溶磷真菌的分離鑒定及其對新疆加工番茄種子萌發(fā)的影響

張佳佳，馮琳，武正芳，孫燕飛，朱新霞

（石河子大學生命科學學院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室，石河子 832003）

溶磷微生物（Phosphate-solubilizing microorganisms，PSM）是廣泛存在于土壤中，能夠?qū)⒅参镫y以吸收利用的磷素轉(zhuǎn)化為植物可吸收利用磷素的一類微生物[1]。近年來，從植物根際土壤中篩選具有活化土壤難溶無機磷能力的高效溶磷菌，已成為提高土壤磷有效性的研究熱點[2-4]。

研究發(fā)現(xiàn)，真菌的溶磷能力普遍比細菌要高[5]。已報道的部分溶磷微生物除了具有溶磷活性外，還具有可以分泌某些植物激素類物質(zhì)刺激植物生長的功能。種子萌發(fā)是植物個體生長發(fā)育的主要階段，直接影響植物后期的生長發(fā)育和產(chǎn)量[6]。為了提高種子活力、加快種子萌發(fā)、促進發(fā)根、培育壯苗等，生產(chǎn)上一般會對種子進行處理，種子的微生物處理就是方法之一。王明有等[7]研究發(fā)現(xiàn)在種植番茄的過程中使用液體微生物菌劑，可以提高番茄的產(chǎn)量、可溶性固形物、番茄紅素和Vc含量，改善產(chǎn)品風味，提高農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)。

目前，有關(guān)溶磷微生物對新疆加工番茄種子萌發(fā)影響的研究較少，本研究通過從加工番茄根際土壤中分離篩選溶磷真菌，研究其對加工番茄種子萌發(fā)的影響，以期為獲得有益于新疆加工番茄生產(chǎn)應(yīng)用的溶磷菌株奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試土樣

供試加工番茄根際土壤采集于石河子蔬菜研究所。

1.1.2 供試加工番茄品種：

里格爾（87-5）。

1.1.3 培養(yǎng)基

無機磷培養(yǎng)基（分離篩選培養(yǎng)基）：葡萄糖 10 g，(NH4)2SO40.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·H2O 0.03 g，Ca3(PO4)25.0 g，瓊脂 18 g，定容至 1000 mL，pH 7.0-7.5。121℃高壓蒸汽滅菌20 min。

真菌培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基）：馬鈴薯去皮，切成塊加水，煮沸30 min，用紗布過濾，濾液加葡萄糖20 g，瓊脂 18 g，補足水至 1000 mL，pH自然。121℃高壓蒸汽滅菌30 min。

1.2 方法

1.2.1 土樣的采集及理化測定

2014年7月20號，采用對角線法從石河子蔬菜研究所，采集加工番茄植株根部深度5-20 cm的土樣，去除地面植被、落葉、石礫和殘根等雜物，充分混合土樣后，分成兩份土樣：一份裝入無菌的牛皮紙袋中，封口后4℃保存，用于溶磷真菌的篩選；一份在自然條件下風干，用研缽研細過2 mm篩用于土壤理化測定。用重鉻酸鉀容量法測定土壤有機質(zhì)；凱氏定氮法測定土壤全氮；氫氧化鈉消煮-鉬銻抗比色法測定土壤全磷；碳酸氫鈉法測定土壤有效磷；氫氧化鈉熔融-火焰光度計法測定土壤全鉀[8]。

1.2.2 溶磷真菌的分離篩選及溶磷能力的測定

溶磷真菌的分離篩選：將4℃保存的土樣稀釋10-104倍制成土壤懸液，取每個濃度的稀釋液100 μL均勻涂布于無機磷固體培養(yǎng)基平板上，每個稀釋度做3次重復(fù)，28℃恒溫倒置培養(yǎng)5 d，選取溶磷圈較大的真菌菌株轉(zhuǎn)接于新鮮的PDA培養(yǎng)基上純化后，接入PDA斜面保藏。

定性測定：將純化的菌株接種于無機磷培養(yǎng)基平板上，每菌株重復(fù)3次，28℃恒溫倒置培養(yǎng)7 d，測定菌落直徑d和溶磷圈直徑D，根據(jù)D/d值初步確定菌株溶磷能力的強弱，對照組接種實驗室保留的無溶磷能力的青霉菌（Penicillium）。

定量測量：活化溶磷菌株使其大量產(chǎn)孢，用無菌水洗下制成108cfu/mL的孢子懸浮液，按1%的接種量接種于無機磷液體培養(yǎng)基中，不接種的液體培養(yǎng)基為對照，每處理重復(fù)3次，于28℃ 200 r/min振蕩培養(yǎng)7 d后取培養(yǎng)液10000 r/min 4℃ 離心10 min，取上清，通過鉬銻抗比色法在700 nm處測定光密度，根據(jù)繪制的磷標準曲線計算上清液中的有效磷含量。

1.2.3 溶磷菌的鑒定

1.2.3.1 菌落形態(tài)特征和培養(yǎng)特征觀察

方法參照文獻[9-10]。

1.2.3.2 ITS rDNA鑒定

將篩選菌株接種于馬鈴薯液體培養(yǎng)基，28℃200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h后過濾，將獲得菌絲體用液氮研磨，采用改良的CTAB法[12]獲得菌株DNA。用真核生物 ITS通用引物 ITS1-F:5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’和 ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATAT GC-3’擴增菌株ITS區(qū)域。PCR擴增程序為：94℃5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 40 s，35個循環(huán)；72℃ 8 min。PCR擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，經(jīng)純化后送至上海生工生物技術(shù)有限公司測序，將獲得的DNA序列輸入GeneBank，用Blast程序與數(shù)據(jù)庫中的序列進行比較分析。

1.2.4 溶磷真菌對番茄種子萌發(fā)的影響

將溶磷能力較高的菌株接種于馬鈴薯液體培養(yǎng)基中，28℃ 200 r/min振蕩培養(yǎng)2 d，備用。種子在處理前先用2%的NaClO溶液浸泡10 min，再用75%的酒精滅菌30 s后清水沖洗5次。試驗設(shè)單菌液處理和混菌菌液處理；菌液濃度設(shè)置3個梯度：菌液在600 nm（OD600）處的光密度值分別是0.1、0.5和1.0，以無菌去離子水為空白對照（CK）。每處理的液體剛好浸沒加工番茄種子，處理4 h后倒掉處理液，陰干。將各處理的種子200粒（每皿50粒，4次重復(fù)）均勻放入鋪有3層無菌濕潤濾紙的培養(yǎng)皿（Ф=9 cm）中，于25℃暗培養(yǎng)6 d。發(fā)芽期間每天定時噴灑無菌水2次并檢查種子發(fā)芽情況，以胚根伸出種殼達1/2種長為發(fā)芽標準，按下列公式計算萌發(fā)特性：發(fā)芽率Gr=6 d種子發(fā)芽數(shù)/供試種子數(shù)×100%；發(fā)芽勢Gp=3 d種子發(fā)芽數(shù)/供試種子數(shù)×100%；發(fā)芽指數(shù)GI=∑（Gt/Dt），式中，Gt為t天時的發(fā)芽數(shù)，Dt為對應(yīng)的種子發(fā)芽天數(shù)。

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0和Excel 2003軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試土樣理化測定

通過對采集的土壤進行理化測定，土壤基礎(chǔ)養(yǎng)分結(jié)果為：有機質(zhì) 32.43 g/kg、全氮 4.09 g/kg、全磷0.59 g/kg、有效磷 44.48 mg/kg、全鉀 5.48 g/kg、pH 7.75。供試土壤中有機質(zhì)含量豐富，但是土壤中可供植物吸收的有效磷僅占全磷的7.5%，土壤磷素利用率低。

2.2 溶磷真菌的分離篩選和溶磷能力的測定

從供試土樣中共分離28株溶磷真菌，其中菌株3-1和3-2在無機磷培養(yǎng)基上生長較好，均具有較好的溶磷能力，因此選擇這2株菌株作為本實驗的供試菌株。

溶磷菌株3-1和3-2第3-7天的D/d值見表1。由表1可知：菌株3-1的溶磷圈明顯，在生長的第4 d時能夠?qū)⑴囵B(yǎng)皿（Ф=9 cm）內(nèi)的無機磷Ca3（PO4）2全部轉(zhuǎn)化為可溶性磷，此時的D/d值最大，為2.05；菌株3-2在生長的第7天時D/d值為1.16。在液體無機磷Ca3（PO4）2培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)條件下，第7天時菌株3-1和3-2的溶磷量分別是368.7、142.2 mg/L。

表1 溶磷真菌的定性能力測定Tab.1 The ability of qualitative determination of phosphate-solubilizing fungi

2.3 溶磷真菌的鑒定

2.3.1 形態(tài)特征

菌株3-1和3-2在PDA固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d的生長情況如圖1。菌株3-1在PDA培養(yǎng)基上28℃恒溫培養(yǎng)1 d后肉眼可見清晰的菌絲體，生長迅速，7 d時菌落直徑65 mm，平坦，有輻射狀溝紋，質(zhì)地稍成絮狀，分生孢子結(jié)構(gòu)大量，表面呈炭黑色，偶爾有無色滲出液；菌落反面呈不同程度的黃色。菌株3-2在PDA培養(yǎng)基上28℃恒溫培養(yǎng)7 d時菌落直徑61 mm，平坦，質(zhì)地為致密絲絨狀，較厚，分生孢子結(jié)構(gòu)多，顏色為黃綠至草綠色，初期較淡現(xiàn)黃色，老后稍深近于草綠色，有菌核形成反面淡褐色，在形成菌核的反面顯現(xiàn)黑褐色斑點。

圖1 菌株3-1和3-2在PDA固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d的生長情況Fig.1 Growth of the strains on the PDA medium at 7 d

（2）王光華等[15]研究發(fā)現(xiàn)，黑土區(qū)高效溶磷真菌曲霉屬P39和P37的 D/d值分別為1.06和1.10，液體溶磷量僅為47.89和46.56 mg/g；范丙全等[16]培養(yǎng)溶磷草酸青霉第7 d時的D/d值為1.07-1.26。本研究從加工番茄根際土壤中分離篩選的溶磷真菌黑曲霉（Aspergillus niger）和黃曲霉（Aspergillus flavus），它們的D/d值分別達到了2.05和1.16，液體溶磷量分別為368.7和142.2 mg/L，表明篩選的菌株均具有較強的溶磷能力。黃曲霉因產(chǎn)生具有毒性的次級代謝產(chǎn)物黃曲霉毒素，在有關(guān)糧食和食品安全中研究較多，而目前有關(guān)黃曲霉具有溶磷能力未見報道。由于黃曲霉對生長環(huán)境要求不高，本研究篩選出的具有較強溶磷能力的黃曲霉，有望成為開發(fā)微生物肥料的優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源。

（3）植物種子的萌發(fā)受到許多外在和內(nèi)在因素的影響。農(nóng)作物種子的萌發(fā)狀態(tài)影響著成苗率和幼苗質(zhì)量，而成苗率和幼苗質(zhì)量是播種質(zhì)量的重要因素，也是提高田間植株質(zhì)量的關(guān)鍵因素。本研究用溶磷真菌菌液處理新疆加工番茄種子，通過發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)來說明種子活力的高低。試驗表明篩選的2株溶磷菌株對新疆加工番茄種子萌發(fā)有顯著的影響。從發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)綜合來看，較高濃度的菌液抑制了種子的萌發(fā)，而較低濃度的菌液有助于提高種子的發(fā)芽率和種子活力。黑曲霉的發(fā)酵液產(chǎn)物主要是有機酸類和酶類，而這些發(fā)酵液中的有機酸類和酶類物質(zhì)可能是促進種子萌發(fā)的關(guān)鍵因素[17-19]。

本研究發(fā)現(xiàn)篩選的2株溶磷菌株對加工番茄種子發(fā)芽率影響不如對種子活力影響明顯，菌株3-1促進種子活力的影響要大于菌株3-2。溶磷菌株具體對新疆加工番茄種子萌發(fā)影響的機制，以及在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用有待進一步研究。

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