姜黃素對(duì)Aβ1-42誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷和線粒體途徑細(xì)胞凋亡的抑制作用

路書彥，楊 麗，戴雪伶，?！　∑?，姜招峰，黃漢昌

（北京聯(lián)合大學(xué)1.功能食品科學(xué)技術(shù)研究院，2.生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100191）

·論著·

姜黃素對(duì)Aβ1-42誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷和線粒體途徑細(xì)胞凋亡的抑制作用

路書彥1，2，楊 麗1，2，戴雪伶1，2，常平1，2，姜招峰1，2，黃漢昌1，2

（北京聯(lián)合大學(xué)1.功能食品科學(xué)技術(shù)研究院，2.生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100191）

目的 探討姜黃素對(duì)Aβ1-42誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷和凋亡的抑制作用。方法 采用體外培養(yǎng)的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞，分為溶劑對(duì)照組、Aβ1-4210 μmol·L-1損傷組、Aβ1-4210 μmol·L-1+姜黃素1，5和10 μmol·L-1保護(hù)組及姜黃素10 μmol·L-1對(duì)照組；噻唑藍(lán)（MTT）法測(cè)定細(xì)胞存活率，酶活性法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶（LDH）的含量以考察細(xì)胞損傷程度；AnnexinⅤ-FITC/PI染色法測(cè)定細(xì)胞凋亡；JC-1染色法檢測(cè)線粒體膜電位變化；比色法測(cè)定胱天蛋白酶9和胱天蛋白酶3的活性；Western蛋白印跡法檢測(cè)胱天蛋白酶3表達(dá)。結(jié)果與溶劑對(duì)照組比，Aβ1-4210 μmol·L-1損傷組細(xì)胞存活率顯著降低（P＜0.01）。與Aβ1-4210 μmol·L-1損傷組比較，姜黃素5和10 μmol·L-1緩解了Aβ1-42誘導(dǎo)的細(xì)胞存活率下降（P＜0.05），降低了Aβ1-42誘導(dǎo)的乳酸脫氫酶釋放水平（P＜0.01）和細(xì)胞早期及晚期凋亡率（P＜0.01）。姜黃素抑制了Aβ1-42誘導(dǎo)的細(xì)胞線粒體膜電位去極化作用（P＜0.01）；姜黃素1～10 μmol·L-1抑制了Aβ1-42誘導(dǎo)的胱天蛋白酶9及胱天蛋白酶3級(jí)聯(lián)激活作用，且呈濃度依賴性（r=0.990，P＜0.01；r=0.996，P＜0.01）。姜黃素10 μmol·L-1對(duì)照組以上指標(biāo)與溶劑對(duì)照組無明顯差異。結(jié)論 姜黃素可能通過升高線粒體膜電位、降低胱天蛋白酶活性抑制Aβ1-42誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷和線粒體途徑細(xì)胞凋亡。

阿爾茨海默病；姜黃素；β-淀粉樣蛋白；線粒體膜電位；細(xì)胞凋亡

阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）是一種隨人口老齡化加劇而呈現(xiàn)高發(fā)態(tài)勢(shì)的神經(jīng)退行性疾病。AD典型的病理特征主要表現(xiàn)為胞外淀粉樣蛋白沉積形成老年斑、胞內(nèi)Tau蛋白高度磷酸化形成神經(jīng)原纖維纏結(jié)以及神經(jīng)元大量凋亡［1-3］。β-淀粉樣蛋白（β-amyloid protein，Aβ）是老年斑中的主要成分，Aβ是由淀粉樣前體蛋白（amyloid-β precursor protein，APP）經(jīng)β和γ-分泌酶水解的含39～42個(gè)氨基酸殘基的多肽。Aβ主要以Aβ1-40和Aβ1-42兩種形式存在，其中Aβ1-42更傾向于形成纖維狀聚集物，被認(rèn)為具有更高的神經(jīng)毒性［4］。

“Aβ級(jí)聯(lián)假說”是目前最為廣泛研究的AD發(fā)病機(jī)制學(xué)說，該假說認(rèn)為Aβ是引發(fā)AD的始發(fā)因素［5］。研究表明，Aβ寡聚體可以誘發(fā)Tau蛋白高度磷酸化，神經(jīng)元突觸丟失，以及神經(jīng)元凋亡［6-7］。但Aβ導(dǎo)致神經(jīng)元大量凋亡的機(jī)制還有待深入研究，有效預(yù)防或治療AD的藥物還有待開發(fā)。姜黃素是一種多酚類化合物，被廣泛地用作天然色素及食品添加劑。姜黃素具有較好的生理活性作用，其毒性低，化學(xué)穩(wěn)定性好，具有抗炎、降血脂、抗腫瘤和抑制血管增生等藥理作用［8］。體外實(shí)驗(yàn)研究表明，姜黃素具有很強(qiáng)的自由基清除能力［9］。另外，姜黃素可增強(qiáng)核轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2（NF-E2-re?lated factor 2，Nrf2）/抗氧化物反應(yīng)元件（antioxi?dant response element，ARE）細(xì)胞內(nèi)源性抗氧化通路活性的作用［10］。我們前期從細(xì)胞能量代謝和促凋亡因子釋放的角度研究了姜黃素抑制Aβ1-40誘導(dǎo)的細(xì)胞線粒體損傷的作用［11-12］。本研究以Aβ1-42誘導(dǎo)的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞為模型，研究姜黃素對(duì)細(xì)胞損傷及凋亡的抑制作用。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞、試劑和主要儀器

SH-SY5Y細(xì)胞（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院）。姜黃素（純度95%，高效液相色譜法鑒定）臨用時(shí)用二甲亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶解成10 mmol·L-1儲(chǔ)備液。Aβ1-42〔吉爾生化（上海）有限公司〕臨用時(shí)將2.0 mg凍干粉用一定體積的六氟異丙醇溶解，揮干成膜，加入20 μl DMSO溶解后，取420 μL再加入1 mmol·L-1無菌HCL溶液，于37℃孵育48 h。PRMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清（美國(guó)Gibco公司），鏈霉素-青霉素和四甲基偶氮唑鹽〔（3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT）〕染料（Invitrogen公司），細(xì)胞裂解液（含蛋白酶抑制劑）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）含量檢測(cè)試劑盒、胱天蛋白酶3和胱天蛋白酶9活性檢測(cè)試劑盒（碧云天公司），Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（同仁化學(xué)研究所），胱天蛋白酶3和HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體（美國(guó)Cell Signal Technology公司），L-LDH（9.3 g·L-1，北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司）；其余試劑為分析純。Imag?ine Quant LAS凝膠成像分析儀（美國(guó)通用電氣醫(yī)療公司），Varioskan Flash多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)賽默飛世爾科技公司），F(xiàn)ACS Calibur流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司），低溫高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）。

1.2 SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理

SH-SY5Y細(xì)胞復(fù)蘇后置于37℃含5%CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)（PRMI 1640培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%鏈霉素-青霉素溶液），每3～4 d傳代1次，加藥時(shí)換成不含血清的培養(yǎng)液。

藥物處理及分組：溶劑對(duì)照組（加含0.1% DMSO的培養(yǎng)液）；Aβ1-421，5，10和20 μmol·L-1損傷組，作用24 h；姜黃素保護(hù)組：先加入姜黃素1，5和10 μmol·L-1，作用4 h后再加Aβ1-4210 μmol·L-1的培養(yǎng)液繼續(xù)作用至24 h；姜黃素對(duì)照組：加姜黃素10 μmol·L-1，作用24 h。

1.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活

按每孔1×104個(gè)細(xì)胞接種96孔板，按1.2分組加藥處理24 h后，加入MTT溶液（終濃度為0.5 g·L-1），于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h。4℃，800×g，離心10 min。棄上清，加150 μL DMSO，用移液器輕輕吹打，充分溶解結(jié)晶。在酶標(biāo)儀上選定波長(zhǎng)570 nm（參比波長(zhǎng)630 nm），測(cè)定吸光度值（A）。相對(duì)存活率（%）=實(shí)驗(yàn)組（A570nm-A630nm）/溶劑對(duì)照組（A570nm-A630nm）×100%。Aβ1-42實(shí)驗(yàn)濃度采用Aβ1-42損傷后活細(xì)胞數(shù)為溶劑對(duì)照組60%～80%的濃度。

1.4培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶含量檢測(cè)

按每孔1×104個(gè)細(xì)胞接種96孔板中，按1.2分組加藥處理24 h后，測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH含量。取細(xì)胞培養(yǎng)液120 μL，加入60 μL LDH檢測(cè)液，室溫避光孵育30 min，490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定生成甲瓚的A值。在相同檢測(cè)條件下，測(cè)定LDH標(biāo)準(zhǔn)品0，10，25，40，100，200和400 μg·L-1偶聯(lián)催化底物生成甲瓚的A值，通過標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算檢測(cè)樣品中LDH的含量。

1.5 AnnexinⅤ-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡

按每孔5×105個(gè)細(xì)胞接種6孔板，按1.2分組加藥處理12 h后，胰酶消化細(xì)胞。按照試劑盒操作說明向細(xì)胞懸浮液中加入AnnexinⅤ-FITC標(biāo)記抗體和PI染料，室溫（20～25℃）避光孵育20 min后進(jìn)行流式細(xì)胞熒光計(jì)數(shù)20 000個(gè)細(xì)胞。計(jì)算不同凋亡階段的細(xì)胞比例。早期細(xì)胞凋亡率（%）=早期凋亡細(xì)胞個(gè)數(shù)/計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)×100%，晚期細(xì)胞凋亡率（%）=晚期凋亡細(xì)胞個(gè)數(shù)/計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)×100%

1.6 JC-1探針和Hoechst33342細(xì)胞核染料法檢測(cè)線粒體膜電位

按每孔1×104個(gè)細(xì)胞的接種96孔板，按1.2分組加藥處理12 h后，加入JC-1探針10 μmol·L-1和Hoechst33342細(xì)胞核染料孵育30 min，PBS洗滌3次，在熒光顯微鏡下觀察JC-1單體在激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)530 nm（綠色）；JC-1聚合物在激發(fā)波長(zhǎng)525 nm，發(fā)射波長(zhǎng)590 nm（紅色）；細(xì)胞核在激發(fā)波長(zhǎng)360 nm，發(fā)射波長(zhǎng)460 nm的熒光圖像。采用微孔板酶標(biāo)儀記錄相應(yīng)熒光通道的發(fā)射熒光強(qiáng)度值（fluorescence intensity，F(xiàn)I）。計(jì)算FI綠/ FI紅比值表示膜電位去極化水平。

1.7胱天蛋白酶9和胱天蛋白酶3酶活性測(cè)定

按每孔5×105個(gè)細(xì)胞接種6孔板，按1.2分組加藥處理24 h后，提取細(xì)胞總蛋白，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，在37℃下分別用胱天蛋白酶3和胱天蛋白酶9的底物作用細(xì)胞蛋白提取物，底物經(jīng)酶切后生成黃色產(chǎn)物，用酶標(biāo)儀在405 nm處測(cè)定A值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別計(jì)算樣品中酶活性，以U·g-1蛋白表示。

1.8 Western蛋白印跡法檢測(cè)胱天蛋白酶3表達(dá)水平

按每孔5×105個(gè)細(xì)胞的密度培養(yǎng)于6孔板中，按1.2分組加藥處理24 h后，收集細(xì)胞，用含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液冰上裂解30 min，4℃12 000×g離心10 min，收集上清，二喹啉甲酸（bicinchonininc acid，BCA）法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，1∶4比例加上樣緩沖液，100℃煮沸樣品10 min。SDS-PAGE分離不同相對(duì)分子質(zhì)量蛋白質(zhì)，然后電轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的PBST封閉1 h，4℃一抗（1∶2000稀釋）孵育過夜，用PBST漂洗2次，PBS漂洗1次，二抗（1∶5000稀釋）孵育2 h，同上漂洗數(shù)次后滴加1 mL ECL發(fā)光液，凝膠成像分析儀記錄蛋白印跡發(fā)光圖像，Quantity One軟件對(duì)蛋白印跡進(jìn)行積分吸光度（integrated absorbance，IA）分析。目標(biāo)蛋白相對(duì)表達(dá)水平用IA目標(biāo)蛋白／IAβ肌動(dòng)蛋白比值表示。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1姜黃素對(duì)Aβ1-42誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響

存活率檢測(cè)結(jié)果顯示，與溶劑對(duì)照組相比，姜黃素1和5 μmol·L-1組細(xì)胞存活率升高（P＜0.05）（圖1A），姜黃素10 μmol·L-1細(xì)胞存活率與溶劑對(duì)照組無明顯差異。Aβ1-425，10和20 μmol·L-1損傷組細(xì)胞存活率降低，呈濃度依賴性下降（r=0.920，P＜0.01），Aβ1-4210 μmol·L-1時(shí)細(xì)胞存活率為溶劑對(duì)照胞組的65.5%，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選取Aβ1-4210 μmol·L-1作為損傷濃度。

與Aβ1-4210 μmol·L-1損傷組相比，姜黃素5和10 μmol·L-1保護(hù)組細(xì)胞存活率升高（P＜0.05，P＜0.05）。姜黃素5和10 μmol·L-1均能緩解Aβ1-4210 μmol·L-1導(dǎo)致的細(xì)胞存活率降低作用（圖1C）；提示一定濃度范圍內(nèi)姜黃素緩解了Aβ1-4210 μmol·L-1引起的細(xì)胞增殖抑制或者細(xì)胞死亡。

2.2姜黃素對(duì)Aβ1-42誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞LDH含量的影響

與溶劑對(duì)照組相比，Aβ1-4210 μmol·L-1組細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH的酶含量升高（P＜0.01），提示Aβ1-4210 μmol·L-1作用24 h，導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性增大，導(dǎo)致LDH由胞漿向細(xì)胞外液的釋放；與Aβ1-4210 μmol·L-1組相比較，姜黃素5和10 μmol·L-1保護(hù)組細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH含量降低（P＜0.01），而姜黃素10 μmol·L-1對(duì)照組與溶劑對(duì)照組無明顯差異，提示姜黃素對(duì)10 μmol·L-1Aβ1-42誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷有一定的抑制作用。

2.3姜黃素對(duì)Aβ1-42誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡作用的影響

Fig.1 Effect of curcumin on cell viability of SH-SY5Y cells damaged by Aβ1-42by MTT.A：cells were treated with curcumin 1，5，10 and 20 μmol·L-1for 24 h；B：cells were treated with Aβ1-421，5，10 and 20 μmol·L-1for 24 h；C：cells were pre-treated with curcumin 1，5，and 10 μmol·L-1for 4 h and then treated with Aβ1-4210 μmol·L-1for 24 h.，n=6.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with vehicle control group；#P＜0.05，compared with Aβ1-4210 μmol·L-1group.

Fig.2 Effect of curcumin on lactate dehydrogenase（LDH）in culture of SH-SY5Y cells damaged by Aβ1-42.See Fig.1C for cell treatment.，n=5.＊＊P＜0.01 compared with vehicle control group；##P＜0.01，compared with Aβ1-4210 μmol·L-1group.

細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（圖3），與溶劑對(duì)照組相比，Aβ1-4210 μmol·L-1損傷組細(xì)胞早期和晚期凋亡率均升高（P＜0.01）；與Aβ1-4210 μmol·L-1損傷組相比，姜黃素5和10 μmol·L-1保護(hù)組細(xì)胞早期和晚期凋亡率降低（P＜0.01），而姜黃素10 μmol·L-1對(duì)照組與溶劑對(duì)照組無明顯差異，提示姜黃素5和10 μmol·L-1降低了Aβ1-4210 μmol·L-1誘導(dǎo)的胞凋亡水平。

Fig.3 Effect of curcumin on apoptosis of SH-SY5Y cells damaged by Aβ1-42by flow cytometry.See Fig.1Cfor cell treatment.B and C was early and late apoptosis rate，re?spectively.，n=5.＊＊P＜0.01 compared with vehicle control group；##P＜0.01，compared with Aβ1-4210 μmol·L-1group.

2.4姜黃素對(duì)Aβ1-42誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞線粒體膜電位的影響

線粒體膜電位去極化結(jié)果顯示（圖4），與溶劑對(duì)照組相比，Aβ1-42損傷組中細(xì)胞綠色/紅色FI比值升高（P＜0.01），提示Aβ1-4210 μmol·L-1處理細(xì)胞12 h后線粒體膜電位發(fā)生了去極化。與Aβ1-4210 μmol·L-1損傷組相比，姜黃素10 μmol·L-1保護(hù)組中細(xì)胞綠色/紅色FI比值下降（P＜0.01），而姜黃素10 μmol·L-1對(duì)照組與溶劑對(duì)照組無明顯差異，提示姜黃素保護(hù)細(xì)胞后減緩了Aβ1-42誘導(dǎo)的線粒體膜電位去極化作用。

Fig.4 Effect of curcumin on depolarization of mito?chondrial membrane potential（MMP）of SH-SY5Y cells damaged by Aβ1-42.A：cells were pre-treated without or with curcumin 1，5，and 10 μmol·L-1for 4 h and then treated with Aβ1-4210 μmol·L-1for 12 h.B：relative fluorescence intensity ratio of green and red fluorescence.Blue，green and red fluorescences indicate the Hoechst33342-stained nuclei，the monomer JC-1 and the aggregate JC-1，respectively.FI：fluorescence intensity.，n=5.＊＊P＜0.01，compared with vehicle control group；##P＜0.01，compared with Aβ1-4210 μmol·L-1group.

2.5姜黃素對(duì)Aβ1-42誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞胱天蛋白酶激活作用的影響

圖5結(jié)果顯示，與溶劑對(duì)照組相比，Aβ1-4210 μmol·L-1損傷組胱天蛋白酶9和胱天蛋白酶3酶活性均升高（P＜0.01）；與Aβ1-4210 μmol·L-1損傷組相比，姜黃素1，5和10 μmol·L-1保護(hù)組細(xì)胞2種酶活性均降低（P＜0.01），姜黃素1，5和10μmol·L-1保護(hù)細(xì)胞后減緩了Aβ1-4210 μmol·L-1誘導(dǎo)胱天蛋白級(jí)聯(lián)激活作用，而姜黃素10 μmol·L-1對(duì)照組與溶劑對(duì)照組無明顯差異。

2.6姜黃素對(duì)Aβ1-42誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞胱天蛋白酶3表達(dá)水平的影響

Western蛋白印跡結(jié)果顯示（圖6），與溶劑對(duì)照組相比，Aβ1-4210 μmol·L-1損傷組細(xì)胞中活化的胱天蛋白酶3（15～17 ku）表達(dá)升高（P＜0.01）；與Aβ1-4210 μmol·L-1損傷組相比，姜黃素5和10 μmol·L-1保護(hù)組中活化的胱天蛋白酶3的表達(dá)均降低（P＜0.01），而姜黃素10 μmol·L-1對(duì)照組與溶劑對(duì)照組無明顯差異。以上結(jié)果提示，姜黃素減緩了Aβ1-4210 μmol·L-1誘導(dǎo)的細(xì)胞線粒體損傷而導(dǎo)致的胱天蛋白酶級(jí)聯(lián)促凋亡作用。

Fig.5 Effect of curcumin on enzymatic activity of cas?pases 9 and caspases 3 of SH-SY5Y cells damaged by Aβ1-42.See Fig.1C for cell treatment.，n=5.＊＊P＜0.01，compared with vehicle control group；##P＜0.01，compared with Aβ1-4210 μmol·L-1group.

Fig.6 Effect of curcumin on protein expression of caspase 3 in SH-SY5Y cells damaged by Aβ1-42.See Fig.1 for cell treatment.IA：integreted absorbance.，n=5.＊＊P＜0.01，compared with vehicle control group；##P＜0.01，compared with Aβ1-4210 μmol·L-1group.

3　討論

本研究結(jié)果表明，Aβ1-42誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞線粒體膜電位降低和胱天蛋白酶9、胱天蛋白酶3的活性上升，Aβ1-42導(dǎo)致了細(xì)胞早期凋亡、晚期凋亡和細(xì)胞損傷作用水平的增加。線粒體是細(xì)胞通過三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化生成ATP的主要場(chǎng)所，線粒體的穩(wěn)態(tài)失衡會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡發(fā)生。研究表明，Aβ1-42刺激小鼠胚胎皮質(zhì)神經(jīng)前體細(xì)胞后導(dǎo)致線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mitochondrial permeability tran?sition pores，mPTP）的開放及線粒體內(nèi)過氧化物的釋放，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞活性氧水平的升高、線粒體膜電位的降低及細(xì)胞色素c的釋放。抑制mPTP的開放能改善Aβ1-42誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷作用［13］。因此，線粒體凋亡途徑可能與Aβ1-42造成的細(xì)胞凋亡和損傷密切相關(guān)。

但外在添加的Aβ1-42誘導(dǎo)細(xì)胞線粒體損傷的途徑目前有待進(jìn)一步研究。一方面，Aβ1-42可能與細(xì)胞膜表面的受體結(jié)合，誘導(dǎo)細(xì)胞級(jí)聯(lián)信號(hào)傳導(dǎo)作用，最終導(dǎo)致線粒體損傷。另一方面，Aβ被認(rèn)為可能在細(xì)胞膜上聚集形成Ca2+通透性的離子通道［14］，誘導(dǎo)胞內(nèi)Ca2+增加。我們以前的實(shí)驗(yàn)也表明，Aβ處理細(xì)胞后，導(dǎo)致SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的升高［12］，胞內(nèi)升高的Ca2+最終導(dǎo)致線粒體的損傷。另外，我們猜測(cè)，細(xì)胞內(nèi)源性分泌的Aβ可能對(duì)細(xì)胞凋亡也起到促進(jìn)作用；Aβ存在細(xì)胞內(nèi)分泌的途徑［15］，培養(yǎng)液中添加的Aβ可能會(huì)擾亂細(xì)胞內(nèi)源性的Aβ分泌穩(wěn)態(tài)平衡，導(dǎo)致細(xì)胞傾向胞內(nèi)分泌Aβ，引起胞內(nèi)Aβ含量升高，從而引發(fā)線粒體損傷。

本研究結(jié)果表明，姜黃素削弱了Aβ1-42誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷和細(xì)胞早期和晚期凋亡作用，抑制了線粒體膜電位去極化及胱天蛋白酶9和胱天蛋白酶3的激活作用，這可能與姜黃素抑制Aβ1-42誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用密切相關(guān)；姜黃素的抗氧化活性可能對(duì)細(xì)胞的氧化損傷和凋亡起到重要的抑制作用。體內(nèi)研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，姜黃素能通過血腦屏障并與Aβ斑塊相結(jié)合，且能抑制Aβ聚集，破壞Aβ多聚體的形成［16-17］，分子結(jié)構(gòu)中含有的酚羥基賦予姜黃素很強(qiáng)的抗氧化活性［18］。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也表明，姜黃素對(duì)L-谷氨酸造模的AD模型小鼠腦組織具有抗氧化損傷的保護(hù)作用［19］。另外，我們的前期實(shí)驗(yàn)表明，姜黃素還具有增強(qiáng)細(xì)胞自身的Nrf2/ARE抗氧化通路活性的作用［9］。

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Inhibitory effect of curcumin on Aβ1-42-induced cell damage and mitochondrial pathway apoptosis

LU Shu-yan1,2,YANG Li1,2,DAI Xue-ling1,2,CHANG Ping1,2,JIANG Zhao-feng1,2, HUANG Han-chang1,2
(1.Research Institute for Science and Technology of Functional Foods,2.Beijing Key Laboratory of Bioactive Substances and Functional Food,Beijing Union University,Beijing 100191,China)

OBJECTIVE To investigate the protective effect of curcumin on Aβ1-42damaged cells. METHODS SH-SY5Y cells were cultured with Aβ1-4210 μmol·L-1in the absence or presence of curcumin 1,5 or 10 μmol·L-1.Cell viability was assayed by MTT.Cell membrane damage was detected by the concentration of lactate dehydrogenase(LDH)in culture medium.Cell apoptosis was measured by flow cytometry with AnnexinⅤ-FITC/PI staining.Mitochondrial membrane potential was characterized by fluorescence of JC-1 dye.Enzymatic activity of caspases-9 and-3 was measured by colorimetric assay. Protein expression of caspase-3 was detected by Western blotting.RESULTS Compared with vehicle control,the cell viability,concentration of LDH and both early and late apoptosis in Aβ1-4210 μmol·L-1damaged group were decreased(P＜0.01).However,the cell viability,release of LDH and both early and late apoptosis in curcumin group were promoted compared with that in Aβ1-4210 μmol·L-1damaged group.Curcumin inhibited Aβ1-42-induced depolarization of mitochondrial membrane potential(P＜0.01), and attenuated Aβ1-42-induced activation of both caspases9 and caspases3 in a concentration-dependent manner,respectively(r=0.990,P＜0.01;r=0.996,P＜0.01).There were no significant differences in the above detected indexes between curcumin 10 μmol·L-1group and vehicle control group.CONCLUSION Curcumin inhibits Aβ1-42-induced cell damage and apoptosis by promoting mitochondrial membrane potential and depressing the activation of caspases.

Alzheimer disease;curcumin;β amyloid protein;mitochondrial membrane potential; apoptosis

HUANG Han-chang,E-mail:hanchang@buu.edu.cn

R285

A

1000-3002-（2017）02-0138-07

10.3867/j.issn.1000-3002.2017.02.03

Foundation item:The project supported by National Natural Science Foundation of China(31471587);and Scientific Research Common Program of Beijing Municipal Commission of Education(SQKM201411417003)

2016-01-19接受日期：2016-10-19）

（本文編輯：賀云霞）

國(guó)家自然科學(xué)基金（31471587）；北京市教委科技計(jì)劃面上發(fā)展項(xiàng)目（SQKM201411417003）

路書彥，碩士研究生，主要從事食品科學(xué)研究；黃漢昌，博士，副教授，主要從事阿爾茨海默病發(fā)病機(jī)制及其治療藥物篩選研究

黃漢昌，E-mail：hanchang@buu.edu.cn