香青蘭總黃酮對(duì)心肌缺血-再灌注損傷線粒體保護(hù)作用的研究

姚佳茗 ，曹文疆 ，袁勇 ，洪葉 ，陳衛(wèi)軍 ，王新春 ,

（1石河子大學(xué)藥學(xué)院，石河子 832002；2石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，石河子 832008）

心血管疾病是威脅人類(lèi)健康的主要疾病之一[1]。近年來(lái)，心肌缺血-再灌注損傷（myocardial ischemiareperfusion injury，MIRI）已受到廣大基礎(chǔ)和臨床工作者的關(guān)注[2-4]。造成MIRI的機(jī)制有許多，其中線粒體作為氧化磷酸化產(chǎn)生ATP的重要細(xì)胞器與MIRI的各個(gè)環(huán)節(jié)都有密切關(guān)系[5-7]。

香青蘭（Dracocephalum Moldevica L.）為唇形科青蘭屬一年生草本植物[8]，是維吾爾民族藥之一，主要用于治療心肌缺血、冠心病等心血管疾病[9-10]。其主要化學(xué)成分有黃酮類(lèi)、揮發(fā)油、萜類(lèi)、氨基酸及多肽等[11]，黃酮是香青蘭的主要有效成分[12]。香青蘭總黃酮（Dracocephalum Moldavica L.total flavonoids，TFDM）對(duì)缺血心肌有保護(hù)作用，但其作用是否與線粒體保護(hù)作用密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)TFDM抗MIRI線粒體保護(hù)作用的研究，為香青蘭臨床治療心血管疾病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器

HX-100E小動(dòng)物呼吸機(jī)（成都泰盟科技有限公司）；BL-420E生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）；TGL-16H臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；Thermo Scientific Varioskan Flash 3001酶標(biāo)儀（USA）；UV-2401PC紫外分光光度計(jì)（日本島津），JEOL-JEM-1230型透射電子顯微鏡（日本JEOL公司）；EM-UC6型超薄切片機(jī)（美國(guó)Leica公司）。

1.2 試藥

香青蘭總黃酮提取物（新疆自治區(qū)藥物研究所提供，香青蘭總黃酮純度為57%，20100708）；復(fù)方丹參滴丸（天津天士力制藥股份有限公司，950411）；環(huán)孢素 A（Sigma，BCBG7884V）；線粒體 /胞漿制備試劑盒（普利萊基因技術(shù)有限公司 C1260）；BCA法微量蛋白檢測(cè)試劑盒（南京建成，W 041）；ATP含量測(cè)定試劑盒（南京建成，A095）；MTT（Thermo scientific）；DCFH-DA（Sigma，D6883）Evans Blue（Sigma，502A043）；TTC（Sigma，531D036）

1.3 動(dòng)物

雄性SD大鼠，體重200-300 g，由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。合格證號(hào)：新醫(yī)動(dòng)字第2003-0001號(hào)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 分組及給藥

SD大鼠雄性，隨機(jī)分為7組，每組10只：假手術(shù)組（Sham）；心肌缺血 -再灌注組（模型組，I/R）；香青蘭總黃酮低劑量藥物組（TFDM-L，15 mg/kg/d），香青蘭總黃酮中劑量藥物組（TFDM-M，30 mg/kg/d），香青蘭總黃酮高劑量藥物組（TFDM-H，60 mg/kg/d）；環(huán)孢素 A組（CsA，再灌前 20 min經(jīng)尾靜脈注射10 mg/kg）；復(fù)方丹參滴丸陽(yáng)性藥對(duì)照組（CSDP，243 mg/kg/d）。各給藥組灌胃給藥 7 d，對(duì)照組和模型組同時(shí)用生理鹽水灌胃，并于第8天給藥后10 min行手術(shù)。

1.4.2 大鼠冠脈結(jié)扎（LAD結(jié)扎）致心肌缺血-再灌注模型的建立[13-14]

大鼠腹腔注射25%的烏拉坦（0.5 mL/100 g）麻醉。仰臥位固定，連接BL-420E生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，監(jiān)測(cè)正常狀態(tài)下大鼠肢體II導(dǎo)聯(lián)心電圖。行氣管插管，切開(kāi)皮膚，鈍性分離胸肌至肋骨，從第四五肋間隙把胸腔撐開(kāi)，接呼吸機(jī)，切除第五肋。撕開(kāi)心包膜，暴露心臟，輕輕取出心臟結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支（LAD），觀測(cè)心電圖，以心電圖 S-T段抬高、T波高聳或弓背向上抬高為心肌缺血模型復(fù)制成功的標(biāo)志。缺血30 min后，掏出心臟，剪開(kāi)結(jié)扎線，將其放回胸腔。此時(shí)以ST段抬高下降，T波逐漸恢復(fù)測(cè)定表示再灌注成功，120 min后進(jìn)行取材和相應(yīng)指標(biāo)的測(cè)定。

1.4.3 心肌梗死面積的測(cè)定

采用Evans Blue-TTC雙重染色法計(jì)算法分析梗死面積。再灌注120 min后，再次阻斷LAD，從主動(dòng)脈逆行注射1%伊文氏藍(lán)，沖洗心臟，左心室切片，1%TTC磷酸緩沖液中避光，37℃恒溫孵育30 min。計(jì)算缺血面積百分比（AAR/LV）=（缺血面積/左心室面積）×100%。梗死面積百分比（IS/AAR）=（梗死面積/缺血面積）×100%。

1.4.4 心肌組織ATP含量檢測(cè)

按試劑盒說(shuō)明書(shū)配置工作液并嚴(yán)格操作。工作液及待測(cè)樣品加完后室溫靜置5 min，在636 nm處測(cè)吸光度值。

1.4.5 線粒體的制備

100-200mg心肌新鮮組織，剪碎加入預(yù)冷的Mito Solution研磨。將勻漿液800×g離心5 min 4℃。收集上清液，重復(fù)上一步驟。上清液10，000×g離心10 min 4℃，沉淀加入0.2 mL Mito Solution，12，000×g離心10 min 4℃。線粒體沉淀在管底并立即使用。

1.4.6 電鏡標(biāo)本制備

樣品于2%的戊二醛液固定24 h以上，經(jīng)0.1%磷酸緩沖液漂洗，1%鋨酸固定，再用磷酸緩沖液沖洗。用 50%、60%、70%、90%丙酮脫水各 15 min，100%丙酮脫水10 min，兩次。用環(huán)氧樹(shù)脂812包埋劑進(jìn)行常規(guī)包埋，在37℃溫箱中過(guò)夜，于45℃溫箱中放置12 h，60℃放置24 h。超薄切片，硝酸鉛-醋酸雙氧鈾電子染色，JEOL-1230透射電鏡下觀察。

1.4.7 BCA法測(cè)定蛋白濃度

心肌線粒體蛋白含量的測(cè)定采用BCA蛋白定量檢測(cè)法。按試劑盒說(shuō)明書(shū)配置工作液。將蛋白標(biāo)準(zhǔn)液稀釋成不同濃度，按說(shuō)明書(shū)要求加入試劑，旋渦混合。37℃孵育30 min，用酶標(biāo)儀在562 nm波長(zhǎng)處讀取吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出蛋白濃度。調(diào)節(jié)樣本蛋白濃度至0.5 mg/mL。

1.4.8 線粒體活力檢測(cè)

取新鮮制備的線粒體懸液50μL，加入酶標(biāo)板微孔中，加入5 g/L甲氮甲唑藍(lán)20μL，30℃繼續(xù)孵育30 min，再加入50μL異丙醇20 min后于酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀570 nm比色。線粒體活力以加入MTT后OD570表示。

1.4.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)。所有數(shù)據(jù)都用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±S）的形式表達(dá)，組間比較采用單因素方差分析（ANOVA）及t檢驗(yàn)，P＜0.01、P＜0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 TFDM對(duì)心肌梗死面積的影響

除假手術(shù)組，各缺血-再灌注組心肌AAR/LV無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），且比值均>30%，證明模型建立成功。與假手術(shù)組比較，模型組IS/AAR明顯升高（P<0.01）。與模型組比較，香青蘭高、中劑量組均可以顯著降低心肌梗塞面積（P<0.01）。丹參滴丸組及mPTP抑制劑環(huán)孢素A組心肌梗死面積亦有所下調(diào)（表1）。

表1 香青蘭總黃酮預(yù)處理對(duì)大鼠MIRI后心肌及線粒體的保護(hù)作用 ±S,n=10Tab.1 Protection of TFDM on myocardia in MIRI rats ±S,n=10

表1 香青蘭總黃酮預(yù)處理對(duì)大鼠MIRI后心肌及線粒體的保護(hù)作用 ±S,n=10Tab.1 Protection of TFDM on myocardia in MIRI rats ±S,n=10

注：與假手術(shù)組比較，++表示P＜0.01；與模型組比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；與環(huán)孢素A組相比較，＃表示P＜0.05。

假手術(shù)組 0 01733.89±351.10 0.74±0.15

2.2 TFDM對(duì)心肌組織ATP含量的影響

結(jié)果見(jiàn)表1，與假手術(shù)組相比，模型組心肌組織ATP含量明顯下降（P＜0.01），說(shuō)明缺血再灌后線粒體受損，ATP含量降低。與模型組相比，香青蘭總黃酮高劑量組、環(huán)孢素A組和丹參滴丸組能夠明顯提高心肌組織ATP含量（P＜0.01）；與環(huán)孢素A組比較，香青蘭總黃酮低劑量組具有顯著性差異（P＜0.05），其保護(hù)作用低于環(huán)孢素A組，中、高劑量組以及復(fù)方丹參滴丸組與環(huán)孢素A組比較沒(méi)有顯著性差異，說(shuō)明三者對(duì)心肌組織ATP含量的影響與環(huán)孢素A相似。

2.3 TFDM對(duì)線粒體微觀結(jié)構(gòu)的改變

如圖1所示，假手術(shù)組（圖1a）線粒體外膜光滑，內(nèi)膜褶皺呈嵴，嵴形狀規(guī)則，線粒體光密度居中。模型組（圖1b）線粒體明顯腫脹，嵴突紊亂、斷裂或消失，空泡樣變甚至溶解至無(wú)正常結(jié)構(gòu)。香青蘭總黃酮高劑量組（圖1e）、環(huán)孢素A組（圖1f）以及復(fù)方丹參滴丸組（圖1g）線粒體輕度腫脹，基質(zhì)基本完整，顆粒部分消失，少部分?jǐn)嗔?，較I/R組比線粒體損傷程度明顯減輕。香青蘭總黃酮低劑組（圖1c）超微結(jié)構(gòu)改變與I/R組相似，病變稍輕，中劑量組（圖1d）較之低劑量組線粒體形態(tài)有所好轉(zhuǎn)（圖1 a-g）。

圖 1 透射電鏡下觀察心肌線粒體的結(jié)構(gòu)改變（×20000）Fig.1 Effect of TFDM on ultrastructure of mitochondria（×20000）

2.4 TFDM對(duì)線粒體活力的影響

結(jié)果見(jiàn)表1、圖2，與假手術(shù)組相比，模型組線粒體活力明顯下降（P＜0.01），說(shuō)明缺血再灌后線粒體受損，活力減低。與模型組相比，香青蘭總黃酮中劑量組與丹參滴丸組線粒體活力下降幅度較?。≒＜0.05），香青蘭總黃酮高劑量組和環(huán)孢素A組能夠明顯抑制線粒體活力的降低（P＜0.01），起到保護(hù)線粒體的作用。各給藥組除香青蘭總黃酮低劑量組外，與環(huán)孢素A組相比沒(méi)有明顯差異。

圖2 香青蘭總黃酮預(yù)處理對(duì)大鼠線粒體活力的影響（±s，n=10）Fig.2 Effect of TFDM on Activity of mitochondria(±s，n=10)

3 討論

能量是心肌缺血-再灌注過(guò)程中保持心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，維持正常功能的重要保障。線粒體功能障礙在心肌缺血-再灌注損傷（MIRI）中占有重要地位。缺血-再灌注時(shí)線粒體極易受到損傷，并在整個(gè)病理過(guò)程中起著中心樞紐作用。環(huán)孢素A（CsA）是一種特異性線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mPTP）的開(kāi)放抑制劑，大量實(shí)驗(yàn)證明[15]，再灌注時(shí)給予CsA，對(duì)缺血再灌過(guò)程中的心肌，尤其是線粒體，具有保護(hù)作用。故本實(shí)驗(yàn)選擇了CsA、復(fù)方丹參滴丸為陽(yáng)性藥物：通過(guò)復(fù)方丹參滴丸與香青蘭總黃酮和CsA的實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)比，證明香青蘭總黃酮和CsA對(duì)缺血心肌有保護(hù)作用；通過(guò)線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的抑制劑CsA預(yù)處理組，和香青蘭總黃酮預(yù)處理組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果作對(duì)比，證明香青蘭總黃酮對(duì)缺血心肌的保護(hù)作用可能與保護(hù)線粒體功能有關(guān)，來(lái)評(píng)價(jià)TFDM在線粒體方面對(duì)MIRI的保護(hù)作用。

再灌注在改善心肌供血的同時(shí)又加重了單純心肌缺血所造成的損傷，可致心肌梗死的出現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與模型組比較，TFDM組能顯著降低梗死面積百分比，有效的保障心臟功能的恢復(fù)。CsA預(yù)處理組與復(fù)方丹參滴丸組對(duì)缺血心肌的保護(hù)作用相當(dāng)，驗(yàn)證了CsA的心肌保護(hù)作用。眾所周知，線粒體是產(chǎn)生ATP的主要場(chǎng)所[16]，但在缺氧缺血等病理狀態(tài)下線粒體氧化磷酸化受損，ATP合成不足，能量代謝發(fā)生障礙，導(dǎo)致心肌組織損害。為了評(píng)估線粒體產(chǎn)生ATP的能力，本研究檢測(cè)了各組大鼠在缺血/再灌注后心肌組織中ATP的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，香青蘭總黃酮各劑量組能在一定程度上抑制心肌組織ATP含量的降低，說(shuō)明香青蘭總黃酮可以緩解急性心肌缺血/再灌注損傷所造成的能量供應(yīng)障礙。CsA預(yù)處理可以提高心肌組織中的ATP含量，香青蘭總黃酮中、高劑量組與環(huán)孢素A組作用相當(dāng)，提示香青蘭黃酮對(duì)心肌缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用與線粒體保護(hù)相關(guān)。

我們利用超薄切片技術(shù)，對(duì)香青蘭總黃酮預(yù)處理后的MIRI大鼠線粒體的超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行深入的研究。與假手術(shù)組比較，模型組線粒體的結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的病變，表明心肌缺血再灌注后線粒體受損，其正常的生理功能?chē)?yán)重退化。與模型組比較，復(fù)方丹參滴丸組以及CsA組線粒體的形態(tài)結(jié)構(gòu)改變不大，可以維持正常的生理功能，其中CsA組對(duì)線粒體的保護(hù)作用優(yōu)于復(fù)方丹參滴丸組，證實(shí)了CsA的線粒體保護(hù)作用。香青蘭總黃酮高、中劑量對(duì)線粒體有明顯的保護(hù)作用。與CsA組比較，香青蘭總黃酮高劑量組、復(fù)方丹參滴丸組對(duì)線粒體的保護(hù)作用與其大致相似。表明TFDM在MIRI過(guò)程中對(duì)線粒體有一定的保護(hù)作用。

目前常用 MTT法檢測(cè)細(xì)胞的活性，代表線粒體中琥珀酸脫氫酶活性，反應(yīng)細(xì)胞線粒體活力。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，缺血再灌后線粒體受損，經(jīng)TFDM預(yù)處理的組別線粒體受損程度均有所改善，表明TFDM對(duì)線粒體起到了一定的保護(hù)作用。與環(huán)孢素A組相比，香青蘭黃酮中、高劑量組和復(fù)方丹參滴丸組沒(méi)有顯著性差異，提示香青蘭黃酮可以很好的提高線粒體的活性，維持線粒體正常的生理功能。

綜上所述，TFDM不僅能夠明顯減輕大鼠心肌梗死程度，提高心肌ATP含量，還能有效保護(hù)線粒體活性以及結(jié)構(gòu)的完整性。TFDM各劑量組與CsA組和復(fù)方丹參滴丸組相比，除低劑量組外，沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說(shuō)明TFDM對(duì)MIRI具有線粒體保護(hù)作用，這可能是TFDM防治MIRI的作用機(jī)制之一。

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