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    抑毒調(diào)肝合劑抗大鼠肝纖維化的作用及機制研究Δ

    2017-04-07 07:46:14羅宏麗肖順林余欣西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部四川瀘州646000
    中國藥房 2017年4期
    關(guān)鍵詞:秋水仙堿合劑膠原

    羅宏麗,肖順林,余欣(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部,四川 瀘州 646000)

    抑毒調(diào)肝合劑抗大鼠肝纖維化的作用及機制研究Δ

    羅宏麗*,肖順林,余欣(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部,四川 瀘州 646000)

    目的:研究抑毒調(diào)肝合劑抗大鼠肝纖維化的作用及機制。方法:將60只SD大鼠隨機分為正常組、模型組、秋水仙堿組(陽性對照,0.2 mg/kg)和抑毒調(diào)肝合劑低、中、高劑量組(2.7、5.4、10.8 mL/kg)。除正常組外,其余各組大鼠均復(fù)制肝纖維化模型,并于造模同時ig相應(yīng)藥物,每天1次,連續(xù)8周。檢測大鼠血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、透明質(zhì)酸(HA)、Ⅲ型前膠原(PCⅢ)、Ⅳ型膠原(CⅣ)、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子1(TIMP-1)、基質(zhì)金屬蛋白酶1(MMP-1)、MMP-2、MMP-13、轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)水平和肝組織中羥脯氨酸(Hyp)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)、丙二醛(MDA)、TGF-β1、TNF-α水平。結(jié)果:與正常組比較,模型組大鼠血清中ALT、AST、HA、PCⅢ、CⅣ、TIMP-1、MMP-2、TGF-β1、TNF-α水平顯著升高,MMP-1、MMP-13水平顯著降低(P<0.05);肝組織中Hyp、TGF-β1、TNF-α、MDA水平顯著升高,SOD、GSH-Px、CAT水平顯著降低(P<0.05)。與模型組比較,抑毒調(diào)肝合劑中、高劑量組和秋水仙堿組大鼠血清中ALT、AST、HA、PCⅢ、CⅣ、TIMP-1、TNF-α水平以及肝組織中Hyp、TGF-β1、TNF-α、MDA水平均顯著降低(P<0.05);抑毒調(diào)肝合劑高劑量組和秋水仙堿組大鼠血清中MMP-1、MMP-13水平以及肝組織中CAT水平均顯著升高(P<0.05),且血清中MMP-2、TGF-β1水平顯著降低(P<0.05);抑毒調(diào)肝合劑低劑量組大鼠上述指標(biāo)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論:抑毒調(diào)肝合劑抗大鼠肝纖維化的作用機制可能與調(diào)節(jié)TIMP/MMP平衡、抗氧化應(yīng)激、降低TGF-β1水平和減少細胞外基質(zhì)沉積有關(guān)。

    抑毒調(diào)肝合劑;肝纖維化;大鼠

    肝纖維化是多種慢性肝病共有的病理變化,表現(xiàn)為以膠原為主的細胞外基質(zhì)(Extracellular matrix,ECM)在肝臟內(nèi)的過度沉積[1]。研究證實,通過積極有效地對原發(fā)病和肝纖維化進行治療可預(yù)防肝纖維化發(fā)展為肝硬化或肝癌[2],因此肝纖維化的早期診斷和有效治療顯得尤其重要。由于肝纖維化的行成過程具有多因素、多步驟、多環(huán)節(jié)的特征,雖然臨床上也使用秋水仙堿、青霉胺等藥物進行治療,但毒副作用大,其治療方法尚未有突破。而中藥具有多靶點、多環(huán)節(jié)、多層次的作用特點,近年來中藥單味及復(fù)方制劑在抗肝纖維化治療中已顯示出明顯優(yōu)勢[3-4]。抑毒調(diào)肝合劑是由西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院自主研發(fā)生產(chǎn)的醫(yī)院制劑,由虎杖、丹參、黨參、綿馬貫眾、黃精等5味中藥材組成,在臨床主要用于治療慢性肝炎,癥見疲乏無力、不思飲食、肝區(qū)隱痛、自汗者,但在肝纖維化方面應(yīng)用較少。筆者在前期研究中已對該方的制劑工藝進行了優(yōu)化,建立了其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),并證實了其具有一定抗肝纖維化作用[5-6],但具體作用機制尚不明確。本研究在此基礎(chǔ)上進一步探討抑毒調(diào)肝合劑對大鼠肝纖維化的作用機制,為其臨床合理用藥提供實驗依據(jù)。

    1 材料

    1.1 儀器

    KS604721放射免疫分析儀(北京科思佳科技有限責(zé)任公司);FA1004電子分析天平(上海精科天平廠);AMS-18A全自動生化分析儀(北京奧普森科技有限公司);MK3酶標(biāo)儀[熱電(上海)儀器有限公司]。

    1.2 藥品與試劑盒

    抑毒調(diào)肝合劑(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院中藥制劑室自制,批準(zhǔn)文號:川藥制字Z20070510,批號:150217,規(guī)格:20 mL/支,每1 mL含生藥約1.12 g);秋水仙堿片(云南植物藥業(yè)有限公司,批號:20150504,規(guī)格:0.5 mg/片);丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)、丙二醛(MDA)、羥脯氨酸(Hyp)試劑盒(南京建成生物工程研究所);透明質(zhì)酸(HA)、Ⅲ型前膠原(PCⅢ)、Ⅳ型膠原(CⅣ)放射免疫試劑盒(北京華英生物技術(shù)研究所);基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子1(TIMP-1)、基質(zhì)金屬蛋白酶1(MMP-1)、MMP-2、MMP-13、轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(上海西唐生物科技有限公司)。

    1.3 動物

    清潔級成年健康SD大鼠60只,♀♂各半,體質(zhì)量180~200 g,由西南醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供,動物合格證號為SYXK(川)2013-065。

    2 方法

    2.1 分組、造模與給藥

    將60只SD大鼠隨機分為正常組、模型組、秋水仙堿組(陽性對照,0.2 mg/kg,相當(dāng)于成人臨床用量的6倍劑量)和抑毒調(diào)肝合劑低、中、高劑量組(2.7、5.4、10.8 mL/kg,分別相當(dāng)于成人臨床用量的3、6、12倍劑量),每組10只。除正常組大鼠sc橄欖油溶液外,其余各組大鼠均sc 40%CCl4橄欖油溶液(首次劑量為5 mL/kg,以后每次劑量為3 mL/kg),每周2次,連續(xù)8周;造模開始前2周給予高脂飲食(80%玉米粉+20%豬油),以后改用普通飼料,造模期間以10%乙醇為飲用水。自造模第1天起,各給藥組大鼠ig相應(yīng)藥液,每天1次;正常組大鼠ig等體積蒸餾水。每天觀察大鼠一般活動情況。

    2.2 指標(biāo)測定

    2.2.1 血清指標(biāo) 末次給藥后24 h,稱大鼠體質(zhì)量,麻醉,腹主動脈取血,以離心半徑為10 cm、3 000 r/min離心10 min(下同),分離血清。采用全自動生化分析儀測定血清中ALT、AST水平,采用放射免疫法測定血清中HA、PCⅢ、CⅣ水平,采用ELISA法測定血清中TIMP-1、MMP-1、MMP-2、MMP-13、TGF-β1、TNF-α水平,實驗操作嚴(yán)格按照相應(yīng)試劑盒說明書進行。

    2.2.2 肝臟指標(biāo) 取血后處死大鼠,摘取肝臟,冷生理鹽水漂洗,冰浴中制成10%肝組織勻漿,離心,取上清。分別采用堿水解法、硫代巴比妥酸法(TBA法)、黃嘌呤氧化法測定肝組織中Hyp、MDA、SOD水平,采用比色法測定肝組織中GSH-Px、CAT水平,采用ELISA法測定肝組織中TGF-β1、TNF-α水平,實驗操作嚴(yán)格按照相應(yīng)試劑盒說明書進行。

    2.3 統(tǒng)計學(xué)方法

    3 結(jié)果

    3.1 一般情況觀察結(jié)果

    正常組大鼠皮毛光滑潤澤,活動及飲食基本正常,無死亡。模型組大鼠隨給藥時間的延長,進食和活動逐漸減少,皮毛干澀、枯亂,反應(yīng)遲鈍,分別于造模第6周和第7周各死亡1只。抑毒調(diào)肝合劑低劑量組大鼠的一般狀態(tài)與模型組無明顯區(qū)別,死亡1只。抑毒調(diào)肝合劑中、高劑量組大鼠的飲食情況較模型組改善,毛色逐漸趨于正常,活動度較好。秋水仙堿組大鼠整體情況與抑毒調(diào)肝合劑高劑量組相似,但有輕微腹瀉癥狀。

    3.2 血清中ALT、AST、HA、PCⅢ、CⅣ水平和肝組織中Hyp水平測定結(jié)果

    與正常組比較,模型組大鼠血清中ALT、AST、HA、PCⅢ、CⅣ水平和肝組織中Hyp水平均顯著升高(P<0.05),提示造模成功。與模型組比較,抑毒調(diào)肝合劑中、高劑量組和秋水仙堿組大鼠上述指標(biāo)水平均顯著降低(P<0.05),提示抑毒調(diào)肝合劑和秋水仙堿具有一定抗肝纖維化作用。與秋水仙堿組比較,抑毒調(diào)肝合劑高劑量組大鼠上述指標(biāo)均無顯著變化(P>0.05),結(jié)果詳見表1。

    3.3 血清中TIMP-1、MMP-1、MMP-2、MMP-13水平測定結(jié)果

    與正常組比較,模型組大鼠血清中TIMP-1、MMP-2水平均顯著升高(P<0.05),MMP-1、MMP-13水平均顯著降低(P<0.05)。與模型組比較,抑毒調(diào)肝合劑高劑量組和秋水仙堿組大鼠上述指標(biāo)均顯著改善(P<0.05)。與秋水仙堿組比較,抑毒調(diào)肝合劑高劑量組大鼠血清中MMP-1、MMP-2、MMP-13水平均無顯著差異(P>0.05),結(jié)果詳見表2。

    表1 各組大鼠血清中ALT、AST、HA、PCⅢ、CⅣ水平和肝組織中Hyp水平測定結(jié)果(±s)Tab 1 The levels ofALT,AST,HA,PCⅢ,CⅣin serum and Hyp in liver tissue of rats in each group(±s)

    表1 各組大鼠血清中ALT、AST、HA、PCⅢ、CⅣ水平和肝組織中Hyp水平測定結(jié)果(±s)Tab 1 The levels ofALT,AST,HA,PCⅢ,CⅣin serum and Hyp in liver tissue of rats in each group(±s)

    注:與正常組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;與秋水仙堿組比較,ΔP<0.05Note:vs.normal group,*P<0.05;vs.model group,#P<0.05;vs. colchicine group,ΔP<0.05

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    表2 各組大鼠血清中TIMP-1、MMP-1、MMP-2、MMP-13水平測定結(jié)果(±s,μg/L)Tab 2 The serum levels of TIMP-1,MMP-1,MMP-2 and MMP-13 of rats in each group(±s,μg/L)

    表2 各組大鼠血清中TIMP-1、MMP-1、MMP-2、MMP-13水平測定結(jié)果(±s,μg/L)Tab 2 The serum levels of TIMP-1,MMP-1,MMP-2 and MMP-13 of rats in each group(±s,μg/L)

    注:與正常組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;與秋水仙堿組比較,ΔP<0.05Note:vs.normal group,*P<0.05;vs.model group,#P<0.05;vs. colchicine group,ΔP<0.05

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    3.4 血清和肝組織中TGF-β1、TNF-α水平測定結(jié)果

    與正常組比較,模型組大鼠血清和肝組織中TGF-β1、TNF-α水平均顯著升高(P<0.05)。與模型組比較,抑毒調(diào)肝合劑中、高劑量組和秋水仙堿組大鼠血清和肝組織中TNF-α水平均顯著降低(P<0.05);抑毒調(diào)肝合劑高劑量組和秋水仙堿組大鼠血清和肝組織中TGF-β1水平以及抑毒調(diào)肝合劑中劑量組大鼠肝組織中TGF-β1水平均顯著降低(P<0.05)。與秋水仙堿組比較,抑毒調(diào)肝合劑中、高劑量組大鼠上述指標(biāo)均無顯著差異(P>0.05),結(jié)果詳見表3。

    3.5 肝組織中SOD、GSH-Px、CAT、MDA水平測定結(jié)果

    與正常組比較,模型組大鼠肝組織中SOD、GSHPx、CAT水平均顯著降低(P<0.05),MDA水平顯著升高(P<0.05)。與模型組比較,抑毒調(diào)肝合劑中、高劑量組和秋水仙堿組大鼠肝組織中SOD、GSH-Px水平以及抑毒調(diào)肝合劑高劑量組和秋水仙堿組大鼠肝組織中CAT水平均顯著升高(P<0.05),MDA水平均顯著降低(P<0.05)。與秋水仙堿組比較,抑毒調(diào)肝合劑中、高劑量組大鼠上述指標(biāo)均無顯著差異(P>0.05),結(jié)果詳見表4。

    表3 各組大鼠血清和肝組織中TGF-β1、TNF-α含量測定結(jié)果(±s,μg/L)Tab 3 The contents of TGF-β1and TNF-α in serum and liver tissue of rats in each group(±s,μg/L)

    表3 各組大鼠血清和肝組織中TGF-β1、TNF-α含量測定結(jié)果(±s,μg/L)Tab 3 The contents of TGF-β1and TNF-α in serum and liver tissue of rats in each group(±s,μg/L)

    注:與正常組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;與秋水仙堿組比較,ΔP<0.05Note:vs.normal group,*P<0.05;vs.model group,#P<0.05;vs. colchicine group,ΔP<0.05

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    表4 各組大鼠肝組織中SOD、GSH-Px、CAT、MDA水平測定結(jié)果(±s)Tab 4 The levels of SOD,GSH-Px,CAT and MDA in liver tissue of rats in each group(±s)

    表4 各組大鼠肝組織中SOD、GSH-Px、CAT、MDA水平測定結(jié)果(±s)Tab 4 The levels of SOD,GSH-Px,CAT and MDA in liver tissue of rats in each group(±s)

    注:與正常組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;與秋水仙堿組比較,ΔP<0.05Note:vs.normal group,*P<0.05;vs.model group,#P<0.05;vs. colchicine group,ΔP<0.05

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    4 討論

    臨床上常用的肝纖維化診斷方法有血清學(xué)指標(biāo)(膠原及其代謝產(chǎn)物HA、LN、PCⅢ、CⅣ等)、肝穿刺病理學(xué)及B超瞬時彈性檢測。膠原纖維主要由膠原蛋白構(gòu)成,而Hyp又是膠原蛋白的特有成分,因此測定肝組織總Hyp含量可間接反映肝纖維化的程度[7]。本研究結(jié)果顯示,模型組大鼠肝組織中Hyp、HA、PCⅢ、CⅣ水平明顯升高,表明肝纖維化大鼠模型制備成功;而預(yù)防性給予抑毒調(diào)肝合劑后,上述指標(biāo)均顯著降低,表明該中藥復(fù)方可通過降低肝組織中Hyp含量、抑制膠原纖維合成,從而發(fā)揮抗纖維化作用。

    MMP和TIMP是ECM合成和降解調(diào)節(jié)中的兩個重要因子。目前發(fā)現(xiàn)有20多種MMP,其中MMP-1主要降解Ⅰ、Ⅲ型膠原,減少ECM的沉積;MMP-2降解細胞間基質(zhì)成分和ECM CⅣ,并參與纖維結(jié)締組織的重建、炎癥反應(yīng)等;MMP-13需鋅離子的激活并參與肝內(nèi)ECM的降解,在肝損傷等狀態(tài)下表達降低[8]。TIMP是組織中MMP的內(nèi)源性抑制因子,可與活性MMP結(jié)合,抑制其對ECM的降解活性,從而導(dǎo)致ECM在肝臟內(nèi)的過度沉積,促使肝纖維化形成。目前發(fā)現(xiàn)有4種TIMP,肝臟中主要存在TIMP-1和TIMP-2。其中TIMP-1可抑制除MMP-14、MMP-19外的所有MMP,通過其N-末端特異性地與MMP-1催化活性中心的鋅離子結(jié)合,從而封閉其催化活性,使MMP-1失活[9]。TIMP-1對肝纖維化的診斷特異性和敏感性高于TIMP-2,其表達在肝纖維化過程中逐漸增強,到肝硬化階段達到高峰,增加的程度可反映肝纖維化的嚴(yán)重程度。因此,本實驗設(shè)計檢測MMP-1、MMP-2、MMP-13、TIMP-1等指標(biāo),以評價模型復(fù)制是否成功和探討藥物的作用機制。結(jié)果發(fā)現(xiàn),造模8周后模型組大鼠血清中TIMP-1、MMP-2水平顯著升高,MMP-1、MMP-13水平則顯著降低;預(yù)防性給予抑毒調(diào)肝合劑后,血清中TIMP-1、MMP-2水平顯著降低,MMP-1、MMP-13水平則顯著升高,提示抑毒調(diào)肝合劑能明顯升高肝纖維化大鼠血清中MMP-1、MMP-13水平并下調(diào)血清中TIMP-1、MMP-2水平,使TIMP表達下降并解除對MMP的抑制,從而增加ECM的降解。

    不論何種病因引起的肝纖維化,肝細胞損害是共同的始動因子,而臨床研究和動物實驗均提示肝纖維化的發(fā)生發(fā)展直接或間接與氧化應(yīng)激、氧自由基損傷、脂質(zhì)過氧化有關(guān)[10-11]。抑毒調(diào)肝合劑中多種成分具有清除氧自由基、抑制脂質(zhì)過氧化的藥理作用[12-13]。MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的終末產(chǎn)物,其高低間接反映了機體細胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。本研究發(fā)現(xiàn),CCl4復(fù)合因素作用后,在大鼠肝纖維化形成的同時,肝組織中MDA水平顯著升高,這表明肝纖維化形成與氧化應(yīng)激有關(guān)。而SOD、GSH-Px、CAT等氧化指標(biāo)水平顯著降低,則更加證實了這點。預(yù)防給予抑毒調(diào)肝合劑后,顯著降低了大鼠血清中ALT、AST水平和肝組織中MDA水平,提高了肝組織中SOD、GSH-Px、CAT的水平,提示抑毒調(diào)肝合劑對肝細胞的保護作用與抑制氧化應(yīng)激及脂質(zhì)過氧化反應(yīng)有關(guān)。

    TGF-β1、TNF-α主要由肝星狀細胞(HSC)、庫普弗細胞等產(chǎn)生。研究表明,TGF-β1在ECM的合成和降解過程起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用。TGF-β1對肝纖維化的調(diào)控主要是通過TGF-β1/Smad信號傳導(dǎo)通路實現(xiàn)的,可促進ECM的合成,增加ECM的沉積,還可通過抑制MMP等多種水解酶的產(chǎn)生與活性、增加TIMP的表達,從而減少ECM的降解。TNF-α能明顯抑制活化HSC凋亡,直接刺激HSC增殖和膠原合成,還能增強TGF-β1對HSC增殖和膠原合成的刺激作用[14]。本研究發(fā)現(xiàn),抑毒調(diào)肝合劑高劑量組大鼠血清和肝組織中TGF-β1和TNF-α水平均較模型組降低,提示TGF-β1、TNF-α表達減少可能是抑毒調(diào)肝合劑抗肝纖維化的分子機制之一,與TGF-βl/ Smad信號傳導(dǎo)通路下游的關(guān)系將是筆者下一步研究的方向。

    綜上所述,抑毒調(diào)肝合劑能明顯改善大鼠肝功能,具有一定的抗肝纖維化作用。其作用機制可能與抗氧化應(yīng)激、抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、抑制HSC活化、降低TGF-β1水平、調(diào)節(jié)TIMP/MMP平衡、減少ECM沉積等有關(guān)。但其更多分子乃至基因水平的作用機制還有待進一步研究。

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    Study on Anti-hepatic Fibrosis Effects of Yidu Tiaogan Mixture on Rats and Its Mechanism

    LUO Hongli,XIAO Shunlin,YU Xin(Dept.of Pharmacy,the Affiliated Hospital of Southwest Medical University,Sichuan Luzhou,646000,China)

    OBJECTIVE:To study the anti-hepatic fibrosis effects of Yidu tiaogan mixture on rats and its mechanism.METHODS:60 SD rats were randomly divided into normal group,model group,colchicine group(positive control,0.2 mg/kg)and Yidu tiaogan mixture low-dose,medium-dose and high-dose groups(2.7,5.4,10.8 mL/kg).Except for normal group,liver fibrosis model was induced in other groups,and they were given relevant medicine intragastrically during modeling,once a day,for 8 weeks.Serum levels of ALT,AST,HA,PCⅢ,CⅣ,TIMP-1,MMP-1,MMP-2,MMP-13,TGF-β1and TNF-α and the levels of Hyp,SOD,GSH-Px,CAT,MDA,TGF-β1and TNF-α in liver tissue were detected in rats.RESULTS:Compared with normal group,the serum levels of ALT,AST,HA,PCⅢ,CⅣ,TIMP-1,MMP-2,TGF-β1and TNF-α were increased significantly in model group,while the serum levels of MMP-1 and MMP-13 were decreased significantly(P<0.05);the levels of Hyp,TGF-β1,TNF-α and MDA in liver tissue were increased significantly,while the levels of SOD,GSH-Px and CAT were decreased significantly(P<0.05).Compared with model group,the serum levels of ALT,AST,HA,PCⅢ,CⅣ,TIMP-1 and TNF-α as well as the levels of Hyp,TGF-β1,TNF-α and MDA in liver tissue were all decreased significantly of rats in Yidu tiaogan mixture mediumdose,high-dose and colchicine groups(P<0.05);the serum levels of MMP-1 and MMP-13 as well as the level of CAT in liver tissue were increased significantly in Yidu tiaogan mixture high-dose group and colchicine group(P<0.05),while the serum levels of MMP-2 and TGF-β1were decreased significantly(P<0.05).There was no statistical significance in above indexes in Yidu tiaogan mixture low-dose group(P>0.05).CONCLUSIONS:Yidu tiaogan mixture exerts protective effects on liver fibrosis of rat through regulating TIMP/MMP balance,suppressing oxidative stress,decreasing the level of TGF-β1and reducing deposition of extracellular matrix in liver.

    Yidu tiaogan mixture;Liver fibrosis;Rat

    R285.5

    A

    1001-0408(2017)04-0501-04

    瀘州市科技計劃項目[No.2015-S-45(3/5)]

    *副主任藥師,碩士。研究方向:中藥藥理學(xué)、臨床藥學(xué)。E-mail:luohongli@stu.xjtu.edu.cn

    DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.04.19

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