rhMG53蛋白對小鼠創(chuàng)傷性腦損傷的保護作用*

黃團結(jié)，馬珊珊#，程 田，邢 衢，程 康，石振慶，張 濤，劉雯雯，許 玲，楊 波，

關(guān)方霞1,2)#

1)鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院干細(xì)胞研究室 鄭州 450001 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院干細(xì)胞研究室 鄭州 450052

rhMG53蛋白對小鼠創(chuàng)傷性腦損傷的保護作用*

黃團結(jié)1)，馬珊珊1)#，程 田2)，邢 衢1)，程 康1)，石振慶1)，張 濤1)，劉雯雯1)，許 玲1)，楊 波2)，

關(guān)方霞1,2)#

1)鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院干細(xì)胞研究室 鄭州 450001 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院干細(xì)胞研究室 鄭州 450052

#通信作者：關(guān)方霞，女，1969年2月生，博士，教授，研究方向：干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)，E-mail：guanfangxia@126.com；馬珊珊，女，1984年5月生，博士，副教授，研究方向：干細(xì)胞與神經(jīng)功能修復(fù)，E-mail：mashanshan84@163.com

MG53蛋白；小鼠；創(chuàng)傷性腦損傷

目的：探討重組人MG53(rhMG53)蛋白對小鼠創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)的保護作用。方法：采用自由落體打擊法建立小鼠TBI模型，將造模小鼠隨機分為TBI組和TBI+MG53組，每組21只。造模術(shù)后第1、3、7、14、21、28天檢測小鼠體重變化并進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分(mNSS)；術(shù)后第3天，通過Western blot檢測腦組織中MG53蛋白的表達(dá)，干濕重法檢測小鼠腦含水量，ELISA法檢測血清中SOD和MDA含量；術(shù)后第27天，采用新事物識別實驗檢測小鼠認(rèn)知功能；術(shù)后第28天，通過強迫游泳實驗檢測小鼠抑郁情況，CV染色檢測腦損傷體積，qRT-PCR檢測小鼠腦組織中神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF和NGF mRNA的表達(dá)。結(jié)果：MG53能夠遷移并分布于腦損傷部位；與TBI組相比，TBI+MG53組小鼠體重增加，mNSS降低，抑郁程度減輕，認(rèn)知功能改善，血清中SOD的表達(dá)增加，MDA含量降低，同時腦含水量減少，腦損傷體積減小，損傷部位BDNF和NGF mRNA的表達(dá)增強(P均<0.05)。結(jié)論：外源rhMG53蛋白對TBI小鼠有明顯的保護作用。

創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury，TBI)是由外力引起的大腦損傷[1-2]。TBI后引發(fā)的炎癥和缺氧可進(jìn)一步引起繼發(fā)性腦損傷[3-5]。TBI是目前致死和致殘的主要病因之一，現(xiàn)今仍未發(fā)現(xiàn)行之有效的治療方法，尋求新型、快速修復(fù)腦損傷并改善神經(jīng)功能的有效藥物和靶點顯得極為迫切。Mitsugumin53(MG53)蛋白是一種骨骼肌和心肌特異表達(dá)的Tripartite motif(TRIM)家族蛋白[6]。研究[7-8]發(fā)現(xiàn)，外源rhMG53蛋白能夠治療心肌梗死和肌營養(yǎng)不良癥；外源rhMG53蛋白能定位于損傷部位，對多種非肌細(xì)胞(上皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞等)損傷和急性組織損傷(肺損傷、腎損傷等)發(fā)揮保護作用。已有研究[9]顯示rhMG53能夠改善阿爾茨海默鼠的行為能力、延緩衰老。作者觀察了外源rhMG53蛋白對TBI模型鼠的治療效果。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 rhMG53蛋白由美國俄亥俄州州立大學(xué)麻建杰教授贈送，小鼠腦立體定位儀和顱腦打擊器購于瑞沃德公司，RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒購置于TaKaRa公司，動物組織蛋白提取試劑盒購于上海生工生物工程有限公司，血清SOD活性測定和MDA含量測定試劑盒購于南京建成生物公司，水合氯醛、生理鹽水、PBS、乙醇、絡(luò)合碘消毒劑、注射器、多聚甲醛等均為市售。

1.2 腦損傷模型的建立 采用自由落體打擊法建立小鼠TBI模型。小鼠經(jīng)水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉后，顱頂部備皮，絡(luò)合碘消毒劑消毒，固定于腦立體定位儀，于矢狀正中切開頭皮，暴露筋膜并鈍性分離，剝離顯露左側(cè)顱骨，于前囟后約1.5 mm、中線旁側(cè)1.5 mm，用牙科鉆小心鉆開3 mm骨窗，保證硬腦膜完整。然后調(diào)整顱腦打擊器，使直徑2.5 mm 20 g撞針正對骨窗中心，控制打擊深度2 mm，從20 cm處垂直打擊。造模成功標(biāo)準(zhǔn)為：打擊后，小鼠一過性四肢抽搐、呼吸暫停，但數(shù)秒后可自行緩解。術(shù)后止血，以骨蠟閉合骨窗，縫合頭皮。術(shù)后檢測小鼠呼吸、心跳，給予保溫處理，保持肛溫(37.0±0.5) ℃，直至小鼠清醒。

1.3 實驗動物及分組 清潔級雄性C57BL/6小鼠，10～12周齡，體重23～25 g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，適應(yīng)環(huán)境1周后按1.2方法造模。術(shù)中、術(shù)后如果發(fā)現(xiàn)動物死亡，立即給予補充，確保每組實驗小鼠21只。TBI組造模3 h后尾靜脈注射0.1 mL生理鹽水，1次/d，連續(xù)注射3 d。TBI+MG53組造模3 h后尾靜脈注射0.75 g/L rhMG53 0.1 mL(3 mg/kg),1次/d，連續(xù)注射3 d。

1.4 觀測指標(biāo)

1.4.1 體重檢測和mNSS評分 每組選定6只小鼠，于造模術(shù)后第1、3、7、14、21和28天固定時間稱量體重并做神經(jīng)功能缺損評分(modified neurological severity score，mNSS)，期間按時補充食物和水，定期更換墊料。根據(jù)mNSS評分量表[10]，采用雙盲法評判并記錄分值。mNSS評分標(biāo)準(zhǔn)從小鼠運動、感覺、平衡能力以及反射情況等方面進(jìn)行評估，分值0(正常)～18(最嚴(yán)重)。

1.4.2 小鼠腦內(nèi)MG53蛋白的檢測 術(shù)后第3天，水合氯醛麻醉小鼠(每組3只)，摘取新鮮大腦，蛋白提取和Western blot檢測方法參照宋及時等[9]的報道。其中一抗MG53按11 000、β-actin按12 000稀釋。

1.4.3 小鼠腦含水量檢測 術(shù)后第3天，麻醉小鼠(每組6只)，經(jīng)活體心臟采血(備用)后，摘取受損的左側(cè)新鮮半腦，迅速稱取半腦質(zhì)量，盡量避免大腦在空氣中水分的蒸發(fā)，得到濕重。然后將腦組織放入100 ℃烤箱，24 h后測得干重。腦含水量=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.4.4 小鼠血清SOD活性和MDA含量檢測 取1.4.3收集的新鮮血液，室溫靜置過夜后，2 000g離心5 min，收集上清。根據(jù)試劑盒說明書推薦方法使用酶標(biāo)儀檢測血清中SOD活性和MDA含量。

1.4.5 新事物識別實驗檢測小鼠認(rèn)知功能 術(shù)后第27天，每組選取6只小鼠，將小鼠放置在一個50 cm × 50 cm × 25 cm不透明箱子中，進(jìn)行環(huán)境適應(yīng)10 min。24 h后將2個相同體積、相同顏色的物體(4 cm×4 cm×4 cm紅色立方體)放入箱子中，讓小鼠探索10 min，然后將小鼠放入原來的籠子。1 h后，將其中1個紅色立方體用綠色球形物體(直徑4 cm)代替，再次將小鼠放置到此箱子中探索5 min。期間應(yīng)用錄像機記錄小鼠探索情況。此時紅色立方體為舊物體，而綠色球形物體為新物體，在電腦上分析小鼠探索新、舊物體所用時間，計算辨別指數(shù)。辨別指數(shù)=新物體所用時間/(新物體所用時間+舊物體所用時間)×100%。

1.4.6 強迫游泳實驗檢測小鼠抑郁情況 術(shù)后第28天，用1.4.5中6只小鼠做強迫游泳實驗：在一個圓柱形水容器中，放入清水(高度25 cm，直徑22 cm)，水溫(23±1)℃；將小鼠放入水中，用攝像機記錄6 min；在電腦上分析后4 min視頻，記錄小鼠游泳時間，漂浮或僅有一肢體微動不計入游泳時間。懸浮時間(s)=240-游泳時間(s)。

1.4.7 小鼠腦損傷體積的檢測 1.4.6實驗完成后，麻醉小鼠，用預(yù)冷的20 mL 0.01 mol/L PBS心臟灌注后取出新鮮腦組織于40 g/L多聚甲醛中固定，24 h后進(jìn)行梯度蔗糖脫水，72 h后腦組織沉底，經(jīng)OCT包埋后，使用冰凍切片機制作厚度為25 μm 的切片。按照Paxions和Waston小鼠腦立體定位圖譜，在小鼠病灶部位前后2 mm處，從頭至尾連續(xù)冠狀切片，每連續(xù)10張腦片取出1個，進(jìn)行CV染色。使用Image J軟件，結(jié)合比例尺，計算每個腦片中的缺損面積，計算大腦損傷體積。大腦損傷體積(mm3)=平均損傷面積×腦片數(shù)×10×0.03。

1.4.8 小鼠腦組織中腦源性營養(yǎng)神經(jīng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)和神經(jīng)生長因子(nerve growth factor,NGF)的表達(dá) 1.4.7實驗完成后，取小鼠腦組織材料，RNA提取和熒光定量PCR檢測方法同孟楠等[11]的報道，引物序列見表1。

表1 小鼠NGF、BDNF引物序列

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 21.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。兩組小鼠體重、mNSS評分的比較采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析，腦損傷、腦含水量、血清中SOD活性及MDA含量、抑郁情況、認(rèn)知功能和神經(jīng)營養(yǎng)因子mRNA表達(dá)的比較均采用兩獨立樣本t檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 兩組小鼠術(shù)后體重和mNSS評分 兩組小鼠術(shù)后體重變化情況見表2、3。從第14天，TBI+MG53組小鼠體重明顯高于TBI組，mNSS得分亦開始明顯低于TBI組。

表2 兩組小鼠術(shù)后體重的比較 g

F組間=38.998，F(xiàn)時間=63.470,F交互=4.939，P均<0.001。

表3 兩組小鼠術(shù)后mNSS評分的比較

F組間=88.235，F(xiàn)時間=221.706,F交互=10.353，P均<0.001。

2.2 兩組小鼠腦組織中MG53蛋白的表達(dá) 見圖1。術(shù)后第3天，MG53在TBI組小鼠腦組織中不表達(dá)，而在TBI+MG53組小鼠的腦組織中顯著表達(dá)。

圖1 兩組小鼠腦組織中MG53蛋白的檢測

2.3 兩組小鼠腦含水量的比較 術(shù)后第3天，TBI+MG53組小鼠腦含水量為(74.32±2.41)%，TBI組小鼠為(82.78±2.63)%，TBI+MG53組明顯低于TBI組(t=7.843，P<0.001)。

2.4 兩組小鼠血清中SOD活性和MDA含量的比較 見表4。術(shù)后第3天，TBI+MG53組小鼠血清中SOD活性高于TBI組，MDA含量較TBI組降低。

表4 術(shù)后第3天兩組小鼠血清中SOD活性和MDA含量的比較

2.5 兩組小鼠認(rèn)知功能和抑郁情況的比較 見表5。TBI+rhMG53組小鼠術(shù)后第27天辨別指數(shù)高于TBI組，術(shù)后第28天懸浮時間低于TBI組。

2.6 兩組小鼠腦損傷體積的比較 術(shù)后第28天，TBI+MG53組小鼠腦損傷體積小于TBI組，見表5。

2.7 兩組小鼠腦組織中神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)的比較

見表5，TBI+MG53組小鼠腦組織中BDNF和NGF mRNA的表達(dá)量均高于TBI組。

表5 兩組小鼠術(shù)后辨別指數(shù)、懸浮時間、腦損傷體積及腦組織中神經(jīng)營養(yǎng)因子mRNA表達(dá)的比較

3 討論

TBI的發(fā)病率和致殘率逐年提高，給人類健康帶來極大的危害[12]。研究[13]顯示MG53蛋白能參與神經(jīng)細(xì)胞的損傷修復(fù)。該研究以此為出發(fā)點，探究外源rhMG53蛋白對TBI小鼠的神經(jīng)保護作用。

目前最常用的腦外傷模型有自由落體打擊模型、皮層控制撞擊模型和液壓撞擊模型等。其中，自由落體打擊法是一種經(jīng)典、成熟的造模方法，它可以通過調(diào)整打擊物重量和打擊高度控制腦損傷的程度，制作方法簡易、穩(wěn)定性好、重復(fù)性高。因此，該實驗利用瑞沃德立體定位儀和顱腦打擊器，采用自由落體打擊法構(gòu)建小鼠TBI模型。

該實驗結(jié)果顯示，內(nèi)源性MG53在腦組織中不表達(dá)，但注射外源rhMG53后，rhMG53能夠選擇性到達(dá)腦損傷部位的神經(jīng)細(xì)胞中，提示MG53可能參與腦損傷的修復(fù)。進(jìn)一步研究顯示，與術(shù)前相比，兩組小鼠在術(shù)后第1天和第3天體重有所減輕、mNSS得分也在前3天最高，這一結(jié)果可能與術(shù)后的炎癥反應(yīng)有關(guān)，也與已有文獻(xiàn)[2]報道一致。TBI+MG53組小鼠在術(shù)后第14、21、28天時體重明顯高于TBI組，且mNSS評分明顯低于TBI組，說明MG53能提高TBI小鼠體重，減輕小鼠神經(jīng)功能缺損。

腦外傷的發(fā)生通常伴隨著腦內(nèi)水平衡紊亂，過多的液體聚集在受損的腦細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外間隙，導(dǎo)致腦水腫，進(jìn)而導(dǎo)致一系列的并發(fā)癥[14-15]。該實驗結(jié)果顯示，術(shù)后第3天TBI+MG53組小鼠腦含水量明顯低于TBI組，說明MG53能減輕TBI造成的腦水腫。在生化水平上，SOD的活性直接反映機體清除自由基的能力，而MDA的含量也能反映機體自由基堆積和脂質(zhì)過氧化損傷程度。作者發(fā)現(xiàn)，術(shù)后第3天，TBI+MG53組小鼠血清中SOD活性較TBI組明顯升高且MDA含量降低，說明MG53提高了小鼠抗氧化能力。

作者進(jìn)一步觀察rhMG53對TBI小鼠的長期(術(shù)后28 d)療效。研究結(jié)果顯示，術(shù)后第28天，TBI+MG53組小鼠大腦缺損體積明顯小于TBI組，而懸浮時間較TBI組小鼠顯著縮短，辨別指數(shù)升高；說明MG53能降低腦損傷體積，減輕TBI小鼠抑郁情況并提升認(rèn)知功能。

BDNF和NGF是神經(jīng)營養(yǎng)因子，它們表達(dá)量的高低直接決定腦損傷部位微環(huán)境的變化。作者利用熒光定量RT-PCR法檢測兩組小鼠術(shù)后第28天腦組織中BDNF和NGF mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TBI+MG53組小鼠二者的表達(dá)量均高于TBI組，說明MG53蛋白能改善受損大腦的微環(huán)境。

綜上所述，外源rhMG53蛋白能增加TBI小鼠的體重，改善小鼠神經(jīng)功能缺損，降低腦含水量和損傷體積，提高抗氧化水平，減少抑郁情況，提升認(rèn)知功能，同時促進(jìn)小鼠腦內(nèi)神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)，改善損傷部位微環(huán)境，對TBI小鼠具有神經(jīng)保護作用。

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(2016-09-19收稿 責(zé)任編輯王 曼)

Protective effect of rhMG53 protein on traumatic brain injury mouse model

HUANGTuanjie1),MAShanshan1),CHENGTian2),XINGQu1),CHENGKang1),SHIZhenqing1),ZHANGTao1),LIUWenwen1),XULing1),YANGBo2),GUANFangxia1,2)

1)StemCellLaboratory,SchoolofLifeSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001 2)StemCellLaboratory,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

MG53；mouse;traumatic brain injury

Aim: To investigate the protective effects of recombinant human MG53(rhMG53) protein on the mouse model of traumatic brain injury(TBI).Methods: A weight drop model was used to establish the mouse model of TBI,and model mice were randomly allocated into TBI group and rhMG53 treated group(TBI+MG53 group),21 mice in each group. On the 1st, 3ed, 7th, 14th, 21th, 28th day, the body weight was detected,at the same time mNSS score was used to observe the neurological deficits; on the 3ed day, Western blot was used to detect the expression of MG53 in brain tissue, dry wet weight method, to detect the content of brain water and ELISA, for detection of serum SOD and MDA content; After 27 or 28 days, the depression and cognitive function of mice were detected by forced swimming test and new thing recognition experiment, CV staining was used to observe the brain damage of the two groups and qRT-PCR, to analyze the expression of neurotrophic factor(BDNF and NGF) expression in brain tissue of each group.Results: rhMG53 could migrate and distribute in the area of brain injury; compared with the TBI group, injection of rhMG53 could increase the body weight, reduce the neurological deficit, alleviate depression and improve cognitive function of TBI mice(P<0.05); rhMG53 could increase the expression of SOD in serum and decrease the content of MDA(P<0.05),and reduce brain water content and the damage volume, increase mRNA expression of BDNF and NGF in the injury site(P<0.05). Conclusion: Exogenous rhMG53 protein has a significant protective effect on TBI mice.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.02.002

*國家自然科學(xué)基金資助項目 81601078,81471306；河南省高?？萍紕?chuàng)新團隊項目 15IRTSTHN022；河南省科技創(chuàng)新人才計劃項目154200510008；河南省國際人才合作項目 2016GH03，2016GH15

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