可溶性環(huán)氧化物水解酶抑制劑在TGF-β1誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用*

郭亞男，楊海波，趙蔭濤，劉 源，李 凌，周巖強(qiáng)

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科 鄭州 450052

可溶性環(huán)氧化物水解酶抑制劑在TGF-β1誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用*

郭亞男，楊海波#，趙蔭濤，劉 源，李 凌，周巖強(qiáng)

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科 鄭州 450052

#通信作者，男，1975年1月生，博士，教授，研究方向：心血管病介入治療，E-mail：yanghaibo1975@126.com

可溶性環(huán)氧化物水解酶抑制劑；內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化；臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；心肌纖維化

目的：觀察可溶性環(huán)氧化物水解酶抑制劑t-AUCB對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EndMT)的影響。 方法：采用t-AUCB(50 μmol/L)預(yù)處理HUVEC 40 min后，用TGF-β1(10 μg/L)誘導(dǎo)HUVEC 24 h，采用Western blot法檢測(cè)Smad2/3的磷酸化水平；誘導(dǎo)72 h后，光鏡觀察細(xì)胞形態(tài)的變化，采用CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活性，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物(CD31)、間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物(collagen Ⅰ、 collagen Ⅲ、vimentin)及EndMT中重要的下游轉(zhuǎn)錄因子(snail1、twist1、twist2、ZEB1)mRNA的表達(dá)。同時(shí)設(shè)TGF-β1和t-AUCB單獨(dú)作用組。結(jié)果：光鏡下，TGF-β1組細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)楠M長(zhǎng)形，細(xì)胞間隙疏松，TGF-β1+t-AUCB組、t-AUCB組細(xì)胞形態(tài)正常。TGF-β1組細(xì)胞CD31 mRNA表達(dá)下調(diào)，collagen Ⅰ、 collagen Ⅲ、vimentin mRNA表達(dá)上調(diào)，snail1、twist1、twist2、ZEB1 mRNA表達(dá)上調(diào),Smad2及Smad3蛋白磷酸化水平升高(P<0.05)。與TGF-β1組比較，TGF-β1+t-AUCB組、t-AUCB組上述指標(biāo)的表達(dá)均有一定程度的逆轉(zhuǎn)(P<0.05)。結(jié)論：t-AUCB可通過(guò)抑制內(nèi)皮細(xì)胞的EndMT而發(fā)揮抗纖維化作用。

creased(P<0.05). Compared with those of TGF-β1 group, the indexes mentioned above in TGF-β1+t-AUCB group and t-AUCB group showed reversed effect to a certain extent(P<0.05).Conclusion: t-AUCB has an anti-fibrosis effect on the HUVEC by inhibiting the progress of EndMT.

心肌纖維化是由各種病理情況下心肌成纖維細(xì)胞的過(guò)度增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)度沉積造成的，表現(xiàn)為心肌微毛細(xì)血管密度的降低和心臟結(jié)構(gòu)的改變[1]，是臨床上多種疾病包括心肌缺血、心肌病、高血壓、糖尿病等常見(jiàn)的并發(fā)癥和共同的病理表現(xiàn)。目前臨床上尚無(wú)特異性的抗心肌纖維化治療藥物[2],因此尋找特異性的抗心肌纖維化藥物,減少心肌重構(gòu)成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。研究[3]表明，心肌成纖維細(xì)胞除了來(lái)源于固有的成纖維細(xì)胞及祖細(xì)胞外，還可由骨髓來(lái)源的循環(huán)纖維細(xì)胞、單核細(xì)胞、周細(xì)胞及上皮細(xì)胞通過(guò)內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(endothelial-mesenchymal transition，EndMT)等轉(zhuǎn)化而來(lái),EndMT在心肌纖維化中的作用受到越來(lái)越多的重視[4]。多種信號(hào)通路可以調(diào)節(jié)EndMT的發(fā)生，其中TGF-β1/Smads信號(hào)通路是研究最為深入的一種[5]?？扇苄原h(huán)氧化物水解酶抑制劑(soluble epoxide hydrolase inhibitor，sEHI)與多種心血管疾病密切相關(guān)，它具有抗高血壓[6]、減少心肌缺血再灌注損傷[7]、調(diào)節(jié)血脂[8]及抗心肌纖維化等作用。作者用TGF-β1誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)發(fā)生EndMT，并觀察sEHI干預(yù)對(duì)這一過(guò)程的影響，探討sEHI與EndMT的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及主要儀器、試劑

1.1.1 細(xì)胞 細(xì)胞株HUVEC-12購(gòu)自YRGene(NC006)，用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞貼壁約80%后用2.5 g/L胰蛋白酶消化并傳代。實(shí)驗(yàn)前將細(xì)胞置于含有體積分?jǐn)?shù)0.2%胎牛血清、0.1 g/L肝素及DMEM的無(wú)血清培養(yǎng)基中進(jìn)行6 h的饑餓處理。

1.1.2 主要儀器、試劑 t-AUCB(sEHI)購(gòu)自Cayman公司(分子式：C24H32N2O4，純度≥99%，貨號(hào)16568)，取4.12 mg t-AUCB溶解于1 mL二甲基亞砜(DMSO)中配制實(shí)驗(yàn)所用母液(10 mmol/L)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中DMSO在液體中的濃度低于0.02%。TGF-β1購(gòu)自美國(guó)PEPROTECH公司，ECGS購(gòu)自美國(guó)ScienCell公司，細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒CCK-8購(gòu)自日本同仁化學(xué)；信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子及其磷酸化分子抗體Smad2、Smad3、 p-Smad2、p-Smad3購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司。多功能微孔板檢測(cè)系統(tǒng)SynergyHT購(gòu)自美國(guó)BioTek公司，紫外分光光度計(jì)NANODROP 2000c購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司，反轉(zhuǎn)錄儀Veriti 96 well Thermal Lycler購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀Light Lycler 480購(gòu)自瑞士Roche公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分為3組，以僅用饑餓液持續(xù)培養(yǎng)的HUVEC作空白對(duì)照。TGF-β1誘導(dǎo)組：用含有TGF-β1(10 μg/L)的饑餓液持續(xù)培養(yǎng)HUVEC；t-AUCB組：HUVEC采用t-AUCB(50 μmol/L)預(yù)處理40 min后，繼續(xù)采用含有TGF-β1(10 μg/L)與t-AUCB(50 μmol/L)的饑餓液持續(xù)培養(yǎng)；t-AUCB組：?jiǎn)斡煤衪-AUCB(50 μmol/L)的饑餓液持續(xù)培養(yǎng)HUVEC。培養(yǎng)24 h后，測(cè)定各組細(xì)胞中Smad2/3蛋白磷酸化水平；培養(yǎng)72 h后，進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)觀察，并檢測(cè)細(xì)胞活性及EndMT相關(guān)因子mRNA的表達(dá)水平。

1.3 細(xì)胞活性檢測(cè) 采用CCK-8試劑盒進(jìn)行細(xì)胞活性檢測(cè)。細(xì)胞分組處理后，棄去培養(yǎng)基，在96孔板中加入含10 μL CCK-8的無(wú)胎牛血清培養(yǎng)基100 μL，于培養(yǎng)箱中孵育2.0～2.5 h，然后用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)450 nm處的OD值。每組5孔。細(xì)胞活性=實(shí)驗(yàn)組OD/空白對(duì)照OD×100%。

1.4 Smad2/3磷酸化水平的檢測(cè) 冰上裂解細(xì)胞10 min，置于1.5 mL離心管中，超聲裂解儀5 kHz裂解10～15 s，4 ℃12 000 r/min離心15 min，將上清液移至離心管中，BCA定量檢測(cè)蛋白濃度并將蛋白濃度調(diào)整一致后置于煮沸儀上將其變性。每組樣本混勻后取10 μL行100 g/L SDS-PAGE凝膠電泳，檢測(cè)內(nèi)參GAPDH，根據(jù)OD值調(diào)整上樣量，使其與GAPDH的OD值保持一致，之后每組以校正后的上樣量進(jìn)行凝膠電泳，將蛋白以恒壓100 V 90 min后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用含50 g/L脫脂奶粉的TBST進(jìn)行封閉，然后加一抗(p-Smad2、p-Smad3、Smad2、Smad3，抗體稀釋度均為11 000)于4 ℃環(huán)境下孵育過(guò)夜，加入二抗室溫孵育1 h，再用TBST洗3次，放入熒光檢測(cè)儀中，應(yīng)用Odyssey圖像分析軟件檢測(cè)目的蛋白的OD值。以磷酸化蛋白與總蛋白表達(dá)水平的比值表示目的蛋白的磷酸化水平，以實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照磷酸化水平的比值表示該組目的蛋白的磷酸化水平。

1.5 EndMT相關(guān)因子mRNA表達(dá)水平的檢測(cè) 使用Trizol試劑按步驟提取細(xì)胞總RNA，取總RNA大約5 μL，以GAPDH為內(nèi)參，應(yīng)用Light Lycler 480實(shí)時(shí)定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，按照說(shuō)明書(shū)操作，測(cè)定snail1、E盒結(jié)合鋅指蛋白1(zinc finger E-box binding homeobox 1，ZEB1)、扭曲蛋白(twist)、Ⅰ型膠原蛋白(collagen Ⅰ)、Ⅲ型膠原蛋白(collagen Ⅲ)、波形蛋白(vimentin)、CD31 mRNA的表達(dá)。引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。以目的mRNA與內(nèi)參表達(dá)量的比值表示目的mRNA的相對(duì)表達(dá)水平，以實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照相對(duì)表達(dá)水平的比值表示該組目的mRNA的表達(dá)水平。

表1 引物序列

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，3組間各指標(biāo)的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q法(方差齊)或Dunnett′s T3(方差不齊)檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 3組細(xì)胞活性的比較 TGF-β1組、TGF-β1+t-AUCB組、t-AUCB組細(xì)胞活性分別為(98.2±9.6)%、(99.1±13.2)%、(98.4±6.8)%，3組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.989，P=0.011)。

2.2 3組細(xì)胞形態(tài) 光鏡下，空白對(duì)照細(xì)胞間連接緊密，呈鵝卵石樣。TGF-β1組細(xì)胞變狹長(zhǎng)形，連接較松散。TGF-β1+t-AUCB組細(xì)胞形態(tài)為鵝卵石樣，連接較緊密。t-AUCB組細(xì)胞形態(tài)與空白對(duì)照相似(圖1)。

2.3 3組細(xì)胞Smad2/3蛋白的磷酸化水平 見(jiàn)圖2、表2。

A:空白對(duì)照;B:TGF-β1組;C:TGF-β1+t-AUCB組;D:t-AUCB組。圖1 不同處理因素處理后HUVEC細(xì)胞的形態(tài)(×400)

1：空白對(duì)照；2：TGF-β1;C:TGF-β1+t-AUCB組;D:t-AUCB組。圖2 3組細(xì)胞Smad2/3蛋白磷酸化水平的檢測(cè)

表2 3組細(xì)胞Smad2/3蛋白的磷酸化水平

*:與TGF-β1組比較，P<0.05。

2.4 3組細(xì)胞EndMT相關(guān)因子的表達(dá) 見(jiàn)表3、4。

表3 3組EndMT過(guò)程中內(nèi)皮和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物mRNA的表達(dá)

*:與TGF-β1組比較，P<0.05。

表4 4組EndMT過(guò)程中重要下游轉(zhuǎn)錄因子mRNA的表達(dá)

*:與TGF-β1組比較，P<0.05；#:與t-AUCB組比較，P<0.05。

3 討論

心肌纖維化是由各種病理情況下心肌成纖維細(xì)胞的過(guò)度增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)度沉積造成的，易引起心室壁順應(yīng)性及舒張功能的下降，最終可使心肌收縮功能受損而引起心力衰竭[9]。研究[3]表明，心肌成纖維細(xì)胞除了來(lái)源于固有的成纖維細(xì)胞及祖細(xì)胞外，還可由骨髓來(lái)源的循環(huán)纖維細(xì)胞、單核細(xì)胞、周細(xì)胞及上皮細(xì)胞等通過(guò)EndMT轉(zhuǎn)化而來(lái)。相關(guān)研究[10]表明，經(jīng)上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來(lái)的成纖維細(xì)胞占成纖維細(xì)胞總數(shù)的30%左右。在EndMT過(guò)程中，內(nèi)皮細(xì)胞逐漸失去極性和緊密連接的特性而變成狹長(zhǎng)的梭形，且細(xì)胞間的連接變得疏松[11]。多種信號(hào)通路可以調(diào)節(jié)EndMT的發(fā)生，其中TGF-β1/Smads信號(hào)通路是研究最為深入的一種[5]。TGF-β1首先與胞外的受體結(jié)合從而引起Smad2/3磷酸化，然后磷酸化Smad2/3再與Smad4結(jié)合成復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核，與核內(nèi)特異的DNA片段結(jié)合，調(diào)節(jié)ZEB1、snail、twist等下游轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)[12]，從而促進(jìn)EndMT的發(fā)生。sEHI與多種心血管疾病密切相關(guān)，它具有抗高血壓[6]、減少心肌缺血再灌注損傷[7]、調(diào)節(jié)血脂[8]及抗心肌纖維化等作用。Xu等[13]發(fā)現(xiàn)sEHI可以通過(guò)阻斷核因子κB而發(fā)揮抗心肌纖維化的作用。Sirish等[10]的研究證明sEHI可顯著抑制心肌梗死后C57BL/6j小鼠的心肌纖維化并改善小鼠的心功能。然而sEHI在EndMT中的作用尚無(wú)人報(bào)道。因此，作者觀察了t-AUCB(一種sEHI)干預(yù)對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的EndMT過(guò)程中HUVEC細(xì)胞活性及相關(guān)因子表達(dá)的影響，探討sEHI在EndMT中的作用。

因Smad2及Smad3的磷酸化發(fā)生在較早期，在下游基因出現(xiàn)改變之前即有變化，而且預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也支持TGF-β1刺激HUVEC 12 h后Smads信號(hào)通路的磷酸化水平較高，故該實(shí)驗(yàn)中選擇在干預(yù)細(xì)胞24 h后檢測(cè)Smad2/3磷酸化水平，選擇在干預(yù)細(xì)胞72 h后檢測(cè)下游基因的表達(dá)及細(xì)胞形態(tài)。預(yù)實(shí)驗(yàn)中作者選擇了多個(gè)t-AUCB藥物濃度，結(jié)果提示100 μmol/L t-AUCB干預(yù)可使細(xì)胞活性顯著降低，而藥物濃度≤50 μmol/L則無(wú)此影響，因此作者選擇50 μmol/L的t-AUCB進(jìn)行了后續(xù)實(shí)驗(yàn)。該研究結(jié)果表明，TGF-β1可引起HUVEC Smad2及Smad3蛋白的磷酸化水平顯著升高，促進(jìn)HUVEC細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)化，表現(xiàn)為內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物CD31 mRNA表達(dá)下調(diào)，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物collagen Ⅰ、collagen Ⅲ、vimentin mRNA表達(dá)上調(diào)，而EndMT下游轉(zhuǎn)錄因子snail1、twist1、twist2、ZEB1 mRNA的表達(dá)均顯著升高。TGF-β1與t-AUCB聯(lián)合干預(yù)后，HUVEC細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程部分被逆轉(zhuǎn)。

綜上所述，作者認(rèn)為，t-AUCB可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HUVEC的EndMT，為t-AUCB在抗心肌纖維化治療中的臨床應(yīng)用提供了更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但EndMT涉及多條信號(hào)通路及下游轉(zhuǎn)錄因子，該研究尚未就t-AUCB對(duì)其他信號(hào)通路的影響進(jìn)行研究，同時(shí)也未能在動(dòng)物模型中進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)，因此還需進(jìn)一步完善實(shí)驗(yàn)方案，以明確其作用機(jī)制。

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(2016-06-23收稿 責(zé)任編輯王 曼)

Effect of soluble epoxide hydrolase inhibitor on endothelial-to-mesenchymal transition of human umbilical vein endothelial cells induced by TGF-β1

GUOYanan，YANGHaibo，ZHAOYintao，LIUYuan，LILing，ZHOUYanqiang

DepartmentofCardiology,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

soluble epoxide hydrolase inhibitor;endothelial-to-mesenchymal transition;HUVEC;myocardial fibrosis

Aim: To observe the effect of soluble epoxide hydrolase inhibitor t-AUCB on TGF-β1 induced endothelial-to-mesenchymal transition(EndMT) of human umbilical vein endothelial cell(HUVEC). Methods: The HUVEC were pretreated by t-AUCB(50 μmol/L) for 40 min,then were induced by TGF-β1(10 μg/L) for 24 h,and Western blot was used to detect the phosphorylation levels of Smad2/3; after 72 h, light microscope was used to observe cell morphology, CCK-8 kit was used to test cell viability, and Real-time PCR was used to determine the mRNA expressions of epithelial marker(CD31) and mesenchymal markers(collagen Ⅰ,collagen Ⅲ,vimentin), as well as the key downstream transcription factors(snail1,twist1,twist2,ZEB1). TGF-β1 group and t-AUCB group were set.Results: The cells in TGF-β1 group changed into a long and narrow shape with intercellular porosis, while the cells in TGF-β1+t-AUCB group and t-AUCB group had normal forms. In TGF-β1 group,CD31 mRNA expression was down-regulated, but those of collagen Ⅰ, collagen Ⅲ, vimentin,snail1,twist1,twist2,and ZEB1 were up-regulated,and Smad2 and Smad3 protein phosphorylation levels in---------------------

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.02.014

R542.2+3

*鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院院內(nèi)青年創(chuàng)新基金項(xiàng)目