嗎啡及可待因酶聯(lián)免疫檢測方法的研究

楊昌松，張林田，馮靜，王琳琛，孔祥雅，何方洋*

（1.北京勤邦生物技術(shù)有限公司，北京102206；2.汕頭出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東汕頭515041）

嗎啡及可待因酶聯(lián)免疫檢測方法的研究

楊昌松1，張林田2，馮靜1，王琳琛1，孔祥雅1，何方洋1*

（1.北京勤邦生物技術(shù)有限公司，北京102206；2.汕頭出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東汕頭515041）

通過對嗎啡分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，制備了嗎啡半抗原及人工抗原，通過免疫動物得到了嗎啡的單克隆抗體，建立了嗎啡及可待因間接競爭酶聯(lián)免疫檢測方法。該方法對火鍋底料和辣椒醬的檢出限分別為4.92 μg/kg、4.85 μg/kg，半抑制濃度(IC50)為0.7 μg/L，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為0.3～24.3 μg/L?？贵w與嗎啡、可待因的交叉反應(yīng)率分別為100%、150%。火鍋底料、辣椒醬樣品中平均添加回收率為80%～120%，變異系數(shù)＜15%。

嗎啡；可待因；酶聯(lián)免疫檢測；火鍋底料；辣椒醬

罌粟殼是罌粟科植物罌粟割取漿汁后的干燥成熟果殼，內(nèi)含嗎啡、可待因、蒂巴因、罌粟堿、那可汀等20多種生物堿[1]。嗎啡等在醫(yī)院可作為鎮(zhèn)痛藥使用，但若長期食用會成癮并出現(xiàn)乏力、犯困、發(fā)冷、面黃肌瘦，甚至損壞神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)，導(dǎo)致內(nèi)分泌失調(diào)[2-3]。在我國，罌粟殼是禁止在食品及調(diào)味品中添加使用的，但有少數(shù)商家為了達(dá)到盈利目的，在火鍋底料及調(diào)味料中添加罌粟殼，嚴(yán)重危害了消費(fèi)者的身體健康[4]。

檢測罌粟殼中生物堿的方法主要有化學(xué)顯色法、薄層層析檢測法、高效液相色譜檢測法和氣質(zhì)聯(lián)用色譜檢測法等[5-10]。這些方法各有特點(diǎn)，前兩者靈敏度和精密度均不高；后兩者雖有較高的靈敏度及精密度，但檢測成本高、操作復(fù)雜、不能現(xiàn)場操作。與之相比，利用免疫學(xué)原理發(fā)展起來的酶聯(lián)免疫方法具有專一性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡便、檢測成本低、可適合于大規(guī)模檢測等優(yōu)點(diǎn)，但國內(nèi)關(guān)于這種檢測方法的報(bào)道尚不多見。本研究通過化學(xué)合成具有抗原活性的嗎啡免疫抗原，成功獲得了高特異性、高親和性的嗎啡單克隆抗體，該單抗與可待因交叉反應(yīng)率達(dá)150%，同時開發(fā)了檢測火鍋底料及辣椒醬中嗎啡及可待因的酶聯(lián)免疫吸附檢測（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒，為檢測機(jī)構(gòu)和生產(chǎn)廠家提供了高效、快速的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

嗎啡、可待因、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、卵清蛋白（ovalbumin，OVA）、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）：美國Sigma公司；包被液（0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液pH 9.6）、洗滌液（含1%吐溫的0.02 mol/LPBS pH 7.6）、封閉液（含0.05%BSA的0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）pH 7.6）：北京化學(xué)試劑公司；8周齡的雌性Balb/C小鼠、無病原體羊：北京勤邦生物技術(shù)有限公司；火鍋底料、辣椒醬：市售。

1.2 儀器與設(shè)備

MK3酶標(biāo)儀：上海雷勃分析儀器有限公司；Costar酶標(biāo)板：北京諾博萊德科技有限公司；TDL-40B離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 抗原的制備

（1）半抗原的制備

取3-氟-4硝基苯胺20 mg，加2 mol/L的稀硫酸200 μL，加水，攪拌溶解，5℃，加入亞硝酸鈉18 mg，攪拌1 h，得到重氮鹽溶液；取嗎啡15 mg，加2 mL 0.1 mol/L的氫氧化鈉乙醇溶液溶解，加入到重氮鹽中，反應(yīng)2 h，停止反應(yīng)，離心分離，得到紅色固體化合物，加乙醇旋蒸，蒸干除去水分，加二氯甲烷：石油醚（1∶20，V/V）洗滌結(jié)晶得到半抗原產(chǎn)物。苯酚的羥基在空間的位置影響苯酚的能量和原子電荷密度，在它的作用下苯環(huán)的鄰、對位碳原子的負(fù)電荷比苯環(huán)碳原子高，親電試劑Me+與苯酚反應(yīng)形成鄰、對位的碳正離子中間體比間位碳正離子中間體穩(wěn)定[11]，嗎啡與重氮鹽鏈接位置如圖1所示。

圖1 嗎啡半抗原的合成Fig.1 Synthesis of morphine hapten

（2）免疫原的制備

取11 mg半抗原，溶解于1 mL純度99.9%的二甲基甲酰胺（dimethylformamide，DMF）中；稱取50 mg BSA，使之充分溶解在3.8 mL 0.1 mol/L PBS（pH 9.6）中，將溶解好的半抗原逐滴緩慢滴加到蛋白溶液中，并于室溫下攪拌24 h，用0.01 mol/L PBS 4℃透析3 d，透析袋截留分子質(zhì)量8 000～14 000 u，每8 h換3次透析液；分裝，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（3）包被原的制備

包被原的合成方法同免疫原的合成，載體蛋白為OVA，其他步驟相同。

1.3.2 單克隆抗體的制備及效價驗(yàn)證

將免疫原—嗎啡半抗原-BSA偶聯(lián)物與等量弗氏完全佐劑充分乳化，皮下注射6周齡的Balb/c小鼠，0.2 mL/只；每兩周換用弗氏不完全佐劑乳化加強(qiáng)免疫；最后一次加強(qiáng)免疫一周后采眼底靜脈血，有抑制且效價達(dá)到1∶10000以上時進(jìn)行腹腔注射0.1 mL免疫原溶液，3 d后取鼠脾臟與骨髓瘤細(xì)胞融合[12-13]。使用間接競爭酶聯(lián)免疫分析方法篩選陽性細(xì)胞上清液。建立穩(wěn)定分泌嗎啡單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。采用體內(nèi)誘生法，將滅菌石蠟油0.5 mL/只注入Balb/c小鼠（8周齡）腹腔內(nèi)，7 d后注射雜交瘤細(xì)胞5×105個/只于腹腔內(nèi)，7 d后采集腹水并使用辛酸-飽和硫酸銨法純化，得到嗎啡單克隆抗體溶液[14]，-20℃保存。

1.3.3 制備酶標(biāo)記抗體

用1.3.2步驟得到的嗎啡單克隆抗體免疫無病原體羊，得到羊抗鼠抗體，然后將羊抗鼠抗體與HRP偶聯(lián)，即得到酶標(biāo)記抗體。

1.3.4 優(yōu)選抗原包被濃度、單克隆抗體濃度，制備酶標(biāo)板

抗原稀釋倍數(shù)依次為：1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000；單克隆抗體稀釋倍數(shù)依次為：1∶20 000、1∶40 000、1∶80 000、1∶160 000；酶標(biāo)記抗體液的稀釋倍數(shù)為1∶1 000；測定波長為450 nm，分別測定0、0.3 μg/L質(zhì)量濃度的嗎啡標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值，并按如下公式計(jì)算百分吸光率（抑制率）：

在酶標(biāo)板包被100 μL/孔抗原包被液，37℃孵育2 h，隨后清洗酶標(biāo)板，再加入150 μL/孔封閉液，37℃孵育2 h，即制備完成酶標(biāo)板。

1.3.5 樣本的前處理方法

稱取1g均質(zhì)火鍋底料或辣椒醬樣品至50mL離心管中，加入10mL無水乙醇，渦動5min，3000×g室溫離心5min；取1mL上層有機(jī)相于50～60℃水浴氮吹至干；加入1 mL正己烷，渦動至溶解，再加入復(fù)溶液1 mL，渦動至均勻；4 500×g室溫離心2 min；去除上層油脂層及乳化層，取下層50 μL用于分析。

1.3.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

用0.02 mol/L PBS將嗎啡稀釋成0、0.3 μg/L、0.9 μg/L、2.7 μg/L、8.1 μg/L、24.3 μg/L共6個質(zhì)量濃度，加入酶標(biāo)板中，50 μL/孔，然后加入酶標(biāo)二抗50 μL/孔，再加入抗體工作液50 μL/孔，25℃避光環(huán)境下競爭30 min。洗板拍干后加入底物液100 μL/孔25℃避光反應(yīng)15 min，最后每孔加入50 μL終止液，于波長450 nm處檢測[15-16]。標(biāo)準(zhǔn)曲線的橫坐標(biāo)為嗎啡標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度的對數(shù)值，縱坐標(biāo)為百分吸光度值B（其他濃度孔的顯色值）/B0（0 μg/L孔的顯色值），重復(fù)測定5板，每板各濃度設(shè)5個重復(fù)，以測定批內(nèi)和批間誤差。

1.3.7 樣品中嗎啡及可待因的檢測

根據(jù)1.3.6測定所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，將火鍋底料或辣椒醬樣本的OD450nm值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可得到其相應(yīng)的質(zhì)量濃度，用該質(zhì)量濃度乘以稀釋倍數(shù)即樣本中嗎啡及可待因殘留量。

1.3.8 檢測性能

（1）計(jì)算檢出限

測定火鍋底料、辣椒醬空白樣本各20份，計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)差，以測定平均值加3倍的標(biāo)準(zhǔn)差作為方法的檢測限（limit of detection，LOD），即可檢測出的最低被測物濃度。

（2）精密度及準(zhǔn)確度

按5 μg/kg、10 μg/kg、20 μg/kg三個濃度的嗎啡及可待因?qū)疱伒琢?、辣椒醬樣品進(jìn)行添加回收測定，每個樣品濃度做4個重復(fù)，用三批不同試劑盒進(jìn)行測定。準(zhǔn)確度評價以回收率作為指標(biāo)；精密度評價以重復(fù)測定某一濃度樣品的檢測結(jié)果的變異系數(shù)作為指標(biāo)。

（3）測定抗體的特異性

分別測定嗎啡、可待因、蒂巴因、那可汀、罌粟堿與抗體的結(jié)合反應(yīng)。交叉反應(yīng)率為嗎啡的IC50與這些物質(zhì)的IC50的百分比，決定了它們對嗎啡檢測的干擾程度。

2 結(jié)果與分析

2.1 嗎啡人工抗原的檢測結(jié)果

取合成的半抗原經(jīng)核磁共振氫譜鑒定，結(jié)果見圖2。由圖2可知，1H-NMR（CDCl3，300MHz）δ：8.40（s，1H，ArH），7.90（s，1H，ArH），7.62（s，1H，ArH），6.82（s，1H，ArH），5.90（s，1H，-CH-），5.59（s，1H，-CH-），5.35（s，1H，-OH），4.30（d，1H，CH），3.04（s，1H，CH），2.76（s，1H，-CH-），1.88（d，2H，-CH2-）。圖譜中化學(xué)位移δ=8.40、7.90、7.62為間隔臂苯環(huán)上氫的共振吸收峰，這些峰的存在，證明間隔臂連接成功，嗎啡半抗原結(jié)構(gòu)正確。

圖2 嗎啡半抗原核磁共振氫譜圖Fig.2 Hydrogen spectrogram of nuclear magnetic resonance of morphine hapten

2.2 優(yōu)選抗原包被濃度、單克隆抗體濃度

測定不同單克隆抗體稀釋倍數(shù)以及抗原稀釋倍數(shù)條件下，質(zhì)量濃度為0和0.3 μg/L的嗎啡標(biāo)準(zhǔn)品的OD450nm值，并計(jì)算百分吸光率，結(jié)果見表1。

表1 抗原、抗體的濃度優(yōu)選結(jié)果Table 1 Optimum results of antigen and antibody concentration

由表1可知，當(dāng)百分吸光率在70%～85%時，以抗原、單克隆抗體的最大稀釋倍數(shù)作為抗原、單克隆抗體的最佳稀釋倍數(shù)，結(jié)果表明，此次篩選的抗原稀釋倍數(shù)為8 000，最佳單克隆抗體稀釋倍數(shù)為80 000。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

如圖3所示，標(biāo)準(zhǔn)曲線半抑制濃度（50%inhibitory concentration，IC50）為0.7 μg/L，檢測范圍為0.3～24.3 μg/L。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的批內(nèi)、批間誤差

標(biāo)準(zhǔn)曲線的精密度用批內(nèi)誤差和批間誤差來表示，重復(fù)測定5板，每板各濃度設(shè)5個重復(fù)，結(jié)果分別見表2和表3。

圖3 嗎啡標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of morphine

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的批內(nèi)誤差Table 2 Intra-assay error of the standard curve

表3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的批間誤差Table 3 Inter-assay error of the standard curve

由表2可知，各濃度的批內(nèi)變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）在3.74%～7.84%，平均為5.85%。由表3可知，批間誤差在3.98%～8.77%，平均為6.49%。結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)曲線的重復(fù)性良好。

2.5 計(jì)算檢測限

20個火鍋底料、辣椒醬空白樣本中嗎啡的檢測結(jié)果分別見表4、表5。檢測限以測定平均值加3倍標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算。

表4 火鍋底料空白樣本檢測限測定結(jié)果Table 4 Detection results of limit of detection of hotpot condiment blank samplesμg/kg

表5 辣椒醬空白樣本檢測限測定結(jié)果Table 5 Detection results of limit of detection of chilli sauce blanks amplesμg/kg

由表4、表5可知，20個火鍋底料空白樣本中嗎啡的檢測結(jié)果平均值為3.34 μg/kg，最低檢測限為4.92 μg/kg；20個辣椒醬空白樣本中嗎啡的檢測結(jié)果平均值為3.00 μg/kg，最低檢測限為4.85 μg/kg。

2.6 精密度及準(zhǔn)確度試驗(yàn)

樣本中嗎啡及可待因的殘留量測定，要求有可靠合理的檢測方法，并有較高的靈敏度。在火鍋底料、辣椒醬中按照設(shè)定的量分別添加嗎啡及可待因標(biāo)準(zhǔn)品，然后按照1.3.7的方法測定。試驗(yàn)精度及準(zhǔn)確試驗(yàn)結(jié)果見表6。由表6可知，試驗(yàn)結(jié)果平均回收率在80%～120%之間；批內(nèi)、批間變異系數(shù)均＜15%，說明此檢測方法是可靠的，可用于嗎啡及可待因在火鍋底料、辣椒醬中殘留量的分析測定。

表6 精密度及準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果Table 6 Results of precision and accuracy tests

2.7 抗體的特異性測定

單克隆抗體與嗎啡、可待因、蒂巴因、那可汀、罌粟堿的交叉反應(yīng)率見表7。

表7 抗體與其他物質(zhì)的交叉反應(yīng)率Table 7 Cross-reaction rate of antibody and other substances

由表7可知，嗎啡單克隆抗體對其他幾種類似物的交叉反應(yīng)率均較低，對嗎啡和可待因具有較好的特異性。

2.8 討論

嗎啡是小分子，不具備免疫原性，制備嗎啡特異性抗體首先要通過連接臂將嗎啡與載體蛋白偶聯(lián)。王能東等[17]設(shè)計(jì)了5種不同的連接臂得到了5株嗎啡單克隆抗體的細(xì)胞株，其中43C4效果最好，IC50為30 μg/L。本研究所用嗎啡半抗原是由重氮鹽與嗎啡反應(yīng)得到，使用所得單克隆抗體建立的檢測方法，IC50為0.7 μg/L。

在樣本的檢測分析中，為保證定量檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，需要最大程度的將嗎啡組分從固體樣本中提取出來。鮑會梅[18]比較了甲醇溶解法、反提法、磷酸緩沖液提取法、不同pH值的鹽酸水溶液提取等方法，其最終確定甲醇溶解法最適用于嗎啡的液相色譜分析。本研究采用了乙醇溶解法，經(jīng)過水浴氮吹至干后，再加入正己烷去除油脂層及乳化層，對火鍋底料、辣椒醬樣品中平均添加回收率為80%～120%。

3 結(jié)論

酶聯(lián)免疫法具有靈敏度高、特異性好、操作簡單、成本低、高通量等特點(diǎn)，能夠滿足食品企業(yè)及政府監(jiān)督部門的檢查工作需求。本研究所建立的嗎啡及可待因間接競爭酶聯(lián)免疫檢測方法，檢測時間可短至45 min，試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍為0.3～24.3 μg/L，對火鍋底料和辣椒醬的檢出限分別為4.92μg/kg、4.85μg/kg，平均回收率在80%～120%；批內(nèi)、批間變異系數(shù)均＜15%，可用于火鍋底料、辣椒醬中嗎啡及可待因的快速檢測。

[1]陳鳴.罌粟殼的臨床應(yīng)用與管理現(xiàn)狀[J].中國藥房，2016，27（25）：3461-3464.

[2]孫巖萍，牛潤桂，康金秀，等.嗎啡緩釋片不同給藥途徑療效與安全性的對比研究[J].中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2014，8（1）：148-150.

[3]謝敏娟，李娟，張璐.不同劑量嗎啡對C57小鼠成癮行為學(xué)的影響[J].中國臨床解剖學(xué)雜志，2014，32（6）：708-710.

[4]李紹毅，齊愛霞，白力允，等.嗎啡類藥物不良反應(yīng)的臨床觀察[J].中國民康醫(yī)學(xué)，2014，26（9）：59-60.

[5]李丹，周本宏.高效液相色譜法測定硫酸嗎啡緩釋栓含量[J].中國藥師，2016，19（2）：372-374.

[6]沈平，謝朝梅，謝燕湘.氣相色譜-質(zhì)譜法測定食品中罌粟殼提取物的殘留量[J].理化檢驗(yàn)化學(xué)分冊，2016，52（1）：48-51.

[7]趙迎晨，戴新華，黃挺，等.嗎啡型藥物的檢測方法及研究進(jìn)展[J].化學(xué)試劑，2011，33（9）：991-996.

[8]李剛，張靜，王丹輝，等.HPLC法測定止咳合劑中嗎啡含量[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2014，30（6）：551-554.

[9]聶渝瓊，張軍榮，朱聰，等.HPLC法測定氯化銨甘草口服溶液中嗎啡的含量[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2014，30（3）：234-236.

[10]鄺代治，張志堅(jiān)，馮泳蘭，等.羥基在苯酚親電取代反應(yīng)中的定位作用[J].化學(xué)教學(xué)，2010（3）：1-3.

[11]楊雯筌，殷耀，張睿，等.超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定火鍋底料中罌粟堿、嗎啡、那可丁、可待因和蒂巴因等五種非法添加物[J].環(huán)境化學(xué)，2016，35（6）：1321-1324.

[12]何方洋，于信念，王坤，等.酶聯(lián)免疫法與液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測豬肉中沙丁胺醇[J].中國釀造，2015，34（8）：132-135.

[13]劉小軍，馮才偉，馮靜，等.一種葉酸的酶聯(lián)免疫快速檢測試劑盒的研制[J].食品工業(yè)科技，2013，34（23）：303-310.

[14]梁晶晶，沈丹，張玉.酶聯(lián)免疫法測定嬰幼兒配方乳粉中黃曲霉毒素M1的方法研究[J].中國釀造，2016，35（4）：163-166.

[15]鄭百芹，羅曉琴，馮才偉，等.一種喹諾酮類藥物的酶聯(lián)免疫快速檢測試劑盒的研制[J].中國釀造，2014，33（2）：130-133.

[16]董李學(xué)，馮才偉，馮靜，等.抗氧氟沙星單克隆抗體的制備及ELISA快速試劑盒的初步研制[J].中國畜牧獸醫(yī)，2014，41（8）：90-94.

[17]王能東，陳家華，張秀，等.特異性嗎啡抗原和單克隆抗體的制備[J].化學(xué)學(xué)報(bào)，2001，59（10）：1798-1802.

[18]鮑會梅.火鍋底料中嗎啡組分的檢測方法研究[J].現(xiàn)代食品科技，2012，28（10）：1411-1415.

ELISA for determination of morphine and codeine

YANG Changsong1,ZHANG Lintian2,FENG Jing1,WANG Linchen1,KONG Xiangya1,HE Fangyang1*
(1.Beijing Kwinbon Biotechnology Company,Beijing 102206,China;2.Import-Export Inspection and Quarantine Bureau of Shantou, Shantou 515041,China)

Morphine hapten and artificial antigen were prepared by transformation of morphine molecular structure.Morphine monoclonal antibodies were obtained by immune animals.The detection method of indirect competition enzyme linked immunosorbent assay(ELISA)was established.The limit of detection of hotpot condiment and chilli sauce were 4.92 μg/kg and 4.85 μg/kg,respectively.The half-inhibitory concentration(IC50)was 0.7 μg/L.The linearity range of standard curve was 0.3-24.3 μg/L.The cross-reaction rate of antibody with morphine and codeine were 100%and 150%,respectively.The average adding standard recovery rate of hotpot condiment and chilli sauce was 80%-120%,the coefficient of variation was less than 15%.

morphine;codeine;enzyme immunoassay;hotpot condiment;chilli sauce

TS207.3

0254-5071（2017）03-0170-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.03.034

2016-12-14

汕頭市農(nóng)業(yè)攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（汕市財(cái)教[2015]103）

楊昌松（1986-），男，研究員，本科，研究方向?yàn)槭称钒踩焖贆z測技術(shù)。

*通訊作者：何方洋（1969-），男，研究員，博士，研究方向?yàn)槭称钒踩焖贆z測技術(shù)。