補(bǔ)腎活血化痰湯對(duì)多囊卵巢綜合征模型大鼠卵巢血供及形態(tài)的影響Δ

王瑞杰，李暉，邱方，王自闖（.河南中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，鄭州 45000；.河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，鄭州 45000）

補(bǔ)腎活血化痰湯對(duì)多囊卵巢綜合征模型大鼠卵巢血供及形態(tài)的影響Δ

王瑞杰1＊，李暉2，邱方2，王自闖1（1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，鄭州 450002；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，鄭州 450002）

目的：探討補(bǔ)腎活血化痰湯對(duì)多囊卵巢綜合征（PCOS）模型大鼠卵巢血供及形態(tài)的影響。方法：取SD大鼠（♀）50只隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組[羅格列酮，3 mg/（kg·d）]和補(bǔ)腎活血化痰湯低、高劑量組[5.0、7.5 g/（kg·d）]，每組10只。除正常對(duì)照組外，其余各組大鼠均采用Poresky法復(fù)制PCOS模型。成模后，各給藥組大鼠ig相應(yīng)藥物，正常對(duì)照組和模型組大鼠ig生理鹽水[10 mL/（kg·d）]，每天1次，連續(xù)22 d。給藥結(jié)束后處死大鼠，記錄微血管密度（MVD），檢測(cè)大鼠卵巢組織血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）1型受體（AT1）和2型受體（AT2）以及G蛋白偶聯(lián)受體MAS mRNA的表達(dá)，并觀察卵巢形態(tài)變化。結(jié)果：與正常對(duì)照組比較，模型組和各給藥組大鼠MVD均升高，AT1、AT2、MAS mRNA表達(dá)均下調(diào)（P＜0.05）；模型組大鼠卵巢組織可見(jiàn)囊性竇卵泡、顆粒細(xì)胞層減少，卵母細(xì)胞消失，黃體組織數(shù)量減少等明顯病理變化。與模型組比較，各給藥組上述指標(biāo)均得到顯著改善，且補(bǔ)腎活血化痰湯低、高劑量組作用均強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照組（P＜0.05）；各給藥組大鼠的卵巢組織病理變化均得到一定改善。結(jié)論：補(bǔ)腎活血化痰湯可增加PCOS模型大鼠卵巢組織血供，促進(jìn)血管生成，促排卵，有助于改善卵巢形態(tài)。

補(bǔ)腎活血化痰湯；多囊卵巢綜合征；卵巢形態(tài)；卵巢血供；大鼠

多囊卵巢綜合征（PCOS）為育齡期婦女常見(jiàn)內(nèi)分泌疾病，是引起不孕的重要原因。據(jù)報(bào)道，PCOS的發(fā)生與腎素-血管緊張素系統(tǒng)有明顯關(guān)聯(lián)[1]。PCOS患者多存在腎素-血管緊張素-雄激素級(jí)聯(lián)亢進(jìn)表現(xiàn)，筆者推測(cè)這可能與血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）、促黃體生成素（LH）水平上調(diào)有關(guān)。同時(shí)，PCOS患者還伴有卵巢及子宮供血障礙，大部分可見(jiàn)卵巢血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）表達(dá)增強(qiáng)。

補(bǔ)腎活血化痰湯為河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院褚玉霞教授總結(jié)臨床經(jīng)驗(yàn)而得的驗(yàn)方，由菟絲子、丹參、熟地黃、仙靈脾、茯苓等11味中藥材組成，具有化痰祛濕、溫腎健脾、調(diào)經(jīng)助孕之效[2]。該方已被證實(shí)可改善PCOS患者卵巢局部纖溶狀態(tài)、雙向調(diào)節(jié)女性性腺軸、促進(jìn)卵泡發(fā)育，同時(shí)還可促進(jìn)卵巢組織修復(fù)及再生[3]，但其對(duì)卵巢血供和形態(tài)的影響及其具體作用機(jī)制尚未明確。基于此，本研究擬建立PCOS大鼠模型，并給予補(bǔ)腎活血化痰湯進(jìn)行干預(yù)，采用熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）法檢測(cè)AngⅡ1型受體（AT1）、2型受體（AT2）及G蛋白偶聯(lián)受體MAS mRNA在PCOS模型大鼠卵巢組織的表達(dá)情況，采用原位雜交法測(cè)定PCOS模型大鼠卵巢VEGF mRNA表達(dá)，鏡下觀察大鼠卵巢微血管密度（MVD）及形態(tài)變化，旨在明確其對(duì)PCOS模型大鼠卵巢血管生成、血供及形態(tài)的影響及其相關(guān)機(jī)制。

1 材料

1.1 儀器

Uniwersal 32R型高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Sigma公司）；DVM5000 HD型高分辨顯微鏡（德國(guó)Leica公司）；CX23型光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）；熒光定量PCR儀（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）。

1.2 藥品與試劑

補(bǔ)腎活血化痰湯（河南中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院制劑室自制，批號(hào)：002345，規(guī)格：每1 mL含生藥1 g）；羅格列酮片（成都恒瑞制藥有限公司，批號(hào)：030569，規(guī)格：4 mg/片）；VEGF原位雜交試劑盒、鏈霉親和素-生物素復(fù)合物（SABC）試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，批號(hào)：MK1142、SA1053）；引物由上海生工生物工程有限公司提供；其余試劑均為分析純。

1.3 動(dòng)物

清潔級(jí)SD大鼠50只，♀，鼠齡54～60 d，體質(zhì)量170～210 g，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SCKX（豫）2010-0002]。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

實(shí)驗(yàn)前先將大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為（22±1）℃、濕度為（60±5）%、每小時(shí)通風(fēng)換氣20～22次、壓力梯度設(shè)定為20～50 kPa，期間自由飲水，喂顆粒飼料。1周后，將50只大鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，分別為正常對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組[羅格列酮，3 mg（/kg·d）[4]]和補(bǔ)腎活血化痰湯低、高劑量組[5.0、7.5 g（/kg·d），根據(jù)體表面積法換算分別為人臨床用量的10、15倍劑量]。除正常對(duì)照組外，其余各組大鼠均采用Poresky法[5]復(fù)制PCOS模型，若發(fā)現(xiàn)大鼠血胰島素、睪酮（T）水平增加且陰道涂片檢查持續(xù)出現(xiàn)角化細(xì)胞、失去動(dòng)情周期，則視為造模成功[6]；造模期間正常對(duì)照組大鼠同時(shí)ig生理鹽水[10 mL（/kg·d）]。造模后，各給藥組大鼠ig相應(yīng)藥物溶液，正常對(duì)照組和模型組大鼠ig等體積生理鹽水，每天1次，連續(xù)22 d。

2.2 卵巢形態(tài)觀察及MVD測(cè)定

末次給藥后，觀察大鼠陰道涂片結(jié)果，動(dòng)情間期內(nèi)（參照宮頸黏液結(jié)晶法[7]判斷動(dòng)情周期）禁食不禁水12 h，稱質(zhì)量，25%烏拉坦麻醉，斷頭處死，游離卵巢。卵巢以4%多聚甲醛固定15 min，常規(guī)石蠟包埋，制備10 μm切片，脫蠟、梯度乙醇脫水，蘇木精染色5 min，自來(lái)水沖洗，乙醇分化30 s，自來(lái)水浸泡15 min，置伊紅液內(nèi)2 min，脫水透明后封片。光鏡下觀察卵巢形態(tài)特點(diǎn)，并選取切片組織5個(gè)微血管密集區(qū)，鏡下觀察微血管數(shù)目，取其均值表示MVD。

2.3 卵巢組織中VEGF mRNA水平測(cè)定

采用原位雜交法[8]。配制雜交用液，清洗載玻片。取材，冰凍切片，4%多聚甲醛室溫固定0.5～1.0 h，蒸餾水洗滌，無(wú)水甲醇、雙氧水（H2O2）混合，暴露mRNA核酸片段，胃蛋白酶消化，固定、洗滌、預(yù)雜交后雜交。VEGF引物序列：上游為5′-GCTCTACCTCCACCATGCCAAGTGGTCCCA-3′，下游為5′-GCAGCTTGAGTTAAACGAACGTACTTGCAGC-3′，每張切片加20 μL預(yù)雜交液，恒溫箱40℃預(yù)雜交3 h；吸棄多余液體，每張切片加20 μL VEGF寡核苷酸探針雜交液，恒溫箱40℃交過(guò)夜；洗滌，滴加封閉液，然后依次滴加生物素化鼠抗地高辛、SABC、生物素化過(guò)氧化物酶，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，蘇木精復(fù)染，乙醇脫水，二甲苯透明，封片。顯微鏡下觀察，VEGF mRNA細(xì)胞漿著色呈棕黃色為陽(yáng)性，無(wú)棕黃色反應(yīng)為陰性，低倍鏡下定位陽(yáng)性細(xì)胞位置，高倍觀察細(xì)胞形態(tài)、分布。圖像采用BST-20-M全自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行處理，以灰度值表示各組VEGF mRNA陽(yáng)性信號(hào)強(qiáng)弱，灰度值越高，表明表達(dá)強(qiáng)度越高。

2.4 卵巢組織中AT1、AT2及MAS mRNA水平測(cè)定

采用熒光定量PCR法。提取樣本總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，嚴(yán)格參照試劑使用說(shuō)明書操作進(jìn)行PCR擴(kuò)增。AT1引物序列：上游為5′-AGTGTGCGCGTTTCATTATGAGTCT-3′，下游為5′-TTAGCTGGTGAGAATGATAAGGAAAGG-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度為112 bp；AT2引物序列：上游為5′-GGATGCTCTGACCTGGATGGG-3′，下游為5′-GGAGCCAAGTAATGGGAACTCTAAAC-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度為188 bp；MAS引物序列：上游為5′-CTGTCGGGCGGTCATCATCTT-3′，下游為5′-TGTTCTTCCGTATCTTCACCACCAA-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度為104 bp；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）引物序列：上游為5′-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3′，下游為5′-GCTTCACCACCTTCTTGATGTC-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度為135 bp。反應(yīng)體系：REALSYBR Minxture 10μL，上、下游引物各0.4μL，cDNA模板2μL。熱循環(huán)參數(shù)：95℃、10 min；95℃、15 s，60℃、20 s，72℃、27 s，40個(gè)循環(huán)；72℃、5 min。收集熒光信號(hào)，通過(guò)各基因與GAPDH相比計(jì)算分析最終獲取RQ值（RQ＝2－ΔΔc）t。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠卵巢形態(tài)觀察結(jié)果

正常對(duì)照組大鼠卵巢卵泡結(jié)構(gòu)清晰，可見(jiàn)黃體及不同發(fā)育卵泡，卵泡壁可見(jiàn)形態(tài)完整、排列緊密的多層顆粒細(xì)胞，卵泡膜呈梭形，膜-間質(zhì)無(wú)增生。模型組大鼠卵巢可見(jiàn)囊性竇卵泡，竇腔擴(kuò)大，顆粒細(xì)胞層減少、排列稀松，卵母細(xì)胞消失，黃體組織數(shù)量減少，伴黃素化，膜細(xì)胞增生明顯。陽(yáng)性對(duì)照組大鼠卵巢可見(jiàn)囊性竇卵泡，黃體數(shù)量多于模型組，顆粒細(xì)胞層增多、形態(tài)完整，但排列紊亂。補(bǔ)腎活血化痰湯低劑量組大鼠卵巢組織可見(jiàn)少量囊性竇卵泡，竇腔縮小，黃體組織數(shù)量增多，顆粒細(xì)胞層增加、細(xì)胞形態(tài)完整，但排列有些許紊亂。補(bǔ)腎活血化痰湯高劑量組大鼠卵巢組織可見(jiàn)少量囊性竇卵泡，竇腔小，黃體數(shù)量少于正常對(duì)照組，顆粒細(xì)胞層增厚、形態(tài)完整、排列緊密。各組大鼠卵巢組織切片圖見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠卵巢組織切片圖（HE染色，×100）Fig 1 Sections of ovarian tissue of rats in each group（HE staining，×100）

3.2 各組大鼠卵巢組織中VEGF mRNA水平及MVD測(cè)定結(jié)果

與正常對(duì)照組比較，模型組及各給藥組大鼠卵巢組織中VEGF mRNA表達(dá)均顯著增強(qiáng)、MVD均顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，各給藥組大鼠卵巢組織中VEGF mRNA表達(dá)均顯著減弱，MVD均顯著降低；其中，補(bǔ)腎活血化痰湯低、高劑量組作用優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照組（P＜0.05），補(bǔ)腎活血化痰湯高劑量組作用略高于低劑量組（P＞0.05）。各組大鼠卵巢組織中VEGF mRNA水平及MVD測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠卵巢組織中VEGF mRNA水平及MVD測(cè)定結(jié)果（±s，n＝10）Tab 1 mRNA level of VEGF and MVD in ovarian tissue of rats in each group（±s，n＝10）

表1 各組大鼠卵巢組織中VEGF mRNA水平及MVD測(cè)定結(jié)果（±s，n＝10）Tab 1 mRNA level of VEGF and MVD in ovarian tissue of rats in each group（±s，n＝10）

注：與正常對(duì)照組比較，＊P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，ΔP＜0.05Note：vs.normal control group，＊P＜0.05；vs.model group，#P＜0.05；vs.positive control group，ΔP＜0.05

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3.3 各組大鼠卵巢組織中AT1、AT2及MAS mRNA水平測(cè)定結(jié)果

與正常對(duì)照組比較，模型組和各給藥組大鼠卵巢組織AT1、AT2、MAS mRNA表達(dá)均顯著減弱（P＜0.05）。與模型組比較，各給藥組大鼠上述指標(biāo)表達(dá)均顯著增強(qiáng)；其中，補(bǔ)腎活血化痰湯高、低劑量組作用優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照組（P＜0.05），補(bǔ)腎活血化痰湯高劑量組作用略高于低劑量組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。各組大鼠卵巢組織AT1、AT2及MAS mRNA水平測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠卵巢組織AT1、AT2及MAS mRNA水平測(cè)定結(jié)果（±s，n＝10）Tab 2 mRNA level of AT1，AT2 and MAS in ovarian tissue of rats in each group（±s，n＝10）

表2 各組大鼠卵巢組織AT1、AT2及MAS mRNA水平測(cè)定結(jié)果（±s，n＝10）Tab 2 mRNA level of AT1，AT2 and MAS in ovarian tissue of rats in each group（±s，n＝10）

注：與正常對(duì)照組比較，＊P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，ΔP＜0.05Note：vs.normal control group，＊P＜0.05；vs.model group，#P＜0.05；vs.positive control group，ΔP＜0.05

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4 討論

近年來(lái)，血管生成、供血等在卵巢周期調(diào)節(jié)中的作用引起了相關(guān)研究者的關(guān)注。血管生成為正常周期性卵巢的重要功能，卵巢生長(zhǎng)、黃體形成均依賴于毛細(xì)血管增生，而黃體細(xì)胞對(duì)膽固醇合成孕酮有關(guān)鍵作用，且卵巢優(yōu)勢(shì)卵泡選擇同樣與血管生成密切關(guān)聯(lián)。卵巢組織血管生成因子不僅調(diào)控血管生成，而且還具有內(nèi)分泌功能，其釋放及合成的自身激素可與細(xì)胞受體結(jié)合，促進(jìn)卵泡發(fā)育。

唐智華等[9]認(rèn)為，囊泡及間質(zhì)血管生成增多是引起PCOS患者排卵障礙或無(wú)排卵的重要原因，而VEGF與血管增殖、生成密切相關(guān)。VEGF為血管通透因子，有高滲透作用，可促進(jìn)雄性激素分泌，導(dǎo)致卵巢間質(zhì)增生。正常育齡期女性黃體、卵泡細(xì)胞內(nèi)均有VEGF表達(dá)。卵巢發(fā)育過(guò)程中，竇狀卵泡、原始卵泡均無(wú)獨(dú)立毛細(xì)血管網(wǎng)，其營(yíng)養(yǎng)提供來(lái)源于附近間質(zhì)血管，VEGF可通過(guò)血供建立、毛細(xì)血管生成、毛細(xì)血管通透性等方面影響及參與卵泡發(fā)育、成熟及排卵過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)，排卵前VEGF mRNA轉(zhuǎn)錄增加，同時(shí)可與前列腺素發(fā)揮協(xié)同作用，從而提高微血管通透性，促進(jìn)膠原酶、纖維原激活物活化，引起排卵過(guò)程中卵泡壁破裂，最終導(dǎo)致PCOS的發(fā)生[10]。目前，已有報(bào)道指出，VEGF可通過(guò)自分泌或旁分泌等途徑調(diào)控卵巢血管生成過(guò)程，且PCOS患者血清、卵巢組織中VEGF mRNA表達(dá)均高于正常育齡婦女[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，PCOS模型大鼠卵巢組織中VEGF mRNA表達(dá)也增強(qiáng)，與上述報(bào)道相符；而給藥后，各給藥組大鼠卵巢組織中VEGF mRNA表達(dá)均減弱。

RAS為激素調(diào)節(jié)系統(tǒng)，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶-AngⅡ-血管緊張素受體則為RAS系統(tǒng)代謝的關(guān)鍵途徑，其中AT1參與血管平滑肌增殖、血管形成、血管收縮調(diào)節(jié)，AT2受體參與細(xì)胞凋亡與生長(zhǎng)。前者表達(dá)于卵巢間質(zhì)細(xì)胞，后者則主要存在于閉鎖卵泡顆粒細(xì)胞。排卵前卵泡顆粒細(xì)胞中AT2水平較高，且隨卵泡直徑、質(zhì)量的上升而增高。AT2存在于各階段卵泡顆粒細(xì)胞，調(diào)控雌激素合成[12]。MAS則定位于膜細(xì)胞、粒細(xì)胞內(nèi)，隨月經(jīng)周期的變化其表達(dá)水平發(fā)生改變，在性激素合成、卵母細(xì)胞成熟等方面有重要作用。本研究結(jié)果顯示，PCOS模型大鼠卵巢組織AT1、AT2、MAS mRNA表達(dá)均減弱；給藥后，PCOS模型大鼠卵巢組織AT1、AT2、MAS mRNA基因表達(dá)均增強(qiáng)，表明中藥補(bǔ)腎活血化痰湯對(duì)卵巢血供具有一定的調(diào)節(jié)作用。

羅格列酮可通過(guò)直接或間接作用于垂體胰島素受體，促排卵、減少卵巢顆粒細(xì)胞凋亡、改善卵巢組織形態(tài)及血供[13]，故本文選其為陽(yáng)性對(duì)照藥物。本研究發(fā)現(xiàn)，羅格列酮雖可改善PCOS大鼠卵巢組織血供及血管生成，有一定的促排卵作用，但藥效不及補(bǔ)腎活血化痰湯顯著?？梢?jiàn)，補(bǔ)腎活血化痰湯可改善PCOS大鼠卵巢組織血管生成情況，促進(jìn)排卵，有助于改善卵巢形態(tài)。

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Effects of Bushen Huoxue Huatan Decoction on Ovarian Blood Supply and Form in Polycystic Ovarian Syndrome Model Rats

WANG Ruijie1，LI Hui2，QIU Fang2，WANG Zichuang1（1.Second Clinical College，Henan University of TCM，Zhengzhou 450002，China；2.Dept.of Reproductive Medicine，the Second Affiliated Hospital of Henan University of TCM，Zhengzhou 450002，China）

OBJECTIVE：To explore the effects of Bushen huoxue huatan decoction on ovarian blood supply and form in model rats with polycystic ovarian syndrome（PCOS）.METHODS：50 SD female rats were randomized into normal control group，model group，positive control group[rosiglitazone，3 mg/（kg·d）]，Bushen huoxue huatan decoction low-dose and high-dose groups[5.0，7.5 g/（kg·d）]，with 10 rats in each group.Except for normal control group，PCOS model was induced in the other groups by Poresky method.After modeling，treatment groups were given relevant medicine intragastrically.The normal control group and model group were given normal saline[10 mL/（kg·d）]intragastrically，once a day，for 22 days.After the end of administration，the rats were sacrificed.The microvessel density（MVD）was recorded.mRNA expression of vascular endothelial growth factor（VEGF），ovarian angiotensinⅡreceptor（AngⅡ）type 1（AT1）and type 2（AT2），G-protein coupled receptor MAS were all detected in ovarian tissue of rats.The ovarian form was observed.RESULTS：Compared with normal control group，MVD of model group and treatment groups were all increased，while mRNA expression of AT1，AT2 and MAS were down-regulated（P＜0.05）；cystic sinus sollicle，the decrease of granular cell layer，egg mother cells disappearance，the decrease of luteal tissue and other obvious pathological changes could be found in ovarian tissue of rats in model group.Compared with model group，above indexes of treatment groups were improved significantly，and the effects of Bushen huoxue huatan decoction low-dose and high-dose groups were better than that of positive control group（P＜0.05）.The pathological changes of ovarian tissue in treatment groups were all improved to certain extent.CONCLUSIONS：Bushen huoxue huatan decoction can improve ovarian blood supply，angiogenesis and ovulation in PCOS rats.It is beneficial to improve ovarian form.

Bushen huoxue huatan decoction；Polycystic ovarian syndrome；Ovarian form；Ovarian blood supply；Rats

R285.5

A

1001-0408（2017）04-0479-04

2016-05-04

2016-12-09）

（編輯：林靜）

河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（No. 13A360579）；全國(guó)名老中醫(yī)藥專家傳承工作室建設(shè)項(xiàng)目（No.〔2014〕-20號(hào)）；河南中醫(yī)學(xué)院博士啟動(dòng)基金（No.BSJJ2012-21）

＊講師，博士。研究方向：生殖內(nèi)分泌、不孕不育。電話：0371-60908726。E-mail：wangruijie021@163.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.04.13