克羅諾桿菌分型技術(shù)研究進展

費 鵬，楊同香，姜亦超，陳俊亮，羅 磊，任廣躍，康懷彬,*，Stephen James FORSYTHE*

（1.河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471023；2.長白山食品藥品檢驗檢測中心，吉林 白山 134500；3.諾丁漢特倫特大學(xué)病原體研究中心，英國 諾丁漢 NG11 8NS）

克羅諾桿菌分型技術(shù)研究進展

費 鵬1，楊同香1，姜亦超2，陳俊亮1，羅 磊1，任廣躍1，康懷彬1,*，Stephen James FORSYTHE3,*

（1.河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471023；2.長白山食品藥品檢驗檢測中心，吉林 白山 134500；3.諾丁漢特倫特大學(xué)病原體研究中心，英國 諾丁漢 NG11 8NS）

克羅諾桿菌原名阪崎腸桿菌，是嬰兒配方乳粉中主要的致病菌之一，能感染新生兒，并導(dǎo)致嚴重的壞死性小腸結(jié)腸炎、菌血癥和腦膜炎等疾病，致死率高達40%～80%。本文綜述了克羅諾桿菌常見的表型分型和分子分型方法，包括生化分型、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜分型、血清型分型、脈沖場凝膠電泳分型、多位點序列分型、隨機多態(tài)性擴增DNA基因分型、核糖體分型、特殊基因分型和全基因組分型，以期增加人們對克羅諾桿菌分型方法的認識，為全面揭示克羅諾桿菌的表型特征和遺傳多樣性提供方法和依據(jù)。

克羅諾桿菌；表型分型；分子分型；分型技術(shù)

克羅諾桿菌（Cronobacter spp.）屬于腸桿科，由阪崎克羅諾桿菌（C. sakazakii）、丙二酸鹽陽性克羅諾桿菌（C. malonaticus）、穆汀斯克羅諾桿菌（C. muytjensii）、蘇黎世克羅諾桿菌（C. turicensis）、都柏林克羅諾桿菌（C. dublinensis）、傳奇克羅諾桿菌（C. universalis）和調(diào)味品克羅諾桿菌（C. condimenti）7 個種組成，具有高度的遺傳多樣性[1-3]。更重要的是，克羅諾桿菌屬于嬰兒配方乳粉中的A類致病菌，新生兒尤其是體質(zhì)量較輕的早產(chǎn)兒攝入被克羅諾桿菌污染的嬰兒配方乳粉后，會發(fā)生嚴重的壞死性小腸結(jié)腸炎、菌血癥和腦膜炎等疾病，死亡率為40%～80%[4-5]。2014年XU Xiaoke等[6]從530 份市售的嬰兒配方乳粉中共檢測到23 株克羅諾桿菌，污染率高達4.3%。然而并不是所有的克羅諾桿菌都具有致病性，且不同的克羅諾桿菌的致病能力也不相同。據(jù)報道，阪崎克羅諾桿菌、丙二酸鹽陽性克羅諾桿菌和蘇黎世克羅諾桿菌具有致病性，且克羅諾桿菌毒素毒性的強弱與其分型的種類有密切聯(lián)系[7-8]。

克羅諾桿菌的分型方法包括表型分型和分子分型，其中表型分型包括生化分型和蛋白分型，分型的結(jié)果不僅能反映出克羅諾桿菌的形態(tài)特征、蛋白結(jié)構(gòu)、血清型等表型特征，也可以對克羅諾桿菌進行鑒定，具有較高的靈敏度，但可能產(chǎn)生一定的假陽性[9]?？肆_諾桿菌分子分型的方法多種多樣，如脈沖場凝膠電泳分型、多位點序列分型、隨機多態(tài)性擴增DNA基因分型、核糖體分型、全基因組分型等，可以從基因?qū)用娼沂究肆_諾桿菌之間相似程度及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，并能達到對嬰兒配方乳粉中克羅諾桿菌進行溯源的目的。本文對克羅諾桿菌的分型方法進行了綜述，以期為克羅諾桿菌表型和遺傳多樣性的研究提供理論依據(jù)。

1 克羅諾桿菌的表型分型

1.1 生化分型

克羅諾桿菌的生化分型，早期是依據(jù)克羅諾桿菌的不同生理生化反應(yīng)結(jié)果進行，主要的生理生化反應(yīng)有：福格斯-普里斯考爾實驗、甲基紅反應(yīng)、吲哚反應(yīng)、鳥氨酸脫羧酶反應(yīng)、乳糖產(chǎn)酸反應(yīng)、硝酸鹽（亞硝酸鹽）的減少反應(yīng)、D-葡萄糖的產(chǎn)氣反應(yīng)、丙二酸利用等[10]。目前最常見的生化分型方法是利用API20E生化鑒定系統(tǒng)，通過20 個不同的生理生化反應(yīng)來確定克羅諾桿菌的生化表型。李磊等[11]利用API20E對分離自嬰兒配方乳粉的野生克羅諾桿菌進行了生化分型，23 株克羅諾桿菌被分為了7 個生化型。LU Yan等[12]則利用API20E對75 株克羅諾桿菌進行了生化鑒定，并將其分成了8 個生化型。雖然API20E有一定的生化分型能力，但是辨識度很低。此外，API20E對克羅諾桿菌也具有一定鑒定能力，但是與基于16S rRNA的分子鑒定方法相比，API20E的鑒定方法可能導(dǎo)致假陽性的情況發(fā)生。

1.2 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜分型

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）是一種用于鑒定食源性致病微生物的新興技術(shù)，MS儀的高靈敏度及準確度使其非常適合應(yīng)用于微生物化學(xué)分類的研究。它的原理在于通過電離待檢微生物的表面蛋白質(zhì)，得到電離離子的質(zhì)核比（m/z），以離子的m/z為橫坐標，離子峰強度為縱坐標形成質(zhì)譜圖，并將質(zhì)譜圖中的數(shù)據(jù)與數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進行比對，確定最終的檢測結(jié)果[13]。2014年，趙貴明等[14]建立了克羅諾桿菌MALDI-TOF MS數(shù)據(jù)庫，并對135 株克羅諾桿菌進行MALDI-TOF MS分型，進而分析這些菌株與其來源的關(guān)系。LU Yan等[12]利用MALDI-TOF MS技術(shù)對分離自嬰兒配方乳粉的克羅諾桿菌進行了蛋白分型，將被檢的75 株克羅諾桿菌分為了36 個MALDI-TOF MS型，且全部鑒定為克羅諾桿菌。上述研究表明MALDI-TOF MS分型已經(jīng)廣泛地應(yīng)用到了克羅諾桿菌的分型中，且具有較高的辨識度，此外MALDI-TOF MS分型對樣品的純度要求不高，且具有自動化程度高、快速高效等特點。

1.3 血清型分型

克羅諾桿菌的血清型分型是其表型分型的重要組成部分，克羅諾桿菌具有致病性，而脂多糖與克羅諾桿菌的毒素和特異性抗原有關(guān)，因此對克羅諾桿菌進行基于脂多糖和O-抗原的血清型分型顯得尤為重要[15]。2011年，Jarvis等[16]利用限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）技術(shù)對克羅諾桿菌進行了基于脂多糖的血清型分型，即檢測目的DNA在限制性內(nèi)切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小，根據(jù)RFLP圖譜之間的相似性對克羅諾桿菌進行血清型分型。2011年，SUN Yamin等[17]建立了基于O-抗原的血清型分型方法，即通過設(shè)計代表不同血型的特異性引物，利用多重擴增，根據(jù)擴增產(chǎn)物基因條帶分子質(zhì)量的大小確定克羅諾桿菌的血清型。2013年，Andrea等[18]利用多重擴增的方法對分離自瑞士嬰兒配方乳粉廠的克羅諾桿菌進行了血清型分型，發(fā)現(xiàn)主要的血清型為阪崎克羅諾桿菌血清型O1和O2。相比RFLP技術(shù)，多重擴增的方法簡便快捷、耗時短，但不能對未知的血清型進行分型[19]。

2 克羅諾桿菌的分子分型

2.1 脈沖場凝膠電泳分型

脈沖場凝膠電泳（pulsed-field gel electrophoresis，PFGE）是傳統(tǒng)的細菌分型方法之一，被稱為細菌分型的金標準[20]。PFGE分型通常選用1～2 種限制性能內(nèi)切酶（Xba Ⅰ和Sep Ⅰ）對克羅諾桿菌進行酶切，在交替變換的電場中對克羅諾桿菌的DNA片段進行分離，得到PFGE指紋圖譜，最后通過聚類分析對克羅諾桿菌進行分型[21]。由于PFGE分型技術(shù)具有高度的辨識度，因此一直被作為重要的分型方法應(yīng)用于克羅諾桿菌分型之中[22]。2014年，柴云雷等[23]利用PFGE技術(shù)對分離自嬰兒配方乳粉的克羅諾桿菌進行了分型，將12 株克羅諾桿菌（包含2 株參考菌株）分為了11 個脈沖場型，可見PFGE分型技術(shù)的辨識度之高。同時，利用PFGE分型結(jié)果的相似性，可以對克羅諾桿菌進行溯源分析，即根據(jù)菌株的來源信息和圖譜中條帶分布的相似性，尋找該致病菌可能的來源，從而達到溯源的目的[12]。但PFGE分型也具有一定的局限性，并不是所有的克羅諾桿菌都能進行PFGE分型，如果基因組上不存在Xba Ⅰ或Sep Ⅰ的限制性內(nèi)切酶位點，則不能進行PFGE分型[24-25]。此外，它雖然屬于分子分型，但并不能反映克羅諾桿菌之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，也不能起到鑒定的作用[26]。

2.2 多位點序列分型

多位點序列分型（multilocus sequence typing，MLST）是一種基于DNA序列的分子分型方法，它選擇能反映全基因組系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的看家基因，對其進行特異性的聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR），并對擴增的產(chǎn)物進行基因測序，將得到的序列信息在數(shù)據(jù)庫中進行比對，得到其序列型，完成微生物的分子分型，并能利用生物學(xué)信息軟件進行系統(tǒng)發(fā)育分析。在克羅諾桿菌MLST方案中，7 個看家基因被選取，分別為：atpD、fusA、glnS、gltB、gyrB、infB和ppsA[10]。克羅諾桿菌的MLST已經(jīng)成為最為有效和普遍的分型方法之一，目前已經(jīng)建立了克羅諾桿菌MLST數(shù)據(jù)庫（http://www.pubmlst.org/cronobacter），其中包含1 000多株不同來源的克羅諾桿菌，并被分為400多個序列型，所有的研究者都可以通過克羅諾桿菌MLST數(shù)據(jù)庫分享研究結(jié)果，并和其他研究者的研究結(jié)果進行比較[27]。

由于克羅諾桿菌MLST技術(shù)操作簡便、辨識度較高，且具有高度的共享性，越來越多的研究者采用此項技術(shù)對克羅諾桿菌進行分型研究。由于MLST技術(shù)的優(yōu)越性，自2009年此法建立之后，克羅諾桿菌分型的大量研究都采用此法。2012年，Joseph等[7]對美國50 年間的325 株克羅諾桿菌進行了遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)阪崎克羅諾桿菌序列型（sequence type，ST）4是主要的ST，且與新生兒腦膜炎的引發(fā)有關(guān)。2013年Andrea等[18]利用MLST技術(shù)對分離自瑞士嬰兒配方乳粉廠的克羅諾桿菌進行分型研究，發(fā)現(xiàn)其主要的序列型為ST4和ST83，結(jié)合血清型分型的結(jié)果發(fā)現(xiàn)ST4和O-抗原血清型O2、ST83和O7有關(guān)。2014年，CUI Jinghua等[28]對我國境內(nèi)分離自臨床、嬰兒食品和飲用水等的克羅諾桿菌進行分型研究，將105 株克羅諾桿菌分為71 個序列型。2015年，F(xiàn)EI Peng等[25]對分離自我國嬰兒配方乳粉的克羅諾桿菌進行了MLST分型，將70 株克羅諾桿菌分為19 個序列型，并發(fā)現(xiàn)中國地區(qū)嬰兒配方乳粉中克羅諾桿菌的優(yōu)勢序列型為ST4、ST1和ST64?？梢姡琈LST已經(jīng)廣泛應(yīng)用到了克羅諾桿菌的分型中，并被充分地認可。此外，由于MLST是基于核酸序列的分型，因此能夠通過系統(tǒng)發(fā)育樹的建立分析克羅諾桿菌間的遺傳進化關(guān)系[27]。

2.3 隨機多態(tài)性擴增DNA基因分型

隨機多態(tài)性擴增DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）基因分型技術(shù)是在聚合酶的催化下，先利用隨機引物對細菌基因組DNA擴增，再利用電泳對PCR產(chǎn)物片段分離，最后根據(jù)電泳圖譜中每個泳帶中DNA片段的濃度大小和位置等反映細菌的多態(tài)性[29]。2010年，研究者利用RAPD技術(shù)對克羅諾桿菌進行了分子分型研究，如果將閾值設(shè)為80%，則22 株供試克羅諾桿菌能被分為18 個RAPD型[30]。此外，有研究者利用RAPD技術(shù)對克羅諾桿菌進行了分子分型，篩選出了用于區(qū)分不同種的克羅諾桿菌的特異性引物，并在之后食品中克羅諾桿菌的研究中發(fā)現(xiàn)該方法的辨識度為99.9%。在50%閾值的情況下，通過生物信息學(xué)軟件的分析將38 株克羅諾桿菌分為8 個簇[31]。RAPD方法具有較高的辨識度，但不能像MLST分型技術(shù)一樣實現(xiàn)全球信息共享，也不能精確到每個堿基，而且引物的設(shè)計和反應(yīng)條件會直接影響實驗的結(jié)果，不利于實驗結(jié)果的重復(fù)性[29]。

2.4 核糖體分型

核糖體分型方法可以用于大多數(shù)食源性致病菌的分型，但是非自動的核糖體分型操作復(fù)雜，重復(fù)性和穩(wěn)定性較差，并且缺少標準化的方法、統(tǒng)一的命名和數(shù)據(jù)庫，很難達到數(shù)據(jù)的共享[32]。因此RiboprinterTM基因指紋圖譜分析技術(shù)應(yīng)運而生，該技術(shù)以EcoRⅠ和PvuⅡ為標準內(nèi)切酶，將細菌的細胞溶解并對DNA進行酶切，通過凝膠電泳將DNA酶切結(jié)果顯示出來，最后對其圖譜進行分析，由于這些步驟都是利用機器自動化操作，所有的標準都均一，因此可以排除其他外界因素的干擾，并可以利用BioNumefics數(shù)據(jù)庫軟件對圖譜進行處理和分析，從而建立細菌的指紋圖譜數(shù)據(jù)庫[33]。裴曉燕等[34]利用核糖體分型對分離自食品的克羅諾桿菌進行了核糖體分型，30 株克羅諾桿菌被分為了26 個核糖體型，不同供試菌株之間的相似度在31.58%以上。RiboprinterTM基因指紋圖譜分析的優(yōu)點在于重復(fù)性和穩(wěn)定性高，且可以建立數(shù)據(jù)，方便信息在實驗室之間的共享，具有易操作、耗時短、結(jié)果易比較、人為誤差少等優(yōu)點，可以廣泛應(yīng)用于公共衛(wèi)生事件的相似性查詢和初步溯源等[35]。但是，此種方法對克羅諾桿菌的辨識度沒有PFGE和MLST分型高。

2.5 特殊基因分型

一些特殊的基因也可以用于克羅諾桿菌的分型中，比如16S rRNA、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）、rpoB、外膜蛋白A（outer membrane proteins，OmpA）基因ompA等。利用16S rRNA對克羅諾桿菌進行分析，既可以對其進行鑒定，也可以起到分型的作用[36]。ITS序列是操縱子上16S rDNA與23S rDNA間的一段間隔序列，可用于對克羅諾桿菌的分類鑒定[37]。上述兩個基因不但能夠用于克羅諾桿菌的鑒定，還能夠在一定程度上用于對該致病菌進行分型，但是由于兩個基因所攜帶的遺傳信息不多，因此基于上述基因的分型方法辨識度并不高。rpoB基因是細菌RNA聚合酶β亞基的編碼基因，大量的研究表明可以利用此基因?qū)肆_諾桿菌進行鑒定和分型[38-39]。在病原體黏附和侵入宿主的過程中，OmpA起至關(guān)重要的作用，可通過胞移作用使克羅諾桿菌穿過腸上皮細胞[40-41]，因此對克羅諾桿菌進行ompA基因的分型可以為其致病能力及致病機理的研究提供理論基礎(chǔ)。FEI Peng等[25]利用rpoB和ompA兩個基因?qū)肆_諾桿菌進行了分型研究，結(jié)果證明了利用這兩類基因?qū)肆_諾桿菌進行分型的可行性。綜上，利用特殊基因可以對克羅諾桿菌進行分型，并可結(jié)合特殊基因的功能性挖掘更多的信息，但是這種方法的辨識度不高，不能用于進行溯源研究。

2.6 全基因組分型

全基因組測序是對未知基因組序列的物種進行個體的基因組測序。目前，最為成熟的全基因組測序技術(shù)是二代測序即高通量測序技術(shù)。與一代測序相比，二代測序不僅能夠保證測序結(jié)果具有較高的準確性，而且測序成本也明顯低于一代測序[42]。一些研究學(xué)者已經(jīng)利用二代測序技術(shù)對克羅諾桿菌的分離株或模式株進行了測序。YAN Qiongqiong等[43]利用二代測序技術(shù)對持續(xù)出現(xiàn)在嬰兒配方乳粉工廠設(shè)備環(huán)境中的一株阪崎克羅諾桿菌（C. sakazakii SP291）進行了全基因組測序分析，得到了該株致病菌基因組的生物信息學(xué)數(shù)據(jù)，為增加對新生兒克羅諾桿菌感染的理解和洞察與環(huán)境持久性相關(guān)的功能基因提供了幫助。Grim等[44]利用二代測序技術(shù)對克羅諾桿菌屬進行了pan基因和核心基因分析，揭示了該屬不同種之間清晰的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，并闡明了克羅諾桿菌與分離植物的環(huán)境相關(guān)性。CAI Liping等[45]則利用二代測序技術(shù)揭示了阪崎克羅諾桿菌?；D(zhuǎn)移酶的基因編碼序列。全基因組測序技術(shù)是最為理想的分子分型方法，它以細菌的整個基因組為研究對象，對基因組中的全部基因進行測序，測定其DNA的堿基序列，從而獲得更為豐富的生物學(xué)信息。全基因組測序是研究克羅諾桿菌分型最有效的方法，并可以對該致病菌進行精確的溯源，但這項技術(shù)耗時長、成本高，較難普及[29]。

3 結(jié) 語

對克羅諾桿菌進行分型研究可以增加對克羅諾桿菌的了解，并能為克羅諾桿菌的深層研究提供理論基礎(chǔ)。上述的幾種分型方法是近些年來常見的分型手段，其中生化分型、MALDI-TOF MS分型和血清型分型屬于克羅諾桿菌的表型分型。相比API20E和血清型分型，MALDI-TOF MS分型具有較高的辨識度，其中API20E和MALDI-TOF MS均具有較高的鑒定能力，但是血清型分型不能達到鑒定的效果?？肆_諾桿菌分子分型的方法較多，其中PFGE分型應(yīng)用最為廣泛，主要用于克羅諾桿菌等食源性致病菌的分型、溯源及臨床研究[16]。雖然PFGE具有較高的分型辨識度，但不能反映克羅諾桿菌間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，也無法起到鑒定的作用，因此需要其他的方法進行輔助。MLST分型不僅有較高的辨識度，而且能夠用于進行系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的研究，并且在7 個看家基因中，可以利用fusA基因?qū)肆_諾桿菌進行鑒定[5]。一些特殊基因的分型可以幫助我們對克羅諾桿菌一些功能性基因進行了解，從而為相關(guān)研究提供理論基礎(chǔ)。此外，克羅諾桿菌的全基因組分析從整個基因組的層面對克羅諾桿菌進行生物信息挖掘，得到更多的生物學(xué)信息，可以更全面地解決克羅諾桿菌的遺傳進化問題，但資金花費較大。綜上所述，一些辨識度較高的分型方法，如MALDI-TOF MS分型、PFGE分型、MLST分型和全基因組分型等方法可以用于克羅諾桿菌的溯源研究，并具有較高的穩(wěn)定性，可以幫助我們找到克羅諾桿菌的污染源，減少克羅諾桿菌對嬰兒配方乳粉及其他嬰兒食品的污染，從而及時對克羅諾桿菌能引起的疾病進行防控。

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Progress in Typing Methods for Cronobacter spp.

FEI Peng1, YANG Tongxiang1, JIANG Yichao2, CHEN Junliang1, LUO Lei1, REN Guangyue1, KANG Huaibin1,*, Stephen James FORSYTHE3,*

(1. College of Food and Biological Engineering, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471023, China;2. Changbai Mountain Food and Drug Inspection Testing Center, Baishan 134500, China;3. Pathogen Research Centre, Nottingham Trent University, Nottingham NG11 8NS, United Kingdom)

Cronobacter spp., which was formerly defined as Enterobacter sakazakii, is one of the main pathogenic bacteria that easily contaminates powdered infant formula (PIF) and can infect newborns and cause severe necrotizing enterocolitis,bacteremia and meningitis, with a high mortality rate of 40%-80%. This article reviews the commonly used methods for the phenotypic and molecular typing of Cronobacter spp. including biotyping, matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry, serological typing, pulsed field gel electrophoresis, multilocus sequence typing, random amplification of polymorphic DNA, ribotyping, special genotyping and whole-genome typing with the aim of providing a better understanding of these methods, which will offer a basis for revealing the phenotypic characteristics and genetic diversity of Cronobacter spp..

Cronobacter spp.; phenotyping; molecular typing; typing methods

10.7506/spkx1002-6630-201721048

TS252.1

A

1002-6630（2017）21-0308-05

費鵬, 楊同香, 姜亦超, 等. 克羅諾桿菌分型技術(shù)研究進展[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(21): 308-312.

10.7506/spkx1002-6630-201721048. http://www.spkx.net.cn

FEI Peng, YANG Tongxiang, JIANG Yichao, et al. Progress in typing methods for Cronobacter spp.[J]. Food Science, 2017,38(21): 308-312. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201721048. http://www.spkx.net.cn

2016-08-16

河南科技大學(xué)博士科研啟動基金項目（13480066）；河南科技大學(xué)青年科學(xué)基金項目（2015QN038）

費鵬（1986—），女，講師，博士，研究方向為乳品科學(xué)。E-mail：736422337@qq.com

*通信作者：康懷彬（1963—），男，教授，碩士，研究方向為畜產(chǎn)品加工。E-mail：khbin001@163.com Stephen James Forsythe（1958—），男，教授，博士，研究方向為致病菌微生物及遺傳多樣性。E-mail：stephen.forsythe@ntu.ac.uk