高效液相色譜法測(cè)定飲料中的新紅、誘惑紅及赤蘚紅

李清偉，梁桂娟*，周祖亮

（貴州省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，貴州貴陽(yáng)550016）

高效液相色譜法測(cè)定飲料中的新紅、誘惑紅及赤蘚紅

李清偉，梁桂娟*，周祖亮

（貴州省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，貴州貴陽(yáng)550016）

利用高效液相色譜法測(cè)定飲料中的新紅、誘惑紅及赤蘚紅含量，確定了檢測(cè)條件為：Agilent C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，柱溫25℃，流動(dòng)相為乙酸銨-甲醇(92∶8,V/V)，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm。結(jié)果表明，新紅、誘惑紅及赤蘚紅在0～50 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(R2=0.999 8)，平均加樣回收率為91.0%～96.8%，平均相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.4%～2.9%，新紅、誘惑紅及赤蘚紅的檢出限分別為0.10 mg/kg、1.00 mg/kg及0.70 mg/kg。該方法快速準(zhǔn)確，適用于飲料中的新紅、誘惑紅及赤蘚紅含量的測(cè)定。關(guān)鍵詞：新紅；誘惑紅；赤蘚紅；高效液相色譜法；飲料；檢測(cè)

許多天然食品具有本身的色澤，這些色澤能促進(jìn)人的食欲，增加消化液的分泌，因而有利于消化和吸收，是食品的重要感官指標(biāo)。但是，天然食品色澤在加工保存過(guò)程中容易退色或變色，為了改善食品的色澤，人們常常在加工食品的過(guò)程中添加食用色素，以改善食品感官性質(zhì)。在很長(zhǎng)的一段時(shí)間里，由于人們沒(méi)有認(rèn)識(shí)到合成色素的危害，并且合成色素與天然色素相比較，具有色澤鮮艷、著色力強(qiáng)、性質(zhì)穩(wěn)定和價(jià)格便宜等優(yōu)點(diǎn)，許多國(guó)家在食品加工行業(yè)普遍使用合成色素。隨著社會(huì)的發(fā)展和人們生活水平的提高，越來(lái)越多的人對(duì)于在食品中使用合成色素會(huì)不會(huì)對(duì)人體健康造成危害提出了疑問(wèn)。與此同時(shí)，大量的研究報(bào)告指出[1-4]，幾乎所有的合成色素都不能向人體提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，某些合成色素會(huì)危害人體健康，誘發(fā)中毒甚至癌癥，故不能多用或盡量不用。世界各國(guó)尤其是西方發(fā)達(dá)國(guó)家不僅在色素對(duì)人體健康影響方面做了大量調(diào)查和研究，而且在食用色素的管理、合成色素的使用方面均有嚴(yán)格的規(guī)定，多種合成色素已被禁止或嚴(yán)格限量使用?，F(xiàn)在可以合法使用的食用合成色素品種已經(jīng)大為減少[5]。在世界各國(guó)使用合成色素最多時(shí)，品種多達(dá)100余種，日本曾批準(zhǔn)使用的合成色素有27種，現(xiàn)已禁止使用其中的16種。美國(guó)1960年允許使用的合成色素有35種，現(xiàn)僅剩下7種[6-7]。目前在大多數(shù)國(guó)家和地區(qū)，合成色素沒(méi)有被完全禁止使用，因此對(duì)合成色素的檢測(cè)仍然是食品檢測(cè)的一個(gè)重點(diǎn)[8-9]。目前報(bào)道的用于檢測(cè)食品中新紅、誘惑紅及赤蘚紅的方法很多[10-12]，而對(duì)于色素樣品的前處理一般費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不適合大批量色素樣品的處理。

本研究利用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）分析檢測(cè)飲料中的新紅、誘惑紅及赤蘚紅，利用固相萃取柱[13-15]優(yōu)化色素樣品前處理的方法，提高工作效率，以期為飲料中新紅、誘惑紅及赤蘚紅的檢測(cè)和調(diào)查提供良好的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

飲料樣品：市售；新紅、誘惑紅、赤蘚紅液體標(biāo)準(zhǔn)品（5 mL/支，1.00 mg/mL）：中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院。0.45 μm水相微孔濾膜：浙江力辰儀器科技有限公司。

甲醇（色譜純）：德國(guó)Merck KGaA公司；乙酸銨（色譜純）：上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；亞鐵氰化鉀、乙酸鋅等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

ME1002TE/02型電子天平（感量0.01 g）、LE438型PH計(jì)：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Agilent1260高效液相色譜儀（配有二極管陣列檢測(cè)器（diode-array detector，DAD））：安捷倫科技有限公司；tufboVap LV自動(dòng)氮吹儀：美國(guó)Biotage公司；Strata X-AW 33u固相萃取柱：美國(guó)Phenomenex公司。

1.3 方法

1.3.1 高效液相色譜條件

Agilent C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，柱溫35℃，二極管陣列檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm，梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫程序Table1 Gradient elution program

1.3.2 樣品前處理

稱取樣品20.00 g（精確至0.01 g），加入50 mL水并混勻，再加入質(zhì)量濃度為106 g/L亞鐵氰化鉀溶液5 mL和質(zhì)量濃度為220g/L乙酸鋅溶液5mL沉淀蛋白質(zhì)，混勻后用冰乙酸調(diào)節(jié)pH值至5.0，最后用水定容至100mL，振蕩搖勻，靜置30 min，取20 mL上清液，以不超過(guò)1 mL/min的流速過(guò)固相萃取柱，再用10mL水洗去柱內(nèi)殘留雜質(zhì)，待流干后用5 mL甲醇：氨水（95∶5，V/V）將柱內(nèi)保留的色素洗脫至氮吹管，于50℃氮?dú)獯蹈?，殘留物用水定容? mL，渦旋溶解，過(guò)0.45 μm水相微孔濾膜，濾液待上機(jī)分析。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液及標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

準(zhǔn)確移取適量質(zhì)量濃度為1 mg/mL新紅、誘惑紅及赤蘚紅標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用超純水稀釋成質(zhì)量濃度分別為1μg/mL、2 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)使用液。取標(biāo)準(zhǔn)品系列溶液分別進(jìn)樣10 μL，以峰面積（y）為縱坐標(biāo)，新紅、誘惑紅及赤蘚紅含量（x）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程。

1.3.4 色素含量計(jì)算

試樣中新紅、誘惑紅及赤蘚紅含量的計(jì)算公式如下：

式中：X為試樣中新紅、誘惑紅及赤蘚紅的含量，g/kg；c為樣液中新紅、誘惑紅及赤蘚紅的含量，μg/mL；V為最后定容體積，mL；m為試樣質(zhì)量，g；d為樣品稀釋比。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品及樣品溶液色譜圖的繪制

根據(jù)1.3.1節(jié)的色譜操作條件，得到標(biāo)準(zhǔn)品中的新紅、誘惑紅及赤蘚紅高效液相色譜圖見(jiàn)圖1。由圖1可知，所得新紅出峰時(shí)間為5.599 min、誘惑紅出峰時(shí)間為10.091 min及赤蘚紅出峰時(shí)間為14.338 min，色譜峰形對(duì)稱，基線平穩(wěn)，分離度好。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of mixed standard

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以峰面積（y）為縱坐標(biāo)，新紅、誘惑紅及赤蘚紅含量（x）為縱坐標(biāo)，繪制新紅、誘惑紅及赤蘚紅的標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖2。由圖2可知，新紅、誘惑紅及赤蘚紅標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程分別為y=20.742-0.809 3；y=18.042x-5.679 8；y=13.493x-4.3559，相關(guān)系數(shù)R2分別為1.000 0、0.999 6、0.999 6。結(jié)果表明，在0～50 μg/mL范圍內(nèi)二者線性關(guān)系良好。

圖2 新紅、誘惑紅及赤蘚紅標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curves of new red,fancy red and erythrosine

將標(biāo)準(zhǔn)品使用溶液逐級(jí)稀釋，以信噪比S/N=3時(shí)的濃度為能檢測(cè)的最低濃度，根據(jù)本方法中樣品的取樣量和定容體積，測(cè)得新紅的檢出限為0.10 mg/kg、誘惑紅的檢出限為1.00 mg/kg、赤蘚紅的檢出限為0.70 mg/kg。

2.3 回收率實(shí)驗(yàn)

精密稱取樣品20 g（精確至0.01 g），加入新紅標(biāo)液（1.00 mg/mL）20 μL，40 μL，80 μL（添加量分別為1 μg/mL、2 μg/mL、5 μg/mL），之后按1.3.2的前處理方法和1.3.1的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)水平平行測(cè)定3次，測(cè)定其回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of adding standard recovery rate experiments

由表2可知，檢測(cè)結(jié)果所得平均回收率為91.0%～96.8%，平均RSD為0.4%～2.9%，表示該方法準(zhǔn)確度高。

2.4 精密度實(shí)驗(yàn)

對(duì)10μg/mL的新紅標(biāo)準(zhǔn)品連續(xù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣10μL，根據(jù)峰面積計(jì)算結(jié)果RSD，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of precision experiments

由表3可知，檢測(cè)結(jié)果的平均RSD為0.91%，表明該檢測(cè)方法精密度良好。

2.5 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

精確吸取來(lái)自同一批原料的試樣，按上述測(cè)定方法平行測(cè)定6次，檢驗(yàn)方法的重現(xiàn)性，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of reproducibility experiments

由表4可知，檢測(cè)結(jié)果的平均RSD為2.8%，表明該方法重現(xiàn)性好。

2.6 樣品中新紅、誘惑紅及赤蘚紅含量的測(cè)定

抽檢市面上不同來(lái)源的飲料共38份，按1.3.1和1.3.2的儀器條件和前處理方法進(jìn)行上機(jī)測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有5份樣品含有新紅、誘惑紅或赤蘚紅，其余均為未檢出，檢出率為13.2%，測(cè)得值在0.008～0.014g/kg，均低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB2760—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)》飲料中規(guī)定的限量值：新紅0.05 g/kg；誘惑紅0.1 g/kg；赤蘚紅0.05 g/kg。

3 結(jié)論

國(guó)標(biāo)[16]中對(duì)色素樣品的前處理方法采用聚酰胺吸附法及液-液分配法，該方法存在實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)效率較低，不適合大批量色素樣品的處理。本研究建立了高效液相色譜法檢測(cè)飲料中的新紅、誘惑紅及赤蘚紅含量的方法，結(jié)果表明，本方法前處理簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確度和精密度高，檢出限低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，加標(biāo)回收率91.0%～96.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差＜5%，符合食品檢測(cè)的相關(guān)法規(guī)標(biāo)準(zhǔn)要求，能滿足對(duì)樣品快速準(zhǔn)確地檢測(cè)。

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Determination of new red,fancy red and erythrosine in drinks by HPLC

LI Qingwei,LIANG Guijuan*,ZHOU Zuliang
(Guizhou Institute of Product Quality Supervision and Determination,Guiyang 550016,China)

The contents of new red,fancyred and erythrosine in drinks were determined by high performance liquid chromatography.The determination conditions were determined as chromatographic column Agilent C18(150 mm×4.6 mm,5 μm)with ammonium acetate-water(92∶8,V/V)as mobile phase,column temperature 25℃,flowing rate 1.0 ml/min,injection volume 10 μL,detection wavelength 254 nm.The results showed that new red, fancy red and erythrosine showed good linear relationship in the range of 0-50 μg/ml(R2=0.999 8),the average recovery rate was 91.0%-96.8%,the relative standard deviation(RSD)was 0.4%-2.9%,and the detection limit of new red,fancy red and erythrosine was 0.10 mg/kg,1.00 mg/kg and 0.70 mg/kg.The method was quick and accurate for detection of the new red,fancy red and erythrosine contents in drinks.

new red;fancy red;erythrosine;HPLC;drinks;determination

O657.72

0254-5071（2017）03-0175-03

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.03.035

2016-11-25

李清偉（1980-），男，工程師，本科，研究方向?yàn)槭称贩治雠c檢測(cè)。

*通訊作者：梁桂娟（1972-），女，高級(jí)工程師，碩士，研究方向?yàn)槭称贩治雠c檢測(cè)。