滴滴涕對(duì)人大腸癌DLD1細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響

董寧寧，宋 莉，李卓玉，肖 虹

（1.山西大學(xué)生物技術(shù)研究所化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西太原 030006；2.山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院，山西太原 030006）

滴滴涕對(duì)人大腸癌DLD1細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響

董寧寧1，宋 莉1，李卓玉1，肖 虹2

（1.山西大學(xué)生物技術(shù)研究所化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西太原 030006；2.山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院，山西太原 030006）

目的探究滴滴涕（DDT）對(duì)人結(jié)直腸腺癌上皮細(xì)胞（DLD1）上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響及機(jī)制。方法DLD1細(xì)胞用DDT 0.01，0.1，1.0，10.0和100.0 nmol·L-1處理48 h后，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)E-鈣黏著蛋白、N-鈣黏著蛋白、波形蛋白和鋅指轉(zhuǎn)錄因子Snail1的mRNA表達(dá)。Western蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）信號(hào)通路主要蛋白STAT3和p-STAT3的蛋白水平。用STAT3抑制劑WP1066（5 μmol·L-1）處理，通過(guò)Western印跡法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)其對(duì)DDT誘導(dǎo)的STAT3/Snail1信號(hào)通路中p-STAT3、STAT3的蛋白水平和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化關(guān)鍵因子E-鈣黏著蛋白、N-鈣黏著蛋白、波形蛋白和鋅指轉(zhuǎn)錄因子Snail1的mRNA水平的影響。結(jié)果 與正常對(duì)照組相比，DLD1細(xì)胞在DDT處理48 h后，細(xì)胞形態(tài)由卵圓形逐漸變?yōu)殚L(zhǎng)梭形，E-鈣黏著蛋白mRNA相對(duì)表達(dá)顯著降低（P＜0.01），為正常對(duì)照組的（42.4±2.8）%。N-鈣黏著蛋白和波形蛋白mRNA相對(duì)表達(dá)顯著提高（P＜0.01），為正常對(duì)照組的1.91±0.1倍和（1.5±0.2）倍。STAT3信號(hào)通路蛋白STAT3和p-STAT3蛋白表達(dá)均升高（P＜0.01），為正常對(duì)照組的2.1和1.8倍。鋅指轉(zhuǎn)錄因子Snail1的mRNA相對(duì)表達(dá)顯著升高（P＜0.01），是正常對(duì)照組的（1.5±0.1）倍。STAT3抑制劑WP1066 5 μmol·L-1處理后，鋅指轉(zhuǎn)錄因子Snail1 mRNA的表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.01），為DDT 1.0 nmol·L-1處理組的（56.3±0.9）%，同時(shí)抑制DDT誘導(dǎo)的E-鈣黏著蛋白mRNA表達(dá)升高（P＜0.01），為DDT 1.0 nmol·L-1處理組的2.5±0.1倍，N-鈣黏著蛋白和波形蛋白mRNA表達(dá)降低（P＜0.01），分別為DDT 1.0 nmol·L-1處理組的（50.2±2.9）%和（61.6±6.1）%。結(jié)論 DDT可能通過(guò)STAT3/Snail1信號(hào)通路改變上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化子E-鈣黏著蛋白、N-鈣黏著蛋白和波形蛋白的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)大腸癌細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。

滴滴涕；大腸癌；上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化；信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3

滴滴涕（clofenotane，p，p′dichlorodiphenyltri?chloroethane，DDT）是首個(gè)被廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)及衛(wèi)生領(lǐng)域的合成有機(jī)氯農(nóng)藥（organochlorine pesti?cide，OCP）。DDT曾經(jīng)在20世紀(jì)為防治農(nóng)業(yè)病蟲害而被大量廣泛使用。隨著人們逐漸深入認(rèn)識(shí)到DDT的危害后，2001年，瑞典最先禁止在農(nóng)業(yè)上使用DDT，隨后世界各國(guó)陸續(xù)禁止了DDT的生產(chǎn)和使用。DDT具有難降解性、親脂性和半揮發(fā)性，是一種持久性有機(jī)污染物（persistent organic pollutant，POP）［1］。由于DDT曾大規(guī)模使用，且又很難在自然環(huán)境中降解，殘留時(shí)間較長(zhǎng)，DDT可通過(guò)土壤和食物給人類帶來(lái)極大的安全性問(wèn)題［2］。國(guó)內(nèi)外研究表明DDT污染形勢(shì)嚴(yán)重。如加拿大St Lawrence河表層水中DDT含量為9～22 ng·L-1［3］。2002年發(fā)現(xiàn)，中國(guó)江蘇省水稻田總DDT殘留量最高為1.15 mg·kg-1，超出土壤環(huán)境質(zhì)量三級(jí)標(biāo)準(zhǔn)（1.0 mg·kg-1）［4］。環(huán)境中殘留的DDT可在生物體脂肪組織內(nèi)富集，并通過(guò)食物鏈逐級(jí)放大到較高濃度，對(duì)人類生命健康造成嚴(yán)重威脅。DDT及其代謝物具有生殖發(fā)育毒性、神經(jīng)毒性、內(nèi)分泌干擾功能和免疫毒性等［5］。此外，DDT暴露和多種癌癥的發(fā)生密切相關(guān)，如大腸癌（colorectal cancer，CRC）、乳腺癌和肝癌等［6-9］。

CRC是一種十分常見(jiàn)的惡性腫瘤，而且死亡率在逐年上升。遺傳因素、日常飲食習(xí)慣如高比例攝入肉類和脂肪等都是CRC發(fā)病的誘因。此外，食品和飲料中的化學(xué)污染也是一個(gè)重要的因素［10］。流行病學(xué)調(diào)查表明，DDT暴露與CRC發(fā)病有關(guān)［11-12］。我們前期的研究結(jié)果表明，DDT暴露能促進(jìn)大腸癌細(xì)胞增殖并抑制其凋亡［13-15］。上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用［16-17］。在EMT過(guò)程中，細(xì)胞極性消失，細(xì)胞間黏附降低，上皮標(biāo)志蛋白N-鈣黏著蛋白表達(dá)降低，間質(zhì)蛋白N-鈣黏著蛋白和波形蛋白的表達(dá)升高。研究發(fā)現(xiàn)，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（singnal transducers and activators of transcription 3，STAT3）和鋅指轉(zhuǎn)錄因子Snail1是EMT的重要調(diào)節(jié)蛋白［18-19］。Zucchini-Pascal等［20］發(fā)現(xiàn)，DDT暴露能誘導(dǎo)人肝細(xì)胞發(fā)生EMT。此外，DDT處理肝癌細(xì)胞后，明顯抑制E-鈣黏著蛋白表達(dá)，并上調(diào)N-鈣黏著蛋白的表達(dá)［8］。因此，DDT可能影響CRC細(xì)胞EMT化。目前，關(guān)于DDT暴露對(duì)CRC癌細(xì)胞EMT的影響及分子機(jī)制未見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在探究DDT暴露對(duì)人結(jié)直腸腺癌上皮細(xì)胞（DL Dexter-1，DLD1）EMT的影響及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑和儀器

DLD1細(xì)胞（中國(guó)科學(xué)院上海分院細(xì)胞研究所），于37°C，5%的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，用含10%胎牛血清和1%青鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。DDT和二甲亞砜（DMSO）（美國(guó)Sigma公司），用DMSO溶解DDT，配置成100 mmol·L-1的儲(chǔ)備液。使用時(shí)用RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋至DDT 0.01，0.1，1.0，10.0和100.0 nmol·L-1；RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清（美國(guó)Gibco公司）；100×青、鏈霉素和胰蛋白酶（北京Solarbio公司）；總RNA抽提試劑Trizol和反轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TaKaRa公司）；熒光定量PCR試劑盒SGExcel FastSYBR Mixture（帶ROX）、熒光定量PCR引物、兔抗人STAT3和p-STAT3單克隆抗體（上海生工公司）；HRP標(biāo)記羊抗大鼠IgG二抗（H+L）和羊抗兔IgG二抗（H+L）（美國(guó)Invitrogen公司）；STAT3抑制劑WP1066（美國(guó)Cayman公司），用DMSO溶解WP1066，配置成 100 mmol·L-1的儲(chǔ)備液，WP1066使用終濃度為5 μmol·L-1。CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Forma公司）；蛋白質(zhì)電泳儀和電轉(zhuǎn)儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；倒置顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 細(xì)胞處理及分組

將DLD1細(xì)胞按照實(shí)驗(yàn)要求鋪板，分為正常對(duì)照組（加0.1%DMSO）、DDT 0.01，0.1，1.0，10.0和100.0 nmol·L-1組，抑制劑WP1066 5 μmol·L-1組以及DDT 1.0 nmol·L-1+WP1066 5 μmol·L-1組，作用48 h。

1.3 細(xì)胞形態(tài)觀察

DLD1細(xì)胞按每孔1×104細(xì)胞接種于24孔板中，次日待細(xì)胞貼壁后，分別用DDT 0.01，0.1，1.0，10.0和100.0 nmol·L-1處理48 h，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化并拍照。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)E-鈣黏著蛋白、N-鈣黏著蛋白、波形蛋白和鋅指轉(zhuǎn)錄因子Snail1的mRNA表達(dá)

將DLD1細(xì)胞按每孔1×105個(gè)細(xì)胞種于12孔板中，次日待細(xì)胞貼壁后，分別用DDT 0.01，0.1，1.0，10.0和100.0 nmol·L-1的處理48 h，收集細(xì)胞，提取總RNA，然后按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書，將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成DNA。按實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒說(shuō)明進(jìn)行PCR。目的基因mRNA表達(dá)用GAP?DH基因進(jìn)行均一化處理?；虮磉_(dá)變化的計(jì)算采用倍增變化率，基因倍增變化率=2-ΔΔCt（ΔCt為目的基因和內(nèi)參照基因Ct值的差值）。PCR反應(yīng)引物如表1。

Tab.1 Primer sequences of E-cadherin，N-cadherin，Snail1，vimentin and GAPDH for real-time quantitative PCR

1.5 Western蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)蛋白表達(dá)

在60 mm培養(yǎng)皿中接種1×106DLD1細(xì)胞，用DDT 0.1，1.0和10.0 nmol·L-1處理48 h，然后收集細(xì)胞，加入裂解液裂解10 min，收集上清。蛋白濃度用BCA法進(jìn)行定量。40 μg的蛋白質(zhì)樣品于12%聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離。電泳結(jié)束后，將分離的蛋白條帶轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST室溫下封閉1 h，1∶500一抗4°C過(guò)夜孵育，TBST洗膜3次，每次10 min。然后室溫孵育1∶2000二抗1 h，TBST洗膜3次，每次10 min。最后于暗室進(jìn)行化學(xué)發(fā)光液顯像。使用Image J分析軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行積分吸光度分析，以目標(biāo)蛋白條帶的積分吸光度值與對(duì)應(yīng)的α-微管蛋白積分吸光度值的比值表示目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用表示，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度DDT對(duì)大腸癌細(xì)胞DLD1細(xì)胞形態(tài)的影響

細(xì)胞形態(tài)觀察（圖1）結(jié)果顯示，正常對(duì)照組細(xì)胞大多呈圓形或者卵圓形，DDT 0.01，0.1，1.0，10.0和100.0 nmol·L-1處理組細(xì)胞，大多呈長(zhǎng)梭形，細(xì)胞間隙明顯增寬，有的長(zhǎng)出多個(gè)觸角。

Fig.1 Effect of clofenotane（p，p′dichlorodiphenyltrichlo?roethane，DDT）on morphological change of colorectal cancer DLD1 cells.DLD1 cells were treated with DDT for 48 h. Arrows show spindle cell and antenna of cells.

2.2 DDT對(duì)DLD1細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志蛋白E-鈣黏著蛋白、N-鈣粘著蛋白、波形蛋白及鋅指轉(zhuǎn)錄因子Snail1 mRNA表達(dá)的影響

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果（圖2）顯示，與正常對(duì)照組相比，DDT 0.01，0.1，1.0，10.0和100.0 nmol·L-1處理組E-鈣黏著蛋白mRNA相對(duì)表達(dá)降低（P＜0.01），分別為正常對(duì)照組的（67.2±8.8）%，（48.6± 3.8）%，（42.4±2.8）%，（71.6±8.3）%和（73.7± 6.4）%；DDT各處理組N-鈣黏著蛋白mRNA相對(duì)表達(dá)升高（P＜0.01），分別為正常對(duì)照組的1.5±0.1，1.6±0.2，1.9±0.1，1.5±0.2和（1.4±0.1）倍；DDT各處理組波形蛋白mRNA相對(duì)表達(dá)升高（P＜0.01），分別為正常對(duì)照組的1.2±0.1，1.3±0.1，1.5±0.2，1.3±0.2和（1.2±0.1）倍。DDT各處理組鋅指轉(zhuǎn)錄因子Snail1 mRNA相對(duì)表達(dá)顯著升高（P＜0.01），分別為正常對(duì)照組的1.2±0.1，1.3±0.1，1.5±0.1，1.3±0.1和（1.2±0.1）倍。

Fig.2 Effect of DDT on mRNA expressions of E-cad?herin，N-cadherin，vimentin and Snail1 in DLD1 cells by real-time PCR.See Fig.1 for the cell treatment.，n=3.＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

2.3 DDT對(duì)DLD1細(xì)胞STAT3和p-STAT3蛋白表達(dá)的影響

Western蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)結(jié)果（圖3A）顯示，與正常對(duì)照組相比，DDT 0.1，1.0和10.0 nmol·L-1處理組STAT3和p-STAT3蛋白水平升高（P＜0.01），STAT3蛋白水平分別為正常對(duì)照組的1.3，2.1和1.3倍，p-STAT3分別為正常對(duì)照組的1.4，1.8和1.4倍。

2.4 STAT3抑制劑WP1066對(duì)DDT誘導(dǎo)DLD1細(xì)胞E-鈣黏著蛋白、N-鈣黏著蛋白、波形蛋白和鋅指轉(zhuǎn)錄因子Snail1mRNA表達(dá)的影響

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果（圖4）顯示，與DDT 1.0 nmol·L-1處理組相比，DDT+WP1066組E-鈣黏著蛋白mRNA表達(dá)升高（P＜0.01），是DDT 1.0 nmol·L-1處理組的2.5±0.1倍；N-鈣粘著蛋白和波形蛋白mRNA表達(dá)降低（P＜0.01），分別是DDT 1.0 nmol·L-1處理組的（50.2±2.9）%和（61.6±6.1）%；鋅指轉(zhuǎn)錄因子Snail1 mRNA表達(dá)降低（P＜0.01），為DDT 1.0 nmol·L-1處理組的（56.3±0.9）%。

Fig.4 Effect of WP1066 on mRNA expression of E-cadherin，N-cadherin，vimentin and Snail1 in DDT-induced DLD1 cells.DLD1 cells were pre-incubated with WP1066（5 μmol·L-1）for 0.5 h and then treated withDDT 1.0 nmol·L-1for 48 h.，n=3.＊＊P＜0.01，compared with normal control（0）group；##P＜0.01，compared with DDT 1.0 nmol·L-1alone treatment group.

2.5 STAT3抑制劑WP1066對(duì)DDT誘導(dǎo)DLD1細(xì)胞STAT3和p-STAT3蛋白表達(dá)的影響

Western蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)結(jié)果（圖5）顯示，與DDT 1.0 nmol·L-1處理組相比，DDT和WP1066（5 μmol·L-1）共處理組中的p-STAT3蛋白水平降低，為正常對(duì)照組的47.8%（P＜0.01），STAT3蛋白水平無(wú)明顯變化，表明STAT3/Snail1信號(hào)通路被抑制。

Fig.5 Effect of WP1066 on protein expression of STAT3 and p-STAT3 in DDT-induced DLD1 cells by Western blotting.See Fig.4 for the cell treatment.B was the semi-quantitative result of A.，n=3.＊＊P＜0.01，compared with normal control（0）group；##P＜0.01，compared with DDT 1.0 nmol·L-1alone treatment group.

3 討論

本研究表明，DDT暴露能明顯改變大腸癌DLD1細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)，顯著降低EMT標(biāo)志蛋白E-鈣黏著蛋白表達(dá)水平，提高N-鈣黏著蛋白和波形蛋白的表達(dá)水平，提示，DDT促進(jìn)大腸癌DLD1細(xì)胞的EMT。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，DDT暴露激活STAT3/ Snail1信號(hào)通路，而STAT3抑制劑WP1066處理明顯抑制DDT對(duì)大腸癌DLD1細(xì)胞EMT的影響。以上結(jié)果表明，DDT通過(guò)激活STAT3/Snail1信號(hào)通路改變EMT標(biāo)志蛋白的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)大腸癌DLD1細(xì)胞EMT的發(fā)生。

EMT在腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵作用［16-17］。E-鈣黏著蛋白的缺失和間充質(zhì)蛋白E-鈣黏著蛋白和波形蛋白的過(guò)表達(dá)是腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT的標(biāo)志。E-鈣黏著蛋白介導(dǎo)細(xì)胞-細(xì)胞間粘附，并保持完整的基底膜和細(xì)胞形態(tài)。E-鈣黏著蛋白表達(dá)缺失會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞喪失上皮表型，降低細(xì)胞粘附，易于轉(zhuǎn)移。E-鈣黏著蛋白是一種主要的粘附分子并且促進(jìn)細(xì)胞-細(xì)胞粘附。波形蛋白是一種保持細(xì)胞形態(tài)和完整細(xì)胞質(zhì)的中間絲蛋白。E-鈣黏著蛋白和波形蛋白的過(guò)表達(dá)是與腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力密切相關(guān)［21-22］。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)DDT處理后，大腸癌細(xì)胞DLD1細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，由原有的圓形或卵圓形向長(zhǎng)梭形轉(zhuǎn)變，細(xì)胞間間隙明顯增寬，長(zhǎng)出觸角。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明，上皮標(biāo)志蛋白E-鈣黏著蛋白的mRNA表達(dá)顯著降低，而間充質(zhì)蛋白N-鈣黏著蛋白和波形蛋白的mRNA表達(dá)顯著升高，在DDT 1.0 nmol·L-1作用下，這幾種蛋白的變化最為明顯，這可能是由于DDT濃度過(guò)高會(huì)對(duì)細(xì)胞具有一定的毒性，而濃度過(guò)低時(shí)，對(duì)這些蛋白的影響未達(dá)到最顯著的效果［13-14］。上述結(jié)果表明，DDT暴露促進(jìn)人大腸癌DLD1細(xì)胞EMT與其影響E-鈣黏著蛋白、N-黏粘著蛋白和波形蛋白的表達(dá)有關(guān)。

有研究表明，STAT3在腫瘤細(xì)胞EMT發(fā)生過(guò)程中起著關(guān)鍵作用［23］。當(dāng)STAT3磷酸化后可與Snail等轉(zhuǎn)錄因子的啟動(dòng)子上特異DNA序列結(jié)合而調(diào)節(jié)其表達(dá)。本研究結(jié)果表明，DDT暴露能上調(diào)STAT3和p-STAT3的蛋白表達(dá)，表明DDT暴露誘導(dǎo)STAT3的激活。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，DDT暴露明顯上調(diào)Snail1的表達(dá)，揭示DDT可能通過(guò)STAT3上調(diào)Snail1。為了證明這一假設(shè)，本研究利用STAT3抑制劑WP1066抑制DDT誘導(dǎo)的STAT3激活。研究結(jié)果表明，與DDT處理組相比，DDT和WP1066共處理組中的p-STAT3蛋白表達(dá)明顯降低，而Snail1的表達(dá)也明顯下調(diào)。上述結(jié)果表明，DDT通過(guò)激活STAT3進(jìn)而上調(diào)Snail1的表達(dá)。研究報(bào)道，Snail1能間接或直接抑制E-鈣黏著蛋白的表達(dá)，Snail1與Smad相互作用蛋白1競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合E-鈣黏著蛋白的啟動(dòng)子E-Box系列（5′-CACCTG-3′），從而抑制E-鈣黏著蛋白的表達(dá)［24-25］。此外，Snail1能夠上調(diào)N-鈣黏著蛋白和波形蛋白的表達(dá)［26］。本研究發(fā)現(xiàn)，STAT3抑制劑WP1066與DDT共處理大腸癌DLD1細(xì)胞后，與DDT處理組相比，Snail1表達(dá)明顯下調(diào)的同時(shí)，E-鈣黏著蛋白表達(dá)升高，E-鈣黏著蛋白和波形蛋白表達(dá)降低。由此提示，DDT通過(guò)激活STAT3/Snail1信號(hào)通路進(jìn)而改變EMT化標(biāo)志蛋白的表達(dá)。

綜上所述，DDT暴露通過(guò)激活STAT3/Snail1信號(hào)通路抑制E-鈣黏著蛋白表達(dá)并上調(diào)E-鈣黏著蛋白和波形蛋白表達(dá)，這些EMT標(biāo)志蛋白的改變促進(jìn)大腸癌DLD1細(xì)胞EMT的發(fā)生，這一過(guò)程可能是DDT暴露促進(jìn)腸癌發(fā)展的關(guān)鍵機(jī)制之一。

［1］Aamir M，Khan S，Nawab J，Qamar Z，Khan A. Tissue distribution of HCH and DDT congeners and human health risk associated with consump?tion of fish collected from Kabul River，Pakistan［J］.Ecotoxicol Environ Saf，2016，125：128-134.

［2］Ding H，Li XG，Liu H，Wang J，Shen WR，Sun YC，et al.Persistent organochlorine residues in sediments of Haihe River and Dagu Drainage River in Tianjin，China［J］.J Environ Sci（China），2005，17（5）：731-735.

［3］Quémerais B.Lemieux C.Lum KR.Concentra?tions and sources of PCBs and organochlorine pesticides in the St.Lawrence River（Canada）and its tributaries［J］.Chemosphere，1994，29（3）：591-610.

［4］An Q，Dong YH，Wang H，Wang X，Wang MN，Guo ZX.Organochlorine pesticide residues in culti?vated soils，in the south of Jiangsu，China［J］. Acta Pedol Sin（土壤學(xué)報(bào)），2004，41（3）：414-419.

［5］Beard J，Australian Rural Health Research Collab?oration.DDT and human health［J］.Sci Total Envi?ron，2006，355（1-3）：78-89.

［6］Gupta PK. Pesticide exposure-indian scene［J］. Toxicology，2004，198（1-3）：83-90.

［7］Song L，Zhao J，Jin X，Li Z，Newton IP，Liu W，et al.The organochlorine p，p'-dichlorodiphenyltri?chloroethane inducescolorectalcancergrowth through Wnt/β-catenin signaling［J］.Toxicol Lett，2014，229（1）：284-291.

［8］Jin X，Chen M，Song L，Li H，Li Z.The evalua?tion of p，p'-DDT exposure on cell adhesion of he?patocellularcarcinoma［J］.Toxicology，2014，322：99-108.

［9］Gerber R，Smit NJ，Van Vuren JH，Nakayama SM，Yohannes YB，Ikenaka Y，et al.Bioaccumulation and human health risk assessment of DDT and other organochlorine pesticides in an apex aquatic predator from a premier conservation area［J］.Sci Total Environ，2016，550：522-533.

［10］ Colosio C，Tiramani M，Maroni M.Neurobehavioral effects of pesticides：state of the art［J］.Neurotoxi?cology，2003，24（4-5）：577-591.

［11］ Jaga K.Serum organochlorine pesticide levels in patients with colorectal cancer in Egypt［J］.Arch Environ Health，1999，54（3）：217-218.

［12］ Soliman AS，Smith MA，Cooper SP，Ismail K，Khaled H，Ismail S，et al.Serum organochlorine pesticide levels in patients with colorectal cancer in Egypt［J］.Arch Environ Health，1997，52（6）：409-415.

［13］Liu JX，Zhao JY，Jin XT，Li ZY，Song L.Effect oflow concentrations of p，p'-dichlorodiphenyltrichlo?roethane on proliferation and apoptosis of colorectal adenocarcinoma SW620 cells［J］.Chin J Pharmacol Toxicol（中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志），2015，29（2）：227-233.

［14］Song L，Zhao J，Jin X，Li Z，Newton IP，Liu W，et al.The organochlorine p，p'-dichlorodiphenyltri?chloroethane inducescolorectalcancergrowth through Wnt/β-catenin signaling［J］.Toxicol Lett，2014，229（1）：284-291.

［15］Song L，Zhao MR，Liu JX，Li ZY，Xiao H，Liu WP. P，p′-Dichlorodiphenyltrichloroethane inhibits the apoptosisofcolorectaladenocarcinoma DLD1 cells through PI3K/AKT and Hedgehog/Gli1 signaling pathways［J］.Toxicol Res，2015，4（5）：1214-1224.

［16］ Tsuji T，Ibaragi S，Hu GF.Epithelial-mesenchymal transition and cell cooperativity in metastasis［J］. Cancer Res，2009，69（18）：7135-7139.

［17］Thiery JP.Epithelial-mesenchymal transitions in tumour progression［J］.Nat Rev Cancer，2002，2（6）：442-454.

［18］Zhao S，Venkatasubbarao K，Lazor JW，Sperry J，Jin C，Cao L，et al.Inhibition of STAT3 Tyr705 phosphorylation by Smad4 suppresses transforming growth factor beta-mediated invasion and metastasis in pancreatic cancer cells［J］.Cancer Res，2008，68（11）：4221-4228.

［19］Huang C，Yang G，Jiang T，Zhu G，Li H，Qiu Z. The effects and mechanisms of blockage of STAT3 signaling pathway on IL-6 inducing EMT in human pancreatic cancer cells in vitro［J］.Neoplasma，2011，58（5）：396-405.

［20］Zucchini-Pascal N，Peyre L，de Sousa G，Rahmani R. Organochlorine pesticides induce epithelialto mesenchymal transition of human primary cultured hepatocytes［J］.Food Chem Toxicol，2012，50（11）：3963-3970.

［21］Rivat C，De Wever O，Bruyneel E，Mareel M，Gespach C，Attoub S.Disruption of STAT3 signaling leads to tumor cell invasion through alterations of homotypic cell-cell adhesion complexes［J］.Onco?gene，2004，23（19）：3317-3327.

［22］Iwamaru A，Szymanski S，Iwado E，Aoki H，Yokoyama T，F(xiàn)okt I，et al.A novel inhibitor of the STAT3 pathway induces apoptosis in malignant glioma cells both in vitro and in vivo［J］.Onco?gene，2007，26（17）：2435-2444.

［23］Masuda M，Wakasaki T，Suzui M，Toh S，Joe AK，Weinstein IB.Stat3 orchestrates tumor develop?ment and progression：the Achilles′heel of head and neck cancers？［J］.Curr Cancer Drug Targets，2010，10（1）：117-126.

［24］Wu Y，Zhou BP.New insights of epithelial-mesen?chymal transition in cancer metastasis［J］.Acta Bio?chim Biophys Sin（Shanghai），2008，40（7）：643-650.

［25］Cano A，Pérez-Moreno MA，Rodrigo I，Locascio A，Blanco MJ，del Barrio MG，et al.The transcription factor snail controls epithelial-mesenchymal transi?tions by repressing E-cadherin expression［J］.Nat Cell Biol，2000，2（2）：76-83.

［26］Kaufhold S，Bonavida B.Central role of Snail1 in the regulation of EMT and resistance in cancer：a target for therapeutic intervention［J］.J Exp Clin Cancer Res，2014，33：62.

Effect of clofenotane on epithelialmesenchymal transition in colorectal cancer DLD1 cells

DONG Ning-ning1,SONG Li1,LI Zhuo-yu1,XIAO Hong2
(1.Institute of Biotechnology,Key Laboratory of Chemical Biology and Molecular Engineering of National Ministry of Education,Shanxi University,Taiyuan 030006,China；2.The First Affiliated Hospital,Shanxi Medical University,Taiyuan 030006,China)

OBJECTIVE To explore the effect of clofenotane(DDT)on epithelial-mesenchymal transition(EMT)and the relevant molecular mechanism in human colorectal cancer cells.METHODS Human colorectal cancer cells DLD1 were treated with DDT 0.01,0.1,1.0,10.0 and 100.0 nmol·L-1for 48 h.Then,the morphology of DLD1 cells was observed.mRNA levels of E-cadherin,N-cadherin,vimentin and Snail1 were detected by real-time PCR.Protein expression of STAT3 signaling pathway of proteins STAT3 and p-STAT3 was detected by Western blotting.STAT3 inhibitor WP1006(5 μmol·L-1)was addedto determine its impact on DDT-induced alternation of STAT3/Snail1 signaling and EMT-related molecules. Protein expression of STAT3 and p-STAT3 was detected by Western blotting and mRNA levels of E-cadherin,N-cadherin,Vimentin and Snail1 were detected by real-time PCR.RESULTS DLD1 cell morphology was changed after exposure to DDT 0.01-100.0 nmol·L-1.Meanwhile,real-time PCR showed that the mRNA level of E-cadherin was significantly decreased compared with normal cell control (P＜0.01),which was 42.4±2.8%of that in the normal control group.The mRNA levels of N-cadherin,Vimentin and Snail1 were significantly increased(P＜0.01),which were 1.91±0.1,1.5±0.2 and 1.5±0.1 times that of the normal control group.DDT 0.1,1.0 and 10.0 nmol·L-1exposure induced up-regulation of STAT3 and p-STAT3 protein levels(P＜0.01),which were 2.1 and 1.8 times that of the normal control group. The addition of STAT3 inhibitor WP1066(5 μmol·L-1)prevented STAT3 from phosphorylation as well as the up-regulation of Snail1(P＜0.01),which was(56.3±0.9)%that of the DDT 1.0 nmol·L-1treat?ment group.Compared with DDT treatment alone,the mRNA levels of EMT-related molecules were remarkably reversed by WP1066(5 μmol·L-1)co-treatment,increasing E-cadherin but decreasing N-cadherin and vimentin in DLD1 cells(P＜0.01),which were 50.2±2.9%and 61.6±6.1%of those in the DDT 1.0 nmol·L-1treatment group,respectively.CONCLUSION DDT alters the expressions of EMT-related molecules including E-cadherin,N-cadherin and vimentin via STAT3/Snail1 signaling,thus promoting the EMT process in human colorectal cancer cells.This progress may be closely related to DDT-induced colorectal cancer development.

clofenotane;colorectal cancer;epithelial-mesenehymal transition;singnal transducers and activators of transcription 3

SONG Li,E-mail:lsong@sxu.edu.cn,Tel:(0351)7017774

R996

A

1000-3002-（2017）02-0172-07

10.3867/j.issn.1000-3002.2017.02.08

Foundation item:The project supported by National Natural Science Foundation of China(21207084);National Natural Science Foundation of China(31271516);Natural Science Foundation of Shanxi Province(2014011027-5);University Science and Technology Innovation Project of Shanxi Province(2016122);and Shanxi Scholarship Council of China (2016-115)

2016-09-06 接受日期：2017-01-24）

（本文編輯：賀云霞）

國(guó)家自然科學(xué)基金（21207084）；國(guó)家自然科學(xué)基金（31271516）；山西省自然科學(xué)基金（2014011027-5）；高等學(xué)校科技創(chuàng)新項(xiàng)目（2016122）；山西省回國(guó)留學(xué)人員科研資助項(xiàng)目（2016-115）

董寧寧，女，碩士研究生，主要從事環(huán)境毒理學(xué)研究。

宋莉，E-mail：lsong@sxu.edu.cn，Tel：（0351）7017774