶生物工程(大連)有限公司提供，PVDF 膜為美國伯樂Bio-Rad，ECL發(fā)光液顯影液由美國賽默飛公司提供，細(xì)胞周期蛋白一抗CDC42、CDK4和Cyclin D由武漢博士德生物工程有限公司提供。主要儀器：MK3多功能酶標(biāo)儀由美國賽默飛公司提供，F(xiàn)ACSCanto流式細(xì)胞儀由美國BD公司提供，上海天能Tanon 3500凝膠成像系統(tǒng)由河南博奧誠恒科貿(mào)有限公司提供，Image J軟件由美國國立衛(wèi)生研究院提供。

1.2 方法

1.2.1 Hep2細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 將Hep2細(xì)胞分為A組(轉(zhuǎn)染miR-122a寡聚核苷酸組)、B組(miR-122a inhibitor)，C組(miR-122a-NC inhibitor)和D組(空白對(duì)照組)。在37℃、5%CO2孵箱中，細(xì)胞培養(yǎng)在含10%新生胎牛血清的1640培養(yǎng)基中，待細(xì)胞生長到對(duì)數(shù)生長期時(shí)進(jìn)行測(cè)量。將調(diào)整后的Hep2細(xì)胞(1×106ml-1)接種到12孔培養(yǎng)板中，正常培養(yǎng)24 h，融合細(xì)胞在50%～60%時(shí)。轉(zhuǎn)染試劑和寡聚核苷酸按照說明書進(jìn)行1∶1混合，混勻后孵育15 min，接種到12孔板中，然后繼續(xù)培養(yǎng)6 h，換完生長液后連續(xù)培養(yǎng)24 h。然后重復(fù)轉(zhuǎn)染1次，不作處理的組為空白對(duì)照組。

1.2.2 miR-122a的表達(dá)檢測(cè) 轉(zhuǎn)染Hep2細(xì)胞2 d后，利用細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞。將提取的總miRNA溶入無RNA酶的雙蒸水中，用來檢測(cè)miRNA的質(zhì)量和濃度。利用TaqMan microRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，加入反義miRNA或內(nèi)參U6引物擴(kuò)增。在擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束以后，分析PCR反應(yīng)曲線，最后得到Ct值。PCR反應(yīng)完成后，利用ABI 7300System SDS軟件分析，記錄分析與之相應(yīng)的Ct值，利用2-ΔΔCt方法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 MTT法檢測(cè)Hep2細(xì)胞增殖 Hep2細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，用胰酶消化后經(jīng)PBS沖洗，收集細(xì)胞。進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)以后，以濃度2×104個(gè)/100 μl分裝到96孔培養(yǎng)板中，做6個(gè)復(fù)孔。在37℃、5%CO2培養(yǎng)條件下，每孔加入5 μl的MTT溶液培養(yǎng)，到達(dá)檢測(cè)點(diǎn)(24、48、72 h)時(shí)棄去培養(yǎng)液，每孔加入150 μl二甲基亞砜，輕輕振動(dòng)10 min，在550nm波長處，利用多功能酶標(biāo)儀，檢測(cè)各孔的吸光度值。

1.2.4 利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的周期 腫瘤細(xì)胞被轉(zhuǎn)染48 h以后，通過胰酶消化后收集腫瘤細(xì)胞，加入PBS混勻，1 500 r/min離心 5 min，重復(fù)洗1次。最后分別加入PI及RNase A，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)Hep2腫瘤細(xì)胞的周期狀況。

1.2.5 周期相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測(cè) 經(jīng)寡聚核苷酸轉(zhuǎn)染48 h后的四組腫瘤細(xì)胞提取總蛋白，以利用傳統(tǒng)的BCA蛋白定量法進(jìn)行蛋白定量。對(duì)應(yīng)的SDS-PAGE(12%)凝膠電泳分離蛋白質(zhì)(40 μg)。濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，脫脂奶粉37℃封閉1 h，在4℃下，細(xì)胞周期蛋白一抗CDC42、CDK4和Cyclin D孵育過夜，HRP標(biāo)記的二抗孵育1.5 h后。利用ECL發(fā)光液顯影和凝膠成像儀成像。利用Image J軟件分別測(cè)量四組電泳條帶的灰度值。獲得各實(shí)驗(yàn)組相對(duì)灰度值(不同處理組灰度值除以空白對(duì)照組)，從而判斷CDC42蛋白相對(duì)的表達(dá)情況，GAPDH作為內(nèi)對(duì)照。

表1 正常人喉組織和人類喉癌細(xì)胞系miRNA表達(dá)譜

Tab.1 miRNA differentially expressed profile between normal laryngeal tissue and human laryngeal carcinoma cell line

miRNAProportionNormallaryngealtissueMinimumMaximumAverageHumanlaryngealcarcinomacelllineMinimumMaximumAveragemiR-1005.013195.536367.894564.5812229.7630860.3422039.98miR-106b4.51590.813166.841591.572574.777172.735481.94miR-122a0.029159.7516700.512816.97112.31345.56228.94miR-127-3P6.61586.641235.18905.143406.868928.986137.62miR-175.793077.46936.94438.1514540.138039.8825196.79miR-2181.011631.4116004.838929.611000.0217231.129018.91miR-29c0.26947.255562.42570.93164.321269.59632.47

Note：The results ofP<0.01 in table were obtained byttest of indepo samples,and the proportion were between human laryngeal carcinoma cell line and normal human laryngeal tissue.

2 結(jié)果

2.1 miRNA微陣列芯片表達(dá)譜分析結(jié)果 微陣列芯片雜交結(jié)果顯示，miR-122a的表達(dá)降低最明顯，見表1。

2.2 Hep2細(xì)胞中miR-122a的表達(dá)檢測(cè)結(jié)果 Hep2細(xì)胞被轉(zhuǎn)染miR-122a寡聚核苷酸48 h以后，miR-122a相對(duì)表達(dá)量分別為：D組(51.49±0.31),C

圖1 轉(zhuǎn)染miR-122a后，Hep2細(xì)胞中miR-122a表達(dá)水平明顯上調(diào)Fig.1 MiR-122a expression levels significantly increased in Hep2 cells after transfected miR-122a

圖2 轉(zhuǎn)染miR-122a后不同時(shí)間MTT法檢測(cè)Hep2細(xì)胞生長情況Fig.2 MTT assay Hep2 cells growth at different times after transfected miR-122a

圖3 miR-122a誘導(dǎo)Hep2細(xì)胞周期阻滯在G1/G0期Fig.3 miR-122a induced Hep2 cell cycle arrest in G1/ G0 phase

組(53.58±0.68)，B組(43.36±0.64)，A組(96.13±1.12)。經(jīng)單因素方差分析，4組整體差異顯著(F=1 905.178，P=0.000)，兩兩比較發(fā)現(xiàn)：與D組相比，A組細(xì)胞中miR-122a表達(dá)水平明顯上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(LSD-t=52.493，P=0.000)，見圖1。

2.3 MTT法檢測(cè)Hep2腫瘤細(xì)胞的增殖情況 Hep2細(xì)胞被miR-122a寡聚核苷酸轉(zhuǎn)染以后，利用MTT法分別在24、48、72 h后腫瘤細(xì)胞相對(duì)存活率如圖2所示。在24 h后不同時(shí)間段內(nèi)，A組的相對(duì)存活率顯著低于B、C和D組 (均P<0.05)，見圖2。

2.4 腫瘤細(xì)胞周期的檢測(cè) miR-122a寡聚核苷酸轉(zhuǎn)染Hep2腫瘤細(xì)胞48 h，A組細(xì)胞G1/G0期達(dá)68.28%，明顯高于B組(30.34%)，C組(46.27%)和D組(46.66%)，具有差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果表明miR-122a寡聚核苷酸能夠有效誘導(dǎo)Hep2細(xì)胞周期阻滯在G1/G0期。見圖3、4。

2.5 Western blot檢測(cè)CDC42及細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá) 轉(zhuǎn)染miR-122a寡聚核苷酸的Hep2細(xì)胞48 h后，A組CDC42蛋白表達(dá)量B組和D組相比，其表達(dá)量明顯減少(P<0.05)，表明Hep2細(xì)胞在被miR-122a寡聚核苷酸轉(zhuǎn)染后CDC42蛋白表達(dá)水平降低，同miR-122a呈負(fù)相關(guān)。而且同C組相比，CDK4以及Cyclin D1蛋白表達(dá)水平也是明顯減少，見圖5。

圖4 轉(zhuǎn)染miR-122a Hep2細(xì)胞周期圖Fig.4 Transfected with miR-122a in Hep2 cell cycle

圖5 各組CDK4、Cylin D1及CDC42蛋白表達(dá)水平Fig.5 CDK4,Cyclin D1 protein levels and CDC42 in groups

3 討論

miRNAs作為一類內(nèi)源性非編碼的小RNA分子，近期科研結(jié)果顯示miRNA與人類多種腫瘤的形成與發(fā)展密切關(guān)聯(lián)。miR-122a作為廣泛存在的且在人類正常細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)較早的miRNA，其中重要的特點(diǎn)是miR-122a在多種腫瘤組織中呈低表達(dá)的狀態(tài)。當(dāng)今熱點(diǎn)之一是探討miRNA在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中的功能。現(xiàn)階段miRNA的發(fā)現(xiàn)為研究基因的表達(dá)調(diào)控提供了另一種研究思路[5]。

喉癌其本質(zhì)上是因?yàn)槠涠嗷虍惓６l(fā)生的惡性疾病[6]。miR-122a與喉癌細(xì)胞相關(guān)周期蛋白的表達(dá)目前國內(nèi)外尚沒有相關(guān)報(bào)道。本次研究通過轉(zhuǎn)染miR-122a寡聚核苷酸的方式，使Hep2細(xì)胞內(nèi)的miR-122a表達(dá)量升高，通過RT-PCR法檢測(cè)其表達(dá)數(shù)量后，研究結(jié)果與空白組相比，轉(zhuǎn)染寡聚核苷酸組的喉癌細(xì)胞中miR-122a表達(dá)量明顯增多，并且進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，通過MTT法檢測(cè)喉癌細(xì)胞增殖，轉(zhuǎn)染寡聚核苷酸組喉癌細(xì)胞的相對(duì)存活率隨著時(shí)間的相對(duì)延長，抑制效應(yīng)增強(qiáng)，并且明顯降低。另外細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，寡聚核苷酸miR-122a能有將腫瘤細(xì)胞阻滯在G1/G0期。本研究表明，miR-122a同抑制喉癌細(xì)胞的增殖密切相關(guān)。因此本次研究推測(cè)miR-122a可能在喉癌的發(fā)生過程中起著非常重要的抑制作用。

研究表明，細(xì)胞周期中的G1期是啟動(dòng)細(xì)胞周期循環(huán)的重要時(shí)期。其中的CDK4/Cyclin D1是G1期向S期轉(zhuǎn)換的重要的周期蛋白[7]。Western blot的研究結(jié)果顯示CDK4/Cyclin D1表達(dá)相對(duì)于對(duì)照組和無義序列組顯著減少，此結(jié)果表明G1期向S期轉(zhuǎn)換受到明顯的抑制作用。CDC42具有GTP酶活性，定位于人染色體1p36.1[8，9]。當(dāng)前研究發(fā)現(xiàn)CDC42在乳腺癌等多種腫瘤中具有較高的表達(dá)量，參與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、周期等有關(guān)的許多過程[10，11]。Gao等[12]研究miR-137在HCC肝癌細(xì)胞中表達(dá)增高，能夠調(diào)控CDC42，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞周期阻滯在G1/G0期，從而抑制其增殖。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)miR-122a寡聚核苷酸能夠顯著下調(diào)CDC42蛋白和CDK4和Cyclin D1水平表達(dá)，表明CDC42、CDK4和Cyclin D1可能是miR-122a的下游靶基因，miR-122a通過調(diào)控 CDC42、CDK4和Cyclin D1抑制Hep2細(xì)胞增殖。我們將進(jìn)一步研究人喉癌細(xì)胞生長過程中miR-122a對(duì)Cyclin D1、CDC42和CDK4的調(diào)控作用。

總之，體外實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，被轉(zhuǎn)染miR-122a寡聚核苷酸后的Hep2細(xì)胞，miR-122a表達(dá)量增高明顯。因此我們推測(cè)miR-122a通過調(diào)節(jié)CDC42蛋白的表達(dá)，進(jìn)而影響Hep2喉癌細(xì)胞的細(xì)胞周期和增殖能力。miR-122a能夠作為潛在的人喉癌細(xì)胞基因治療的候選靶點(diǎn)，可為喉癌的臨床治療提供有效的解決方案。

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[收稿2016-09-26 修回2016-10-11]

(編輯 許四平)

Impact of miR-122a on inhibition proliferation of laryngeal carcinoma cell line Hep2

CHENYun-Hua,YUYa-Feng.

DepartmentofOtolaryngology,ChangshuSecondPeople′sHospital,Changshu215500，China

Objective:To study the effect of miR-122a on inhibition proliferation of laryngeal carcinoma cell line Hep-2.Methods: The oligomucleotide of miR-122a was transfected into laryngeal carcinoma cell line Hep2 cells,which were devided into three groups of A(miR-122a transfection),B(miR-122a inhibitor),C(miR-122a-NC inhibitor) and group of D(blank control).The expression of miR-122a was defected by RT-PCR,and relevant protein expression was evaluated by Western blot.The cell proliferation and cell cycle were determined by MTT assy and flow cytometry,respectively.Results: Compared to group D,miR-122a expression in Hep2 cells was obviously elevated atter miR-122a-transfected.The proliferation of Hep2 cells in group A was significantly inhibited and the cell cycle arrested at G1/G0 phase.The protein expression of CDC42 was downregulated with decreased expressions of CDK4 and cyclin D1 in group A.Conclusion: miR-122a inhibits the proliferation activity of Hep2 cells,suggesting that miR-122a can be taken as a potential candidate for gene therapy of laryngeal carcinoma.

Laryngeal carcinoma;miR-122a;Cell cycle;Hep2 cells

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.03.007

陳云華(1974年-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事頭頸部腫瘤方面的研究,E-mail：yunhua1974@126.com。

及指導(dǎo)教師：于亞峰(1974年-)，男，博士，副主任醫(yī)師，主要從事頭頸部腫瘤方面的研究。

R739.65

A

1000-484X(2017)03-0352-04

①蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科，蘇州215006。