纖維素酶法提取蘇子葉中黃酮類化合物的研究

姜顯光　余光景　姜美玲

摘要 為探究纖維素酶法對提取蘇子葉中黃酮類化合物的效果，通過單因素試驗，得到最佳提取工藝條件：溫度為57 ℃，提取時間為1 h，酶的濃度為0.4 mg/mL，提取次數(shù)為3次。纖維素酶法的平均回收率為 90.40%，相對標準偏差為5.01%，測得蘇子葉中黃酮類化合物的含量為1.609 mg/mL。該法比傳統(tǒng)堿液提取蘇子葉中黃酮類化合物的提取率提高了3倍以上。

關(guān)鍵詞 蘇子葉；黃酮類化合物；纖維素酶法；提取

中圖分類號 S567.23 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2017）04-0248-02

Abstract In order to investigate the effect of cellulase on extraction of flavonoids from perilla leaf，through single factor experiment，the optimum extraction conditions were obtained：temperature 57 ℃，extraction time 1 h，the concentration of enzyme 0.4 mg/mL，extracted 3 times.The average recovery of cellulase was 90.40%，the standard deviation was 5.01%，the content of flavonoids measured in perilla leaf was 1.609 mg/mL.This method is better than traditional alkali extraction of flavonoids from perilla leaf，its extraction rate increases by more than 3 times.

Key words perilla leaf；flavonoids；cellulase method；extraction

蘇子葉具有降氣消痰、平喘潤腸等功效，屬于第一批被中國衛(wèi)生部確定的既是食品又具醫(yī)藥保健功能的物質(zhì)，可以開發(fā)出多種保健食品，在醫(yī)藥、食品工業(yè)上具有廣泛的用途[1]。黃酮類化合物廣泛存在于高等植物體中，是植物長期自然選擇過程中產(chǎn)生的一些次級代謝產(chǎn)物，在花、葉、果實等組織中多為苷類，而在木質(zhì)部組織中則多為游離的苷元[2]。許多研究表明黃酮類化合物具有顯著的抗氧化、清除氧自由基、擴張心血管作用，可降血脂、阻斷動脈粥樣硬化、調(diào)節(jié)免疫機能、抗炎抗病毒、利膽、強心、鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛和抗腫瘤等[3]。因而，近年來關(guān)于黃酮類化合物的研究尤為活躍。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試植物材料。所用蘇子葉產(chǎn)于吉林省延邊市。

1.1.2 儀器。TU-1201紫外可見分光光度計（北京普析通用）、HH-4電熱恒穩(wěn)水浴鍋（國華電器有限公司）、FA21D4N電子天平、SHB-B95型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）等。

1.1.3 試劑。蒸餾水、乙醇、蘆丁標準品（中國藥品生物制品檢定所，含量92.5%），5%亞硝酸鈉溶液、10%硝酸鋁溶液、1 mol/L氫氧化鈉溶液、氫氧化鈣溶液、稀硫酸等（均為分析純）。

1.2 試驗方法

1.2.1 纖維素酶法提取。將蘇子葉晾干，粉碎40～60目[4]，準確稱取5.000 0 g置于錐形瓶中，加入200 mL的蒸餾水，浸泡24 h，將pH值調(diào)至4.5～6.5[5]，加入纖維素酶放入恒溫水浴鍋加熱，一段時間后將其取出抽濾，濾液在60℃以下加熱[6]，待將要得到膏狀物質(zhì)時，停止加熱，最后用400 mL 60%乙醇將其溶解，待測。

1.2.2 吸收波長的測定[7]。移取1 mL提取液分別置于10 mL容量瓶中，加入0.3 mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻，放置5 min后加入0.3 mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻，5 min后再加入2 mL 1 mol/L氫氧化鈉溶液混合，再用60%乙醇定容，混勻靜置10 min。以0.3 mL 5%亞硝酸鈉溶液、0.3 mL 10%硝酸鋁溶液、2 mL 1 mol/L氫氧化鈉溶液，再加入60%乙醇定容，得到的溶液作為參比溶液，在400～800 nm掃描，得到其吸收光譜，最大吸收波長為510 nm。

1.2.3 工作曲線回歸方程的建立[7]。準確稱取蘆丁標準試劑10.8 mg于100 mL容量瓶中溶解，并用60%乙醇溶液定容，搖勻，即得到標準品。準確移取上述標準溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中。依次加入0.3 mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻，放置5 min后加入0.3 mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻，5 min后再加入2 mL 1 mol/L氫氧化鈉溶液混勻，用60%乙醇稀釋至刻度線，10 min后于波長510 nm處測定其吸光度。得線性回歸方程為A=0.055 2c-0.002 3，R2=0.999 7[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 溫度對黃酮類化合物提取率的影響。纖維素酶的最適溫度范圍為45～65 ℃[9]。因此，分別選取溫度為45、49、53、57、61、65 ℃，提取時間為1 h，纖維素酶的濃度為0.8 mg/mL，提取1次按1.2.1的提取方法試驗。結(jié)果表明，當溫度為57 ℃時黃酮類化合物提取率最高（圖1）。

2.1.2 時間對黃酮類化合物提取率的影響。分別選取時間為0.25、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 h，溫度為57 ℃，纖維素酶的濃度為0.8 mg/mL，提取1次。結(jié)果表明，當提取1 h時黃酮類化合物提取率最高（圖2）。

2.1.3 纖維素酶濃度對黃酮類化合物提取率的影響。分別選取纖維素酶濃度為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL，溫度為57 ℃，提取時間為1 h，提取1次。結(jié)果表明，纖維素酶濃度為0.4 mg/mL時黃酮類化合物提取率最高（圖3）。

2.1.4 提取次數(shù)對黃酮類化合物提取率的影響。設(shè)置溫度為57 ℃，提取時間為1 h，纖維素酶濃度為0.4 mg/mL，分別提取1、2、3、4、5次（提取次數(shù)≥2時，后一次提取液要與前面提取液混合）。從圖4可以看出，當提取3次后，曲線處于緩慢上升狀態(tài)，提取率稍有提高，但從藥品成本和工作量等因素綜合考慮，提取3次最佳。

2.2 精密度、加樣回收與穩(wěn)定性試驗

2.2.1 精密度試驗。按1.2.1的提取方法提取3次，制備4個不同濃度的樣品，分別在510nm波長下測定吸光度9次，計算其濃度和平均值，求得標準偏差，結(jié)果見表1。

2.2.2 加樣回收試驗。稱取蘇子葉粉末3份，在樣品中加入蘆丁標準品5.0 mg，將樣品和標準品混合物按1.2.1的方法提取3次，結(jié)果見表2。

2.2.3 穩(wěn)定性試驗。按照樣品測定方法，分別在0、0.25、0.50、1.00、1.50、2.00 h測定同一樣品溶液的吸光度，試驗結(jié)果表明樣品測定液中的黃酮在2.0 h內(nèi)穩(wěn)定。

3 結(jié)論

本試驗以測得蘇子葉中黃酮類化合物含量為指標，采用纖維素酶法，以溫度、提取時間、纖維素酶濃度和提取次數(shù)為變量進行試驗，利用紫外分光光度法進行檢測，經(jīng)過數(shù)據(jù)處理結(jié)果和圖像分析，得到最佳提取工藝條件：溫度為57 ℃、提取時間為1 h、纖維素酶濃度為0.4 mg/mL、提取次數(shù)為3次，測得蘇子葉中黃酮類化合物的含量為1.609 mg/g。

本試驗提取3次，做了精密度試驗和加樣回收試驗，精密度試驗的相對標準偏差<1.76%，加樣回收試驗的平均回收率為90.40%，相對標準偏差為5.01%。

纖維素酶法提取蘇子葉中黃酮類化合物的研究表明，酶反應(yīng)時將植物組織分解，較大提高了黃酮類化合物的提取率，比傳統(tǒng)提取堿液提取效率要高很多，高小龍等[9]用堿液提取蘇子葉中黃酮類化合，提取率為0.482 mg/g，而用纖維素酶法提取，提取率為1.609 mg/g，比傳統(tǒng)堿液提取率高了3倍多，而且耗能少、污染少、操作相對簡便。但是，溫度、pH值、纖維素酶的濃度、提取時間和提取次數(shù)都會影響酶的活性，直接關(guān)系到黃酮類化合物的提取率，因而增強酶的活力是考察的重點方面。例如，可以對天然纖維素進行處理，以改變天然纖維素的結(jié)構(gòu)，降低纖維素的結(jié)晶度，脫去木質(zhì)素，以增加纖維素和纖維素酶的接觸面積，提高纖維素酶的效率[10]。隨著酶學(xué)的發(fā)展，纖維素酶在提取植物有效成分方面的應(yīng)用必然有更為廣闊的發(fā)展前景。

4 參考文獻

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