枯草芽孢桿菌精氨酸脫羧酶基因speA的表達(dá)與蛋白純化

曹寧，王亞娟，鐘杰，佟碩秋，吳擁軍*

（貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽550025）

枯草芽孢桿菌精氨酸脫羧酶基因speA的表達(dá)與蛋白純化

曹寧，王亞娟，鐘杰，佟碩秋，吳擁軍*

（貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽550025）

根據(jù)枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）BJ3-2的精氨酸脫羧酶（ADC）的編碼基因speA序列設(shè)計(jì)特異性酶切引物，克隆基因speA序列。測序結(jié)果顯示，基因speA全長為1 473 bp，編碼490個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量為58 ku?；騭peA克隆至原核表達(dá)載體，獲得重組菌pET28a-speA/BL21，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）結(jié)果顯示，1.0 mmol/L的異丙基β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）28℃誘導(dǎo)4 h，上清液和菌體均能表達(dá)出ADC蛋白，上清液經(jīng)純化、透析、冷凍干燥可獲得純度97%的ADC酶，酶聯(lián)免疫吸附檢測（ELISA）ADC酶活為16 780 U/mg。為speA基因的表達(dá)、純化及酶學(xué)性質(zhì)研究奠定了理論基礎(chǔ)。

枯草芽孢桿菌；精氨酸脫羧酶；表達(dá)；純化

生物胺（biogenic amine，BA）是一類具有生物活性、低分子質(zhì)量、含氮有機(jī)化合物的總稱。根據(jù)組成成分可分為單胺（酪胺、組胺、尸胺、苯乙胺、色胺等）和多胺（腐胺、精胺和亞精胺）兩大類[1]。生物胺可作為生物體合成荷爾蒙、核苷酸、蛋白質(zhì)的前體物質(zhì)，具有一定生理功能。但是過量攝入，則會(huì)引起諸如頭痛、惡心、心悸、血壓變化、呼吸紊亂等過敏反應(yīng)，嚴(yán)重的還會(huì)危及生命[2]。

生物胺的產(chǎn)生需具備游離的氨基酸和氨基酸脫羧酶，通過氨基酸脫羧酶催化使氨基酸脫羧而產(chǎn)生[3]。目前研究發(fā)現(xiàn)，氨基酸脫羧酶主要存在于芽孢桿菌屬、乳酸菌屬、埃希氏桿菌屬、變性菌屬、假單胞菌屬、沙門氏菌屬、志賀氏菌屬及一些檸檬酸細(xì)菌屬細(xì)菌，其中乳酸桿菌的催化脫羧作用最為突出[4]。

貴州地區(qū)水豆豉屬于典型的多菌混合細(xì)菌型自然發(fā)酵豆豉，主要參與發(fā)酵的微生物有芽孢桿菌屬、枝芽孢桿菌屬、產(chǎn)堿菌屬、腸球菌屬、叢毛單胞菌屬、乳酸菌屬和微球菌屬等，在這些微生物的發(fā)酵作用下形成風(fēng)味獨(dú)特的豆豉[5]。實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌型豆豉能夠有效分離出8種生物胺，分別是色胺、β-苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺和精胺。其中前發(fā)酵階段亞精胺含量最高，精胺次之，后發(fā)酵階段酪胺含量最高，且顯著高于其他生物胺2倍以上[6]。在枯草芽孢桿菌中生物胺合成只有一條途徑，起始于精氨酸，在精氨酸脫羧酶、胍基丁胺酶、亞精胺合酶和精胺合酶共同作用合成亞精胺或精胺[7-8]。精氨酸脫羧酶（arginine decarboxylase，ADC）作為胺合成的關(guān)鍵酶[9-10]對(duì)精胺和亞精胺的形成起著重要的作用。所以目前認(rèn)為控制食品中過量生物胺最有前景的方法是通過控制精氨酸脫羧酶的活性來控制生物胺的形成[7]。

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是中國農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)使用的一種重要工業(yè)酶制劑的生產(chǎn)菌，現(xiàn)已大量用于食品發(fā)酵行業(yè)[11]。本實(shí)驗(yàn)室從水豆豉樣品中分離獲得了B.subtilis BJ3-2菌株[12]。本研究對(duì)B.subtilisBJ3-2菌株中獲得的精氨酸脫羧酶（arginine decarboxylase ADC）基因speA序列進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增，通過

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種和質(zhì)粒

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）BJ3-2、大腸桿菌（Escherichiacoli）DH5α：本實(shí)驗(yàn)室保藏菌株；表達(dá)載體pET28a、宿主菌大腸桿菌（Escherichia coli）BL21（DE3）：德國默克（中國）公司。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑

LB培養(yǎng)基：配制方法參考文獻(xiàn)[13]。

T4 DNA連接酶、溶菌酶、基因組DNA提取試劑盒：美國Promega公司；脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleotide triphosphate，dNTP）、DL2000 DNA Marker、rTaqDNA聚合酶、蛋白質(zhì)Marker、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG）、限制性核酸內(nèi)切酶、DNA Ligation Kit Ver.2.1連接試劑盒：TaKaRa（大連）公司；氨芐青霉素（ampicillin，Amp）、卡拉霉素（kanamycin，Kan）：北京索萊寶科技有限公司；E.Z.N.A.TMGelExtraction Kit、E.Z.N.A.TM Plasmid Mini KitⅠ：美國Omega公司；考馬斯亮藍(lán)R-250、精氨酸脫羧酶（ADC）酶聯(lián)免疫分析試劑盒：上海生工生物工程有限公司；His.Bind Purification Kit試劑盒：美國Novagen公司；咪唑（純度99%）：上海展云化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TGL-161高速臺(tái)式離心機(jī)、MyCycler PCR儀、Gel Doc XR凝膠成像系統(tǒng)：美國Bio-Rad公司；Biosafer-10D真空冷凍干燥機(jī)：美國Thermo公司。SW-CJ-1FD標(biāo)準(zhǔn)型凈化工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；GMSX-280高壓滅菌鍋：英國阿斯太歐（Astell）公司；SHZ-82A氣浴恒溫振蕩器：江蘇榮華儀器制造有限公司；DYCZ-25D小型垂直電泳槽（SDA-PAGE電泳槽）、DYY-4型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀：北京市六一儀器廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 基因組DNA的提取

挑選B.subtilisBJ3-2的單菌落，接種到5 mL LB液體培養(yǎng)基中37℃、180 r/min過夜培養(yǎng)，按照Promega公司的革蘭氏陽性細(xì)菌中基因組提取試劑盒說明書提取B.subtilis BJ3-2全基因組。

1.3.2 PCR擴(kuò)增精氨酸脫羧酶基因

根據(jù)枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）BJ3-2的speA基因序列，設(shè)計(jì)合成含BamHI引物PF：CGCGGATCCATGTCTCA ACATGAAACACCC和含XhoI引物PR：CCGCTCGAGTT GAATTGCTTTTTGTTCTTTG。采用PCR擴(kuò)增引物對(duì)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系：10μmol/μLPF和PR各0.4 μL、10×PCRbuffer2.0μL、dNTPMixture1.6μL、模板DNA1μL、rTaqDNA聚合酶0.1μL、ddH2O14.5μL，總體積20μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性40 s，55℃復(fù)性45 s，72℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后用0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.3 重組質(zhì)粒pGEM-T-speA的構(gòu)建及測序

PCR產(chǎn)物采用膠回收試劑盒進(jìn)行純化，純化后的PCR產(chǎn)物與pGEM-T連接，連接的過程及產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化過程按試劑盒的操作說明書進(jìn)行。將連接好的10 μL產(chǎn)物按照常規(guī)方法轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中。挑選陽性重組子，提取質(zhì)粒后進(jìn)行質(zhì)粒PCR鑒定。將陽性菌株提取質(zhì)粒后送至Life Technologies公司進(jìn)行測序[14]。序列結(jié)果通過網(wǎng)站http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi的BLAST軟件對(duì)基因序列進(jìn)行在線的比對(duì)和分析，鑒定所克隆的基因是否為目的基因。將測序鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pGEM-T-speA。

1.3.4 重組質(zhì)粒pET28a-speA的構(gòu)建

將質(zhì)粒pGEM-T-speA和表達(dá)載體pET28a分別用BamH I（37℃）和XhoI（37℃）雙酶切，對(duì)目的片段膠回收并純化，用T4 DNA連接酶將雙酶切產(chǎn)物和載體pET28a連接。按照試劑盒DNA Ligation Kit Ver.2.1中的說明書的使用方法進(jìn)行連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞E.coli BL21（DE3）中，劃線接種到含有Kan的LB固體平板上，37℃恒溫培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，同時(shí)接種到含有Kan（50 μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)過夜。將陽性菌株提取質(zhì)粒DNA后進(jìn)行酶切鑒定。

1.3.5 重組蛋白精氨酸脫羧酶的表達(dá)

將重組菌pET28a-speA/BL21和pET28a/BL21分別接種于5 mL含Kan（50 μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min培養(yǎng)至OD600nm=0.4～0.6，用終濃度為1 mmol/L的IPTG，28℃、180 r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h。取1 mL菌液4 000 r/min離心收集菌體，加入500μL的pH7.4磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffered saline，PBS）溶液重懸后進(jìn)行超聲波破碎（破碎條件：冰浴、200 MHz、超聲3 s，間隔2 s）30 min，10 000 r/min離心10 min，收集上清液即為重組蛋白精氨酸脫羧酶。分別取20 μL上清液和超聲沉淀上清液進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamidegelelectrophoresis，SDS-PAGE）檢測（分離膠濃度為15%濃縮膠濃度為5%），考馬斯亮藍(lán)R-250染色、脫色[11]，凝膠成像系統(tǒng)拍照并進(jìn)行灰度掃描分析。

1.3.6 重組蛋白的純化及濃度測定

參照His.Bind Purification Kit試劑盒說明書對(duì)重組蛋白精氨酸脫羧酶進(jìn)行純化，純化條件：依次采用濃度為10 mmol/L、50 mmol/L、200 mmol/L、500 mmol/L的咪唑溶液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，參考文獻(xiàn)[15]的方法進(jìn)行透析除鹽，將透析過后的蛋白質(zhì)樣品裝入無菌離心管內(nèi)，立即置于液氮中2 min，將其快速徹底凍透，轉(zhuǎn)入大氣壓為110 kPa的冷凍干燥機(jī)，4℃預(yù)冷15～30 min，放入樣品，啟動(dòng)真空泵，37℃干燥24～72 h，取出樣品即為純化后的重組蛋白。采用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白濃度[15]。

1.3.7 重組蛋白酶活的測定

參照ADC酶聯(lián)免疫分析試劑盒說明書對(duì)重組蛋白精氨酸脫羧酶活性進(jìn)行測定。以精氨酸脫羧酶標(biāo)準(zhǔn)試劑的酶活力作為橫坐標(biāo)，吸光度值OD450nm作為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將樣品所測得的OD450nm代入酶活力標(biāo)準(zhǔn)曲線直線回歸方程式，算出樣品酶活力后乘以稀釋倍數(shù)所得值即為樣品實(shí)際酶活力大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 B.subtilisBJ3-2基因組DNA的提取及PCR擴(kuò)增

以菌株B.subtilisBJ3-2基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增speA基因，經(jīng)0.7%的瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖1。由圖1可知，泳道1～4出現(xiàn)約1條帶，其中約1 400 bp處擴(kuò)增帶與預(yù)期的speA大小相符。

圖1 speA基因PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.1 Electrophoretogram of genespeAby PCR amplification

2.2 重組質(zhì)粒PCR的鑒定

圖2 重組質(zhì)粒PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.2Electrophoretogramof recombinant plasmid by PCR amplification

目的DNA片段進(jìn)行膠回收，連接T載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α。經(jīng)過菌落PCR鑒定為陽性的重組菌落接種到LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進(jìn)行質(zhì)粒PCR鑒定，結(jié)果（圖2）可知，在預(yù)期的1 400 bp處出現(xiàn)特異性條帶，說明目的基因已經(jīng)正確克隆至pGEM-T載體，重組載體命名為pGEM-speA。

2.3 目的基因的序列分析

測序結(jié)果表明，B.subtilisBJ3-2精氨酸脫羧酶基因speA大小為1 473 bp，編碼490個(gè)氨基酸，計(jì)算其蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為53.53 ku，等電點(diǎn)為5.29，酸性氨基酸19.6%，堿性氨基酸12.2%。與GenBank中登錄號(hào)為KJ561348序列完全一致，說明所克隆的基因正確。

2.4 重組表達(dá)載體pET28a-speA構(gòu)建及鑒定

以BamH I和XhoI分別雙酶切陽性質(zhì)粒pGEM-T-speA與pET28a載體，經(jīng)轉(zhuǎn)化、抗性篩后進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，結(jié)果見圖3。取1號(hào)菌過夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，結(jié)果見圖4。

圖3 pET28a-speA重組質(zhì)粒PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.3 Electrophoretogram of recombinant plasmid pET28a-speA by PCR amplification

由圖3可知，挑取得3個(gè)菌落均擴(kuò)增出均出現(xiàn)1條帶，其中約1400bp處擴(kuò)增帶與預(yù)期的speA大小相符，說明目的基因已正確克隆至pET28a載體中，重組質(zhì)粒命名為pET28a-speA。

圖4 pET28a-speA重組質(zhì)粒酶切鑒定Fig.4 Enzyme digestion identification of recombinant plasmid pET28a-speA

由圖4可知，酶切產(chǎn)物片段大小與克隆的基因大小相符。泳道2、3均酶切出兩個(gè)條帶，其中較小的條帶出現(xiàn)的位置大約在1 400 bp處，與目的基因（speA）序列大小一致。其中泳道3目的片段稍微偏大，可能由于瓊脂糖凝膠制備原因所致。為確定讀碼框是否正確，取2號(hào)泳道菌進(jìn)行測序，結(jié)果顯示序列長度為1473bp，同時(shí)在pET28a載體中的讀碼框也正確，這表明克隆的精氨酸脫羧酶基因與表達(dá)載體pET28a連接成功，即預(yù)期獲得重組表達(dá)載體pET28a-speA重組子。

2.5 目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)

將pET28a-speA/BL21（DE3）重組菌接種于含Kan（50μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基，28℃搖瓶大量培養(yǎng)，1.0mmol/L IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)后離心，分別取上清、沉淀及未誘導(dǎo)的細(xì)胞裂解液進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測，結(jié)果見圖5。由圖5可知，未添加誘導(dǎo)物的菌液蛋白基本不表達(dá)，泳道2、3和4號(hào)均出現(xiàn)顯著的蛋白條帶，說明ADC蛋白在上清、菌體內(nèi)都能表達(dá)。通過軟件Quantity One分析得出目的蛋白的分子大小約為58 ku，與推測的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量大小相當(dāng)。誘導(dǎo)表達(dá)的ADC蛋白菌體為包涵體形式表達(dá)，上清為可溶性表達(dá)且表達(dá)量更高，因此選取可溶性部分進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖5 蛋白小量誘導(dǎo)表達(dá)SDS-PAGE電泳圖Fig.5 Electrophoretogram of protein inducible expression by SDS-PAGE analysis

2.6 蛋白的純化

對(duì)pET28a-speA/BL21（DE3）重組菌進(jìn)行500 mL大量表達(dá)，取上清利用His純化試劑盒進(jìn)行過柱純化，純化后大部分雜蛋白被除去，結(jié)果如圖6所示。由圖6可知，純化結(jié)果表明，10～500 mmol/L咪唑洗脫均能獲得目的蛋白，其中200 mmol/L咪唑可洗脫獲得較高濃度的蛋白帶。選擇該濃度進(jìn)行剩余蛋白的洗脫，合并所有洗脫液進(jìn)行后續(xù)進(jìn)一步純化處理。

圖6 純化蛋白的SDS-PAGE電泳圖Fig.6 Electrophoretogram of purified protein by SDS-PAGE analysis

2.7 蛋白含量的測定

采用方法測定純化后重組蛋白含量，以牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，吸光度值OD595nm（Y）為縱坐標(biāo)，繪制牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出回歸方程為：Y=3.515 4X+0.002，相關(guān)系數(shù)為R2=0.998 4，按照回歸方程計(jì)算ADC蛋白質(zhì)含量為0.97 mg/mL，即純度為97%。

2.8 ADC酶活的檢測

選用酶聯(lián)免疫分析試劑盒對(duì)重組蛋白ADC酶活進(jìn)行檢測，以精氨酸脫羧酶標(biāo)準(zhǔn)試劑的酶活（X）為橫坐標(biāo)，吸光度值OD450nm（Y）為縱坐標(biāo)，繪制ADC酶標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出回歸方程為：Y=0.008 1X+0.036 4，R2=0.980 2，根據(jù)回歸方程計(jì)算ADC酶活為16 780 U/mg。

3 結(jié)論

枯草芽孢桿菌作為豆豉發(fā)酵過程中的主要菌種，本研究成功克隆獲得了B.subtilisBJ3-2精氨酸脫羧酶基因speA。以pET-28a作為表達(dá)載體，經(jīng)IPGT誘導(dǎo)表達(dá)，并經(jīng)15% SDS-PAGE電泳檢測分析，在200mmol/L咪唑處可洗脫獲得較高濃度蛋白，采用考馬斯亮藍(lán)法測其濃度為0.972mg/mL，即純度為97%。應(yīng)用ELISA法檢測精氨酸脫羧酶酶活為16 780 U/mg。通過對(duì)主效微生物枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的主要生物胺相關(guān)酶—ADC進(jìn)行表達(dá)純化以及酶活性研究，可以進(jìn)一步探索酶活性與生物胺的關(guān)聯(lián)性，以ADC活性作為指標(biāo)可以反映出發(fā)酵豆豉的品質(zhì)；同時(shí)通過對(duì)酶活性影響因素的研究，進(jìn)而達(dá)到控制發(fā)酵過程，從而降低生物胺提高發(fā)酵食品安全性的目的。

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Expression and purification of arginine decarboxylase genespeAofBacillus subtilis

CAO Ning,WANG Yajuan,ZHONG Jie,TONG Shuoqiu,WU Yongjun*
(College of Life Science,Guizhou University,Guiyang 550025,China)

Specific enzyme primers were designed according to the arginine decarboxylase(ADC)gene sequence ofBacillus subtilisBJ3-2,the gene speAwas cloned and obtained.The results of sequence analysis indicated that the full-length of genespeAwas 1 473 bp,which could encode 490 amino acids with deduced molecular mass of 58 ku.The genespeAwas cloned into prokaryotic expression vector to obtain recombinant strain pET28a-speA/BL21.The results of SDS-PAGE showed that the target protein was induced with 1.0 mmol/LIPTG at 28℃for 4 h,and the ADC protein could be expressed in supernatant fluid and bacteria.After purification,dialysis and freeze-drying,the ADC with 97%purity was obtained in supernatant fluid.The ADC activity was 16 780 U/mg by ELISA.The study laid a theoretical foundation for expression,purification and enzymatic properties of genespeA.

Bacillus subtilis;arginine decarboxylase;expression;purification

Q936

0254-5071（2017）03-0090-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.03.019

2016-12-20

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31260394/C200207）

曹寧（1989-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)樯锘瘜W(xué)與分子生物學(xué)。

*通訊作者：吳擁軍（1971-），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。大腸桿菌（Escherichia coli）BL21（DE3）進(jìn)行表達(dá)，獲得精氨酸脫羧酶，并對(duì)其進(jìn)行純化和酶活力的檢測對(duì)其ADC基因的研究會(huì)有助于進(jìn)一步了解多胺的合成途徑，可用于后期酶學(xué)性質(zhì)的研究，以期為實(shí)際生產(chǎn)中抑制ADC活性、間接控制腐胺、亞精胺和精胺等相關(guān)生物胺的合成提供理論依據(jù)。