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    白毛藤多糖聯(lián)合阿霉素對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響※

    2017-04-08 07:29:17楊旭東楊清東楊驕霞王桂云崔榮軍劉洪鳳
    中醫(yī)藥通報(bào) 2017年1期
    關(guān)鍵詞:白毛空白對(duì)照低劑量

    ● 楊旭東 張 杰 楊清東 楊驕霞 王桂云 崔榮軍 劉洪鳳

    白毛藤多糖聯(lián)合阿霉素對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響※

    ● 楊旭東1*張 杰1▲楊清東1楊驕霞2王桂云1崔榮軍1劉洪鳳1

    目的:探討白毛藤多糖(Solamum lyratum Thunb polysaccharide,SLTP)聯(lián)合阿霉素(Adrismycim,ADM)對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡的影響及其分子機(jī)制。方法:實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、ADM組、ADM+低劑量SLTP組,ADM+中劑量SLTP組,ADM+高劑量SLTP組。通過(guò)RT-PCR檢測(cè)各組Bcl-2、Fas基因表達(dá)量的變化,同時(shí)應(yīng)用熒光顯微鏡觀察人乳腺癌細(xì)胞MCF-7細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果:與空白對(duì)照組比較,ADM組及ADM+高中低劑量SLTP組細(xì)胞凋亡率增加,并且上調(diào)Fas和降低Bcl-2表達(dá)。結(jié)論:阿霉素及阿霉素聯(lián)合白毛藤多糖促進(jìn)其MCF-7細(xì)胞凋亡,其機(jī)制可能與激活Fas、抑制Bcl-2的基因表達(dá)有關(guān)。

    白毛藤多糖 阿霉素 乳腺癌 Fas Bcl-2

    乳腺癌即乳腺惡性腫瘤,是女性常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,治療方式以手術(shù)治療為主。對(duì)于無(wú)法手術(shù)治療的患者,如何一方面保證化療藥物的療效,一方面減少化療藥物的毒副作用,一直是臨床上惡性腫瘤化療過(guò)程中亟待解決的問(wèn)題。白毛藤(Solamum lyratum Thunb)是茄科植物白英的全草,傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為其有清熱、利濕、解毒、消腫之功用[1]。本課題組前期實(shí)驗(yàn)表明,白毛藤對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有增殖抑制作用[2-3],本研究進(jìn)一步觀察白毛藤多糖(Solamum lyratum Thunb polysaccharide,SLTP)聯(lián)合阿霉素(Adrismycim,ADM)對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖的影響及其分子機(jī)制,為SLTP應(yīng)用于乳腺癌的輔助化療,降低化療藥物的毒副作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    1 材料

    1.1 乳腺癌細(xì)胞株 人乳腺癌MCF-7細(xì)胞株購(gòu)于武漢中美科技有限公司,按細(xì)胞庫(kù)要求培養(yǎng)細(xì)胞。

    1.2 主要試劑 RT-PCR試劑盒及相關(guān)試劑購(gòu)于大連寶生物有限公司(批號(hào):DRR019A);胰酶(批號(hào): 1606137)、引物購(gòu)于上海生工生物工程公司;DMEM培養(yǎng)基(批號(hào):12491013)、胎牛血清(批號(hào):1527494)、Trizol(批號(hào)15596-026)購(gòu)于美國(guó)Gibco公司,4℃保存;MTT細(xì)胞增殖分析試劑盒購(gòu)于Sigma公司(批號(hào): PB11058)。

    2 方法

    2.1 藥物的制備 白毛藤清洗勻漿、醇提、沉淀,留取沉淀再溶解、再沉淀、離心分離。蒸餾水溶解固體部分,加入等體積氯仿/正丁醇混合液(4∶1),振蕩混勻20min,沉淀,取上清,去除蛋白,重復(fù)操作3次。取上清,再醇析(4倍乙醇),取沉淀用乙醚、丙酮依次洗滌,冷凍干燥,即得SLTP。

    2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 精確稱(chēng)取適量SLTP溶解于10%胎牛血清的 DMEM培養(yǎng)液中配置成16mg· mL-1SLTP的母液,4℃儲(chǔ)存,應(yīng)用時(shí)按比例稀釋。MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中,37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。調(diào)零組:不含細(xì)胞的培養(yǎng)液;空白對(duì)照組:用含MCF-7細(xì)胞的培養(yǎng)液;ADM組:1mg·L-1ADM;ADM+低劑量SLTP組: 1mg·L-1ADM+0.4mg·mL-1SLTP;ADM+中劑量SLTP組:1mg·L-1ADM+0.8mg·mL-1SLTP; ADM+高劑量SLTP組:1mg·L-1ADM+1.6mg· mL-1SLTP。

    2.3 MTT方法檢測(cè)細(xì)胞的藥物敏感性 以每孔150μL將密度為1×105個(gè)·mL-1的MCF-7細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中。分別加入不同濃度藥物20μL,每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔,另外設(shè)不加藥物的空白對(duì)照組。細(xì)胞培養(yǎng)12、24、48h后,除調(diào)零組外各組分別加入20μL MTT(5g·L-1);培養(yǎng)4h后,棄去MTT液,加DMSO150μL/孔,全自動(dòng)酶標(biāo)儀490nm波長(zhǎng),測(cè)定光密度值(OD值)。計(jì)算腫瘤細(xì)胞抑制率(inhibition rate,IR)。IR=(對(duì)照組OD-實(shí)驗(yàn)組OD)/(對(duì)照組OD-空白組OD)×100%。

    2.4 細(xì)胞凋亡檢測(cè) MCF-7細(xì)胞以3×105·mL-1的濃度,接種于6孔培養(yǎng)板中,1mL/孔。CO2培養(yǎng)箱孵育細(xì)胞24h后,加入相應(yīng)藥物,對(duì)照組加相同體積新鮮培養(yǎng)液。48h后胰酶消化細(xì)胞制成細(xì)胞懸液,0.01mol·L-1PBS漂洗 3遍,固定液 4℃固定細(xì)胞10min,棄固定液,0.01mol·L-1PBS漂洗細(xì)胞3次,5min/次,干燥后,在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中,用5mg ·L-1Hoechst33258染色液染色15 min,取出蓋玻片,用甘油與PBS比例為1:9的混合性封片劑封片,熒光顯微鏡觀察。計(jì)算細(xì)胞凋亡率,細(xì)胞凋亡率=[凋亡細(xì)胞/(凋亡細(xì)胞+正常細(xì)胞)]×100%。

    2.5 RT-PCR檢測(cè) 總RNA的提取,將各組細(xì)胞中加入1mL Trizol,用移液管吹打混勻,移入Ep管,15~30℃放置5min。每管加入0.2ml氯仿,震蕩混勻,室溫放置3min。12000 r·min-1、4℃,離心15min,上清移入新Ep管,加0.5mL異丙醇,混勻,靜置10min。12000r·min-1、4℃、離心 5min,棄上清液,加入1mL4℃75%乙醇(DEPC水配制),震蕩使RNA沉淀重新懸浮。7500r·min-1、4℃,離心5min,棄上清,靜置10min,加入DEPC水20μL混勻、溶解RNA,分光光度計(jì)測(cè)定A260/A280為1.8-2.0,RNA產(chǎn)物置于-80℃冰箱保存。PCR擴(kuò)增引物如下:Fas上游引物序列為:5'-CGCCTATGGTTGTTGTTGACC-3';Fas下游引物序列為:5'-CCTCTGTTACGACCTC-3',擴(kuò)增產(chǎn)物Fas的長(zhǎng)度為477bp。Bcl-2上游引物序列為:5'-GACTTCTCGTCGCTACCGTC-3';Bcl-2下游引物序列:5'-ACATGCACCTACCCAGCCTCCGTTATC-3',擴(kuò)增產(chǎn)物Bcl-2長(zhǎng)度為296bp。β-actin上游引物序列為:5'-ATGTGGCACCACACCTTCTA-3',β-actin下游引物序列為:5'-CGTCATACTCCTGCTTGCTG-3',擴(kuò)增產(chǎn)物β-actin片段為838bp。PCR反應(yīng)條件:94℃、5min,預(yù)變性,1個(gè)循環(huán);94℃、5min,變性,54℃、50s,退火,72℃、90s,延伸,35個(gè)循環(huán);72℃、10min,延伸,1個(gè)循環(huán)。瓊脂糖凝膠電泳后拍照,軟件分析Bcl-2、Fas mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

    3 結(jié)果

    3.1 MTT實(shí)驗(yàn)測(cè)定藥物敏感性 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,高中低劑量的SLTP分別與ADM合用對(duì)乳腺癌細(xì)胞都有明顯的抑制增殖作用,其作用效果比單用ADM效果明顯。見(jiàn)表1。

    表1 細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%±s)

    表1 細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%±s)

    注:與ADM組比較,**P<0.01,*P<0.05。

    組別12 h 24 h 48 h空白對(duì)照組ADM組ADM+低劑量SLTP組ADM+中劑量SLTP組ADM+高劑量SLTP組———5.460.03 9.180.04*15.070.13*19.730.21**7.430.21 10.790.52*23.610.84**27.060.53**13.611.31 18.471.44*26.641.71**31.141.87**

    3.2 細(xì)胞凋亡情況 熒光顯微鏡下可見(jiàn)空白對(duì)照組細(xì)胞核形態(tài)完整。不同濃度藥物作用于乳腺癌MCF-7細(xì)胞48 h后,熒光標(biāo)記的凋亡細(xì)胞,細(xì)胞核呈藍(lán)色深染、細(xì)胞核碎裂等情況。各組細(xì)胞的凋亡率各不相同,與空白對(duì)照組凋亡率(3.76%)比較,ADM組凋亡率(6.37%)明顯升高,說(shuō)明ADM可以誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡;ADM+低劑量SLTP組凋亡率為9.03%,ADM+中劑量SLTP組凋亡率為11.41%,ADM+高劑量SLTP組凋亡率為15.43%,與空白對(duì)照組比較,ADM+高劑量SLTP組腫瘤細(xì)胞的凋亡率升高最明顯(P<0.01)。

    3.3 ADM聯(lián)合SLTP對(duì)Bc1-2和Fas基因表達(dá)影響

    腫瘤細(xì)胞中抑制細(xì)胞凋亡的Bcl-2基因的表達(dá)情況(見(jiàn)圖1及表2):與空白對(duì)照組比較,藥物作用48h后,ADM組Bcl-2基因表達(dá)減少(P<0.05),ADM+低劑量SLTP組、ADM+中劑量SLTP組、ADM+高劑量SLTP組Bcl-2基因表達(dá)降低,效果更顯著(P<0.01);腫瘤細(xì)胞中促進(jìn)細(xì)胞凋亡的Fas基因的表達(dá)情況(見(jiàn)圖2及表2):與空白對(duì)照組比較,藥物作用48h后,ADM組Fas基因表達(dá)增加(P<0.05),ADM+低劑量SLTP組、ADM+中劑量SLTP組、ADM+高劑量SLTP組Fas基因表達(dá)增加,效果更顯著(P<0.01)。

    表2 ADM聯(lián)合SLTP對(duì)Bc1-2和Fas基因表達(dá)影響(±s)

    表2 ADM聯(lián)合SLTP對(duì)Bc1-2和Fas基因表達(dá)影響(±s)

    注:與空白對(duì)照組比較,**P<0.01,*P<0.05。

    組別 Bcl-2/β-Actin Fas/β-Actin空白對(duì)照組ADM組ADM+低劑量SLTP組ADM+中劑量SLTP組ADM+高劑量SLTP組0.63±0.04 0.46±0.03*0.32±0.03**0.28±0.02**0.21±0.01**0.13±0.01 0.29±0.02*0.37±0.02**0.42±0.03**0.56±0.04**

    圖1 ADM聯(lián)合SLTP對(duì)Bc1-2基因表達(dá)影響

    圖2 ADM聯(lián)合SLTP對(duì)Fas基因表達(dá)影響M.DNA Marker;A.空白對(duì)照組;B.ADM組;C.ADM+低劑量SLTP組; D.ADM+中劑量SLTP組;E.ADM+高劑量SLTP組

    4 討論

    乳腺癌是發(fā)生在乳腺腺上皮組織的惡性腫瘤,目前已成為威脅女性健康的常見(jiàn)腫瘤之一[4、5]。大多患者通過(guò)乳腺癌根治術(shù)治療,但由于乳腺癌細(xì)胞之間連接松散,易脫落,可隨血液或淋巴液播散全身,形成轉(zhuǎn)移,危及生命。對(duì)于無(wú)法采用手術(shù)治療的患者或術(shù)后恢復(fù)的患者往往輔助化療治療腫瘤。化療藥物在殺滅腫瘤細(xì)胞同時(shí)損傷正常組織細(xì)胞,因此提高化療藥物的敏感性至關(guān)重要,在保證治療效果的同時(shí)又降低了化療藥物毒副作用。細(xì)胞的無(wú)限制生長(zhǎng)可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生,其原因是細(xì)胞的過(guò)度增殖和細(xì)胞凋亡的減少,因此調(diào)控抗凋亡基因及凋亡基因的表達(dá)成為了腫瘤治療中的一個(gè)潛在的靶點(diǎn)。Bcl-2基因最早在研究B細(xì)胞淋巴瘤中發(fā)現(xiàn)的,其位于18q21,具有明顯的抑制細(xì)胞凋亡的作用,是Bcl-2家族中最具代表的抗凋亡蛋白。其通過(guò)調(diào)控線粒體途徑、影響細(xì)胞膜跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、激活谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶、改變鈣離子分布等機(jī)制調(diào)控凋亡,因此,Bcl-2蛋白的表達(dá)情況可以在一定程度上反映細(xì)胞凋亡的程度[6-8]。實(shí)驗(yàn)研究表明Bcl-2等凋亡相關(guān)基因的異常表達(dá)是導(dǎo)致腫瘤化療耐受的重要原因之一[9-10]。因此藥物是否能有效抑制Bcl-2等凋亡相關(guān)基因的異常表達(dá),將能提高腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性,降低化療的抵抗。Fas蛋白是一種細(xì)胞膜表面受體蛋白,在細(xì)胞凋亡中起重要的作用,分子量為45kd,位于人染色體的10q24.1,與活化的T淋巴細(xì)胞表面的配體Fas-L蛋白結(jié)合,向細(xì)胞膜內(nèi)傳遞死亡信號(hào),誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[11]。

    本研究結(jié)果顯示:高中低劑量的SLTP分別與ADM合用可明顯抑制乳腺癌細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,提高ADM的藥物療效;并且SLTP能明顯上調(diào)Fas基因表達(dá),下調(diào)Bcl-2基因表達(dá),其作用效果比單用ADM效果明顯。表明SLTP可能通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2及Fas基因表達(dá)的平衡,增加腫瘤細(xì)胞對(duì)ADM的敏感性,促進(jìn)ADM誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞的凋亡。為SLTP應(yīng)用于乳腺癌的輔助化療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),然而其協(xié)同作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

    [1]馮洪錢(qián).民間獸醫(yī)本草[M].北京:科學(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社,1993:307-308.

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    [3]楊旭東,張 杰,董 凱.白毛藤總苷誘導(dǎo)人食管癌細(xì)胞Ec-9706凋亡及其作用機(jī)制的研究[J].牡丹江醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2011,32(1):7-9.

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    黑龍江省中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥科研項(xiàng)目(No.ZHY10-W71);牡丹江醫(yī)學(xué)院科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(No.ZS201314)

    楊旭東,男,副教授。主要從事中藥的藥理與毒理研究。

    ▲通訊作者張杰,女,碩士。主要從事中藥的藥理與毒理研究。E-mail:zhangjie03mdj@126.com

    1.黑龍江省牡丹江醫(yī)學(xué)院(157011);2.黑龍江省牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院(157011)

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