對氨基水楊酸鈉對鉛誘導(dǎo)體外培養(yǎng)PC12細胞凋亡的影響

何勝男，秦文霞，盧艷紅，李 康，羅旖旎，袁宗祥，蔣秀麗，莫玉煥，李文杰，姜岳明

（廣西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生毒理學(xué)教研室，廣西南寧 530021）

對氨基水楊酸鈉對鉛誘導(dǎo)體外培養(yǎng)PC12細胞凋亡的影響

何勝男，秦文霞，盧艷紅，李 康，羅旖旎，袁宗祥，蔣秀麗，莫玉煥，李文杰，姜岳明

（廣西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生毒理學(xué)教研室，廣西南寧 530021）

目的 探討對氨基水楊酸鈉（PAS-Na）對鉛誘導(dǎo)PC12細胞凋亡的影響。方法 PC12細胞培養(yǎng)至其對數(shù)生長期后，正常對照組和正常+PAS-Na 500 μmol·L-1組細胞于正常培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h后棄培養(yǎng)液，前者加入正常培養(yǎng)液、后者加入PAS-Na繼續(xù)培養(yǎng)24 h。醋酸鉛模型組及醋酸鉛+PAS-Na 20，100和500 μmol·L-1組先與醋酸鉛（終濃度10 μmol·L-1）共培養(yǎng)24 h后棄培養(yǎng)液，再加入相應(yīng)濃度PAS-Na繼續(xù)培養(yǎng)24 h。用MTT法測定細胞存活率，試劑盒方法測定細胞內(nèi)還原型谷胱甘肽（GSH）含量，Hoechst33342熒光染色檢測凋亡率，AnnexinⅤ/PI雙染流式細胞術(shù)檢測PC12細胞早期凋亡率，Western蛋白質(zhì)印跡法檢測Bcl-2、Bax和P53蛋白水平。結(jié)果 與正常對照組比較，醋酸鉛模型組細胞存活率降低（P＜0.05），細胞凋亡形態(tài)變化典型，細胞早期凋亡率增高（P＜0.05），細胞內(nèi)GSH含量降低（P＜0.01），P53蛋白水平升高（P＜0.01），Bax/Bcl-2比值升高（P＜0.01）；正常+PAS-Na 500 μmol·L-1組上述指標未見明顯變化。與醋酸鉛模型組比較，醋酸鉛+PAS-Na組細胞存活率增高（P＜0.05），細胞凋亡率和早期凋亡率均降低（P＜0.05），細胞內(nèi)GSH含量增高（P＜0.01），P53蛋白水平和Bax/Bcl-2比值降低（P＜0.05）。結(jié)論 PAS-Na對鉛致PC12細胞凋亡有一定的拮抗作用，其機制可能與PAS-Na抗脂質(zhì)過氧化損傷和降低Bax/Bcl-2比值有關(guān)。

鉛；對氨基水楊酸鈉；PC12細胞；細胞凋亡

鉛是一種常見的環(huán)境污染物，過量鉛暴露對神經(jīng)系統(tǒng)有直接的損害作用，引起神經(jīng)功能紊亂、出現(xiàn)學(xué)習(xí)和記憶能力降低等［1］。鉛主要選擇性地蓄積在脈絡(luò)叢和海馬，可對海馬神經(jīng)元等產(chǎn)生不良影響，如抑制神經(jīng)元增殖、分化及誘導(dǎo)凋亡等［2］。鉛可通過血腦屏障并在腦內(nèi)蓄積，可通過引起氧化應(yīng)激反應(yīng)直接或間接產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物引起細胞氧化損傷，誘導(dǎo)神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞發(fā)生凋亡［3-4］。此外，鉛可上調(diào)或下調(diào)某些基因的表達，誘導(dǎo)細胞凋亡［5］。對氨基水楊酸鈉（sodium para-aminosalicylic acid，PAS-Na）是一種含水楊酸基團的非類固醇類抗炎藥物，20世紀70年代以來，國內(nèi)外學(xué)者在用其治療錳中毒的動物實驗和臨床研究方面都取得較好的效果［6］。PAS-Na有相對分子質(zhì)量低、空間障礙少及能迅速接近作用部位等特點。體內(nèi)外研究均顯示，PAS-Na對錳引起的神經(jīng)毒性具有一定的拮抗作用［7-8］。本研究室研究發(fā)現(xiàn)，PAS-Na對鉛致海馬超微結(jié)構(gòu)損傷也有一定的拮抗作用［9］。但目前尚未見PAS-Na對體外染鉛致海馬神經(jīng)元凋亡的研究報道。因此，本研究選擇神經(jīng)元模式細胞大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤PC12細胞作為實驗對象，用醋酸鉛誘導(dǎo)PC12細胞損傷，探討PAS-Na是否對鉛致神經(jīng)元凋亡有保護作用，進一步闡明PAS-Na對鉛致神經(jīng)毒性的干預(yù)作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

醋酸鉛（天津博迪化工股份有限公司）；PASNa（哈藥集團制藥總廠）；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）和DMEM/高糖（美國HyClone公司）；0.25%胰蛋白酶EDTA混合液（美國Gibco公司）；100 kU·L-1青、鏈霉素混合液（北京索萊寶科技有限公司）；Hoechst33342和碘化丙啶雙染檢測試劑盒（南京KGA-212凱基公司）；AnnexinⅤFITC凋亡檢測試劑盒（美國BD公司）；BCA蛋白測定試劑盒（北京碧云天公司）；微量還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量測試盒（南京建成公司）；辣根過氧化物酶標記山羊抗大鼠IgG抗體和山羊抗兔IgG抗體、小鼠抗大鼠P53單克隆抗體（美國CST公司）；兔抗大鼠Bax多克隆抗體和兔抗大鼠Bcl-2多克隆抗體（美國ABclonal公司）；兔抗大鼠GAPDH單克隆抗體（英國Abcam公司）；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。PVDF膜，Millipore超純水器（德國密理博公司）；Cyto FLEX流式細胞儀（美國Beck?man公司）；Multiskan GO酶標儀，371型CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）；SW-CJ-2F超凈工作臺（蘇州安泰公司）；TiS倒置熒光顯微鏡（日本尼康公司）。

1.2 PC12細胞體外培養(yǎng)和實驗分組

PC12細胞于含10%FBS和1%青、鏈霉素混合液（100 kU·L-1）的DMEM/高糖培養(yǎng)基中，置37℃、5%CO2、飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)。處于對數(shù)生長期的PC12細胞隨機分為正常對照組、正常+ PAS-Na 500 μmol·L-1組、醋酸鉛模型組及醋酸鉛+PAS-Na 20，100和500 μmol·L-1組。正常對照組和正常+PAS-Na 500 μmol·L-1組PC12細胞給予正常培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后棄培養(yǎng)液，前者加入正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，后者加入PAS-Na（終濃度500 μmol·L-1）繼續(xù)培養(yǎng)24 h。醋酸鉛模型組及醋酸鉛+PAS-Na 20，100和500 μmol·L-1組先與醋酸鉛（終濃度10 μmol·L-1）共培養(yǎng)24 h后，棄培養(yǎng)液，再加入正常培養(yǎng)液或相應(yīng)濃度PAS-Na繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.3 MTT比色法測定細胞存活率

實驗步驟參照文獻［10］及說明書，用酶聯(lián)免疫檢測儀在492 nm波長處測定各孔吸光度（A492nm）值，以正常對照組PC12細胞存活率為100%計算各組細胞存活率。細胞存活率（%）=用藥組A492nm/正常對照組A492nm×100%。每組設(shè)5復(fù)孔，鋪板密度為每孔1×103～1×104個細胞。

1.4 Hoechst33342熒光染色法觀察細胞凋亡

Hoechst33342是一種可透過細胞膜進行DNA染色的細胞核染色試劑，它在嵌入雙鏈DNA后能釋放藍色熒光。采用熒光Hoechst33342和20%PI雙染檢測試劑盒檢測細胞凋亡，實驗步驟參考說明書，所用染色劑臨用時現(xiàn)配。染色后用熒光顯微鏡觀察，正常細胞為淺藍色，凋亡細胞為深藍色，壞死細胞為深紅色。每組分別選取3個視野，每個視野計數(shù)200個細胞，計算凋亡率，凋亡率（%）=視野凋亡細胞數(shù)/視野細胞計數(shù)×100%。

1.5 流式細胞術(shù)（flowcytometry，F(xiàn)CM）檢測細胞凋亡

采用AnnexinⅤFITC凋亡檢測試劑盒，按照說明書步驟進行操作。每組設(shè)3個平行樣品，在流式細胞儀上檢測各組早期凋亡率。

1.6 細胞內(nèi)GSH含量測定

將收集好的細胞用PBS清洗2遍后，低速離心，再加入0.1 mol·L-1等滲PBS緩沖液（pH 7.4）0.3 mL懸浮細胞，超聲破碎細胞后待測。BCA法測定細胞內(nèi)蛋白含量，按照試劑盒說明書測定GSH含量，每組3個平行樣品。

1.7 Western蛋白質(zhì)印跡法檢測凋亡相關(guān)蛋白表達水平

用細胞刮刀收集細胞，按6孔板每孔100 μL加入細胞裂解液，冰上裂解30 min后，4℃，16 000×g離心20 min，取上清，用BCA法測定蛋白濃度，調(diào)整各組蛋白濃度為5 g·L-1。取10 μL上述稀釋好的組織液，加入5×SDS加樣緩沖液，混勻，100℃水浴5 min，然后等電壓電泳，使用5%濃縮膠在80 V電壓下電泳30 min，再使用12%分離膠在120 V電壓下電泳100 min。電泳結(jié)束再以等電流200 mA轉(zhuǎn)膜90 min?？贵w稀釋濃度為P53（1∶1000），Bcl-2（1∶500），Bax（1∶500）和GAPDH（1∶3000），抗體用5%脫脂牛奶稀釋。將結(jié)合有目的蛋白的PVDF膜在5%脫脂牛奶中封閉2 h，以消除抗體的非特異性結(jié)合，之后在各蛋白單克隆抗體中孵育過夜（4℃）。孵育結(jié)束后用TBST洗膜5次，每次5 min。之后在室溫下加入各目的蛋白單克隆抗體相應(yīng)的HRP-IgG（1∶2000）孵育2 h，TBST洗膜3次，每次5 min，之后加入ECL發(fā)光劑于暗室中顯影。目標蛋白與GAPDH條帶積分吸光度值（integrated absorbance，IA）的比值表示蛋白相對表達量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 PAS-Na對鉛暴露PC12細胞存活率的影響

MTT法檢測結(jié)果顯示（圖1），與正常對照組比較，正常+PAS-Na 500 μmol·L-1組細胞存活率無顯著變化，醋酸鉛模型組PC12細胞存活率約降低25%（P＜0.05）。醋酸鉛+PAS-Na 100和500 μmol·L-1組PC12細胞存活率較醋酸鉛組顯著增高（P＜0.05）。

2.2 PAS-Na對鉛暴露PC12細胞凋亡的影響

Fig.1 Effect of sodium para-aminosalicylic acid（PASNa）on viability of PC12 cells exposed to lead acetate（Pb）detected by MTT assay.The PC12 cells to normal control and normal+PAS-Na 500 μmol·L-1groups were cultured in normal medium for 24 h，then continually cultured with normal medium and PAS-Na，respectively，for 24 h.The PC12 cells in Pb model and Pb+PAS-Na 20，100，500 μmol·L-1groups were cultured with Pb（10 μmol·L-1）for 24 h，then continually cultured with PAS-Na for another 24 h except Pb model group.，n=6.＊P＜0.05，compared with normal control group；#P＜0.05，com?pared with Pb model group.

Fig.2 Effect of PAS-Na on apoptosis of PC12 cells ex?posed in Pb detected by Hoechst33342 staining.See Fig.1 for the cell treatment.A：Hoechst33342 staining.The ar?rows show that apoptotic nuclei contain condensed or fragmented DNA；B：the quantitative results of A.，n=3.＊＊P＜0.01，com?pared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with Pb model group.

Hoechst33342熒光染色結(jié)果顯示（圖2A），正常對照組和正常+PAS-Na 500 μmol·L-1組PC12細胞核形態(tài)規(guī)則完整，核淡染為主；醋酸鉛模型組細胞核出現(xiàn)損傷變化，如皺縮、分裂和崩解，細胞核深染變亮。醋酸鉛+PAS-Na 20，100和500 μmol·L-1組細胞崩解、皺縮程度有所減輕。與正常對照組相比，正常+PAS-Na 500 μmol·L-1組細胞凋亡率無明顯變化，醋酸鉛模型組細胞凋亡率明顯增高（P＜0.05）；與醋酸鉛模型組比較，醋酸鉛+PAS-Na 100和500 μmol·L-1組細胞凋亡率明顯降低（P＜0.05）如圖2B所示。

流式細胞儀定量結(jié)果顯示（圖3），與正常對照組相比，正常+PAS-Na 500 μmol·L-1組PC12細胞凋亡率無明顯變化，醋酸鉛模型組早期凋亡率明顯增高（P＜0.05）；與醋酸鉛模型組比較，醋酸鉛+ PAS-Na 500 μmol·L-1組細胞早期凋亡率明顯降低（P＜0.01）。

Fig.3 Effect of PAS-Na on early apoptosis of PC12 cells exposured to Pb detected by flow cytometry. See Fig.1 for the cell treatment.A：Photograph from flow cy?tometry；B：the quantitative results of A.，n=3.＊P＜0.05，compared with normal control group；##P＜0.01，compared with Pb model group.

2.3 PAS-Na對鉛暴露PC12細胞內(nèi)GSH含量的影響

細胞內(nèi)GSH含量檢測結(jié)果表明（圖4），與正常對照組相比，正常+PAS-Na 500 μmol·L-1組GSH含量無明顯變化，醋酸鉛模型組細胞內(nèi)GSH含量明顯降低（P＜0.01）；與醋酸鉛模型組比較，醋酸鉛+ PAS-Na 20，100和500 μmol·L-1組細胞內(nèi)GSH含量明顯升高（P＜0.01）。

Fig.4 Effect of PAS-Na on intracellular glutathione（GSH）content of PC12 cells exposed to Pb.See Fig.1 for the cell treatment.，n=3-4.＊＊P＜0.01，compared with nor?mal control group；##P＜0.01，compared with Pb model group.

2.4 PAS-Na對鉛暴露PC12細胞內(nèi)P53，Bax和Bcl-2蛋白水平的影響

Fig.5 Effect of PAS-Na on P53，Bax and Bcl-2 protein expression of PC12 cells exposed to Pb detected by Western blotting.See Fig.1 for the cell treatment.B was the semi-quantitative result of A.IA：integrated absorbance.，n=3.＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with Pb model group.

Western蛋白印跡法實驗結(jié)果表明（圖5），與正常對照組相比，正常+PAS-Na 500 μmol·L-1組P53蛋白表達水平和Bax/Bcl-2比值無明顯變化，醋酸鉛模型組P53蛋白水平顯著升高（P＜0.05），Bax蛋白水平升高，Bcl-2蛋白水平下降，Bax/Bcl-2比值顯著升高（P＜0.01）；與醋酸鉛模型組比較，醋酸鉛+PAS-Na 20，100和500 μmol·L-1組P53蛋白水平和Bax/Bcl-2比值均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。

3 討論

細胞凋亡是由基因調(diào)控的細胞程序化死亡，在機體穩(wěn)態(tài)的維持、某些疾病的發(fā)生發(fā)展、神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育等方面中有重要意義［11］。在新生SD大鼠腦海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)中，用不同濃度醋酸鉛（0.1和1 μmol·L-1）可引起神經(jīng)元出芽延遲，突起長度縮短，細胞存活率下降，隨濃度增加和時間延長，毒性作用越加嚴重［12］。斷乳的Wistar大鼠ig給予醋酸鉛至60 d，電鏡可見該組海馬組織出現(xiàn)空泡，細胞質(zhì)溶解，染色質(zhì)凝聚成塊，突觸數(shù)量減少，提示鉛使海馬受損［13］。電鏡下可見鉛1 μmol·L-1暴露小鼠大腦神經(jīng)元退化、染色質(zhì)凝聚和核膜碎片主要集中在尾狀核、丘腦、大腦皮質(zhì)和扣帶回，提示鉛暴露可引起腦神經(jīng)細胞凋亡［12，14］。本研究結(jié)果表明，用醋酸鉛10 μmol·L-1對PC12細胞染毒24 h，細胞存活率為53%～60%；參考近3年的文獻［4，15-16］，醋酸鉛10 μmol·L-1可引起細胞凋亡，因而選擇醋酸鉛10 μmol·L-1進行細胞染毒。

神經(jīng)系統(tǒng)含有豐富的可被氧化的基質(zhì)，鉛可能通過減少抗氧化物質(zhì)和降低抗氧化酶類活性，增加活性氧自由基來介導(dǎo)細胞凋亡［4］。染鉛后脂質(zhì)過氧化作用增強，與染鉛量呈正相關(guān)；以神經(jīng)元抗氧化能力標志超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性下降，膜乙酰膽堿酯酶活性明顯下降，且與染鉛量呈負相關(guān)；推測鉛可能通過對神經(jīng)細胞的過氧化損傷而發(fā)揮其神經(jīng)毒性作用［17］。GSH是機體內(nèi)最重要的抗氧化物之一，具有清除自由基、解毒、維持紅細胞膜完整性、細胞正常生長發(fā)育及細胞免疫等多種功能。GSH含量是衡量機體抗氧化能力的重要因素之一。GSH富含巰基，在鉛暴露影響下可快速與進入機體的鉛離子結(jié)合而降低其毒性［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，醋酸鉛模型組細胞內(nèi)GSH含量低于正常對照組，提示鉛暴露降低細胞抗氧化能力。而PAS-Na干預(yù)可使染鉛細胞內(nèi)GSH含量明顯升高，說明PAS-Na對鉛引起的抗氧化能力降低有一定的拮抗作用。

鉛可以引起機體內(nèi)一些凋亡相關(guān)蛋白如P53、Bcl-2和Bax蛋白表達的改變［5］。Bcl-2家族是調(diào)節(jié)凋亡的關(guān)鍵元件，其主要成員Bcl-2主要通過抑制胱天蛋白酶而使細胞存活。Bcl-2和Bax是一對正負凋亡調(diào)節(jié)因子，Bcl-2可與Bax蛋白形成異源二聚體，從而使Bcl-2蛋白失活，降低Bcl-2對凋亡的抑制作用，Bax/Bcl-2比值降低，易引起細胞凋亡［16］。P53蛋白是重要的細胞周期和細胞凋亡調(diào)控因子。Bax的啟動子中有P53的結(jié)合位點，所以P53能促進Bax的表達，從而導(dǎo)致Bax/Bcl-2比值升高而使細胞凋亡［18］。本研究結(jié)果表明，當PC12細胞暴露于醋酸鉛10 μmol·L-124 h后，P53蛋白顯著升高，Bax水平顯著上升，Bcl-2水平下降，Bax/Bcl-2比值明顯上升。提示醋酸鉛可能通過影響B(tài)ax和Bcl-2水平而誘導(dǎo)線粒體凋亡因子的釋放和胱天蛋白酶的級聯(lián)激活，以至發(fā)生凋亡。經(jīng)PAS-Na 20，100和500 μmol·L-1干預(yù)24 h后，Bax/Bcl-2比值均較醋酸鉛模型組低，且PAS-Na 500 μmol·L-1組P53蛋白水平也降低，表明PAS-Na可通過下調(diào)Bax和P53蛋白表達水平，上調(diào)Bcl-2水平，降低Bax/Bcl-2比值抑制細胞凋亡。

綜上，PAS-Na對鉛誘導(dǎo)的PC12細胞凋亡有一定的保護作用，其作用機制可能與PAS-Na抗脂質(zhì)過氧化和降低Bax/Bcl-2比值有關(guān)。

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Effect of sodium para-aminosalicylic acid on apoptosis of PC12 cells induced by lead-exposure

HE Sheng-nan,QIN Wen-xia,LU Yan-hong,LI Kang,LUO Yi-ni,YUAN Zong-xiang,JIANG Xiu-li, MO Yu-huan,LI Wen-jie，JIANG Yue-ming
(Department of Health Toxicology,Guangxi Medical University,Nanning 530021,China)

OBJECTIVE To explore the effects of sodium para-aminosalicylate acid(PAS-Na)on apoptosis of PC12 cells induced by lead-exposure.METHODS PC12 cells were cultured to their logarithmic growth phase before cells in normal control group and normal+PAS-Na 500 μmol·L-1group were with normal medium for 24 h.The former were cultured with the normal medium,and the latter with 500 μmol·L-1PAS-Na medium for another 24 h.Lead acetate model group and lead acetate+PAS-Na 20,100, 500 μmol·L-1intervention groups were incubated with medium containing lead acetate(the final concen?tration of 10 μmol·L-1)for 24 h,and were added with a corresponding concentration of PAS-Na for another 24 h after the culture solution was removed.Subsequently,MTT assay was used to observe the viability of PC12 cells,whereas intracellular glutathione(GSH)content was estimated by assay kit.Apop?tosis of PC12 was detected by Hoechst33342 fluorescence staining and AnnexinⅤ/PI double staining flow cytometry.Western blotting was performed to detect levels of Bcl-2,Bax and P53 proteins.RESULTS Compared with the normal control group,the survival rate of cells and the content of intracellular GSH decreased in Pb model group(P＜0.05).Typical morphological characteristics were found by Hoch?est33342 staining,and apoptosis rate increased(P＜0.05).Western blotting showed that the level of Bcl-2 protein decreased,while levels of Bax and p53 protein increased,and the Bax/Bcl-2 ratio increased signifi?cantly in lead acetate group(P＜0.05).In normal+PAS-Na 500 μmol·L-1group,the above indexes did not change significantly.Compared with the lead acetate group,the survival rate of PC12 cells and intracel?lular GSH content were increased in lead acetate+PAS-Na intervention group(P＜0.05),while the Bax/ Bcl-2 ratio and level of p53 protein were decreased(P＜0.05).CONCLUSION Intervention with PAS-Na can protect PC12 cells from apoptosis induced by lead exposure,which may be related to anti-lipid peroxidation damage and decrease in the Bax/Bcl-2 ratio.

lead;sodium para-aminosalicylic acid;PC12 cells;apoptosis

JIANG Yue-ming,E-mail:790965788@qq.com

R995

A

1000-3002-（2017）02-0159-06

10.3867/j.issn.1000-3002.2017.02.06

Foundation item:The project supported by National Basic Research Program of China(973 Program)(2012CB525001)

2016-08-02 接受日期：2017-01-18）

（本文編輯：沈海南 齊春會）

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃（973計劃）（2012-CB525001）

何勝男，碩士研究生，主要從事神經(jīng)毒理學(xué)研究；姜岳明，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事神經(jīng)毒理學(xué)研究。

姜岳明，E-mail:790965788@qq.com