2-甲氧基雌二醇及其合成中間體的大鼠肺細胞膜色譜行為

張青青，張 苗，尚彩紅，周建華，郭麗芳，杜 斌

1)鄭州大學第二附屬醫(yī)院藥劑科 鄭州 450014 2)沈陽藥科大學藥學院藥物制劑教研室 沈陽 110016 3)鄭州大學藥學院藥物分析教研室 鄭州 450001

2-甲氧基雌二醇及其合成中間體的大鼠肺細胞膜色譜行為

張青青1)，張 苗2)，尚彩紅1)，周建華1)，郭麗芳1)，杜 斌3)#

1)鄭州大學第二附屬醫(yī)院藥劑科 鄭州 450014 2)沈陽藥科大學藥學院藥物制劑教研室 沈陽 110016 3)鄭州大學藥學院藥物分析教研室 鄭州 450001

#通信作者，女，1968年8月生，博士，教授，碩士研究生導師，研究方向：抗腫瘤藥物的研發(fā)，E-mail:dubin@zzu.edu.cn

2-甲氧基雌二醇；細胞膜色譜；靶向性

目的：探討實驗室合成的2-甲氧基雌二醇(2-ME)及其合成中間體的大鼠肺細胞膜色譜行為。方法：經篩選，大鼠細胞膜色譜條件為自制大鼠肺細胞膜色譜柱(10 mm×2 mm)，流動相為10 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)，柱溫為37 ℃，流速為0.2 mL/min。以沙丁胺醇為陽性對照，以容量因子k′作為指標，考察2-ME及其合成中間體在大鼠肺細胞膜色譜柱上的保留特性。結果：2-ME及合成中間體1、2號化合物在大鼠肺細胞膜色譜柱上均有吸附，且k′依次為2號化合物>1號化合物>2-ME；合成中間體3及4號化合物未表現(xiàn)出吸附特性。2-ME與大鼠肺細胞膜色譜柱的親和力大于純硅膠色譜柱、大鼠心肌細胞膜色譜柱和肝細胞膜色譜柱。結論：2-ME在大鼠肺細胞膜上具有特異性親和。

細胞膜色譜法(cell membrane chromatography，CMC)[1]是將活性組織細胞膜包裹在大孔硅膠表面，利用藥物與膜受體間存在的特異性親和力，在體外動態(tài)地模擬藥物與靶細胞的相互作用，研究藥物與受體的親和性、可逆性和競爭性的新型親和色譜技術。該色譜技術在1996年由賀浪沖教授首先提出[2]，經過近年的不斷發(fā)展，研究人員[3-5]已成功建立了血管內皮細胞、血管平滑肌細胞、β-胰島細胞、小鼠巨噬細胞和腫瘤細胞等CMC模型,用以篩選中藥活性成分或者研究藥物與受體的相互作用。通過對CMC模型的改造，目前已建立起集“活性識別-色譜分離-分析鑒定”于一體的在線二維分析系統(tǒng)[6]。研究人員[6-7]還通過外源重組質粒技術構建了受體高表達CMC模型，改善了傳統(tǒng)CMC法中“目標”受體不可控的缺點。

據研究[8]報道，靜脈給藥時，藥物粒徑大小直接影響制劑的分布取向。當粒徑大于7 μm時，藥物可被肺毛細血管截留；而粒徑在2～7 μm時，藥物可以通過血管床，進入肝、脾或其他組織；粒徑在0.05～2.00 μm時，藥物可以很快被單核巨噬細胞系統(tǒng)吞噬，可靶向肝臟。已有研究[9]證實，2-甲氧基雌二醇(2-methoxyestradiol, 2-ME)納米混懸劑具有明顯的肺靶向性，同時2-ME普通溶液的肺靶向性雖不及納米混懸劑強，但也有一定的肺靶向性，推測其原因可能是2-ME與肺泡表面受體的特異性結合造成的，因此有必要探尋2-ME是否對大鼠肺泡表面受體有親和性。作者考察了2-ME及其一些合成中間體的CMC行為，以期為更深入的藥理活性探尋提供有益指導。

1 儀器、試劑與方法

1.1 主要儀器和試劑 Agilent 1200高效液相色譜儀(美國Agilent公司)，AR 1140電子天平(梅特勒-托利多儀器公司)，HMS-350型渦旋振蕩器(天津恒奧科技發(fā)展有限公司)，Z36HK型冷凍離心機(德國Hermle公司), 電熱鼓風干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司), RPL-ZD10型裝柱機(大連日普利科技儀器有限公司), SHB-Ⅲ型循環(huán)水真空泵(鄭州長城科工貿有限公司), PHS-3C型pH計(上海雷磁儀器有限公司), KQ-300DE超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。2-ME及其合成中間體1、2、3、4號化合物(自制)，沙丁胺醇(中國藥品生物制品檢驗所)，磷酸氫二鈉、氯化鈉(分析純，天津科密歐化學試劑有限公司)，甲醇(色譜純，天津四友精細化學品有限公司)，大孔硅膠(5 μm，青島美高有限公司)。

1.2 溶液的配制 生理鹽水：精密稱取NaCl 0.9 g，溶解于100 mL超純水中，置于4 ℃?zhèn)溆?。低滲緩沖液：精密稱取Tris 0.605 g,KCl 0.370 g,MgSO4·7H2O 0.253 g，溶解于500 mL超純水中，用HCl調節(jié)pH值為7.4后，4 ℃儲存?zhèn)溆谩?0 mmol/L磷酸鹽緩沖液：精密稱取Na2HPO41.79 g,溶解于500 mL超純水中，用H3PO4調節(jié)pH值為7.4后，4 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 CMC模型的建立

1.3.1 大鼠肺、心肌、肝細胞膜的制備 取健康SD大鼠(鄭州大學實驗動物中心提供)，斷頸處死，立即解剖，依次取出心臟、肺和肝臟組織，分別置于4 ℃生理鹽水中洗凈血污。取1 g肺組織，在少量4 ℃ 生理鹽水中剪碎后，轉移至玻璃勻漿器中，并加入約10 mL 4 ℃生理鹽水,冰浴條件下仔細勻漿至液狀。將勻漿液轉入50 mL離心管中， 3 000g離心10 min,棄去上清液;向沉淀中加入20 mL生理鹽水重新混懸并勻漿，3 000g離心10 min，棄去上清液;重復此操作2 ～ 3次，直至上清液無色。向沉淀中加入10 mL 4 ℃低滲緩沖液，冰浴下超聲破膜30 min。將混懸液勻漿后，1 000g離心10 min，取上清液至另一個離心管中,然后12 000g離心20 min，棄去上清液;向沉淀中加入10 mL生理鹽水并重新渦旋，再次12 000g離心20 min,沉淀即為肺細胞膜。向肺細胞膜沉淀中加入5 mL生理鹽水，得細胞膜懸液，備用。心肌、肝細胞膜混懸液的制備同上。

1.3.2 硅膠預處理 取2.5 g大孔硅膠置于100 mL燒杯中，加入1.0 mol/L 鹽酸溶液50 mL混懸，超聲混合15 min 后轉移至100 mL 三頸瓶中，磁力攪拌下120 ℃回流2 h。將混懸液轉移至1 000 mL 燒杯中，加入適量蒸餾水并攪拌，靜置，棄去上清液;重復上述操作3～4次，直至上清液pH為7。最后用G4玻璃坩堝抽濾，120 ℃活化7 h,備用。

1.3.3 色譜固定相的制備 取已活化處理過的大孔硅膠50 mg，置于 20 mL具支試管中,在抽真空和渦旋條件下快速注入5 mL 細胞膜混懸液渦旋反應5 min。將混合物轉移至10 mL 離心管，4 ℃下磁力攪拌30 min,然后1 000 r/min離心5 min，棄去上清，向沉淀中加入4 ℃生理鹽水并重懸，然后500 r/min離心5 min ，棄上清，以除掉未結合的細胞膜，向沉淀中加入10 mmol/L磷酸鹽緩沖液5 mL，渦旋混合均勻，4 ℃放置過夜,即得肺細胞膜固定相。

1.3.4 色譜柱的制備 采取濕法裝柱。將色譜柱管(10 mm×2 mm)一端扣上篩板，未安裝篩板的一端朝上，裝入裝柱機柱套中。打開裝柱機勻漿管上端的螺帽，將放置過夜的固定相混懸液渦旋后注入該勻漿管內，并加入10 mmol/L磷酸鹽緩沖液至滿，安裝勻漿管上端螺帽并擰緊。開啟裝柱機，以10 mmol/L磷酸鹽緩沖液為流動相，調整流速為2 mL/ min，使裝柱機壓力穩(wěn)定在10 MPa左右，持續(xù)5 min后，關閉電源，打開裝柱機勻漿管，取出色譜柱管，立即安裝另一端篩板，即得細胞膜色譜柱。

1.3.5 色譜條件的確定 在上述實驗條件下，由于固定相表面包裹著肺細胞膜，為了保持肺細胞膜上酶或受體的生物活性，采用pH 7.4的10 mmol/L磷酸鹽緩沖液作為流動相，而且選用0.2 mL/min 的低流速和37 ℃的柱溫來模擬體內環(huán)境。通過紫外掃描，確定2-ME及其合成中間體1、2、3、4號化合物，沙丁胺醇的紫外吸收波長依次為288、285、283、285、287、276 nm。

1.4 2-ME及其合成中間體與大鼠肺細胞膜色譜柱的親和力測定 用10 mmol/L磷酸鹽緩沖液平衡大鼠肺細胞膜色譜柱2 h后，進樣(2-ME及其合成中間體1、2、3、4號化合物，沙丁胺醇)10 μL進行檢測。根據實驗結果計算溶質容量因子k′，用以表示作用強度。k′= (tR-t0)/t0，其中tR為溶質保留時間，t0為不保留的溶劑流出時間，單位均為min。

1.5 2-ME與不同色譜柱親和力測定 用10 mmol/L磷酸鹽緩沖液分別平衡純硅膠色譜柱、大鼠心肌細胞膜色譜柱和肝細胞膜色譜柱2 h后，進樣2-ME 10 μL進行檢測，計算k′。

2 結果

2.1 色譜特征 以沙丁胺醇為陽性對照物，以硅膠色譜柱為對照， 2-ME，合成中間體1、2號化合物在肺細胞膜色譜柱有保留，合成中間體3、4號化合物沒有保留，見圖1。

左：硅膠色譜柱；右：肺細胞膜色譜柱；從上到下依次為：沙丁胺醇，2-ME，1、2、3、4號化合物。圖1 試樣在不同色譜柱上的保留行為色譜圖

2.2 2-ME及其合成中間體與大鼠肺細胞膜色譜柱的親和力 實驗重復3次，平行性良好，實驗結果見表 1。根據k′大小，可判斷被檢測物與大鼠肺細胞膜色譜柱的親和力大小依次為：沙丁胺醇>2號化合物>2-ME>1號化合物。

表1 被檢測物與大鼠肺細胞膜色譜柱的親和力

2.3 2-ME與不同色譜柱的親和力 實驗重復3次，平行性良好，實驗結果見表2，可見2-ME與大鼠肺細胞膜色譜柱的親和力最大。

表2 被檢測物與不同色譜柱的親和力

3 討論

已有的對細胞膜色譜的研究主要集中在建立大鼠血管內皮細胞膜色譜模型和心肌細胞膜色譜模型方面[3]。該實驗首次建立了大鼠肺細胞膜色譜模型。與心肌和血管相比，肺組織具有較多的結締組織，故在制備肺細胞膜混懸液過程中，需要加大對肺組織的勻漿強度并延長勻漿時間。在實驗操作中，作者比較了T25數(shù)顯型高速分散機(ULTRA-TURRAX)和玻璃勻漿器的勻漿效果，結果發(fā)現(xiàn)T25數(shù)顯型高速分散機不能完全將肺組織打碎成細胞懸液，在后續(xù)裝柱過程中，出現(xiàn)堵住篩板的現(xiàn)象；而玻璃勻漿器能充分將肺組織研磨為細胞懸液，并實現(xiàn)成功裝柱。裝柱過程中，在10 MPa壓力下裝柱過程持續(xù)5 min即可，若持續(xù)時間過久，則色譜柱管裝填固定相過于厚實，在樣品分析過程中整個色譜系統(tǒng)壓力過高，甚至出現(xiàn)崩漏現(xiàn)象。由于高溫、過酸或過堿的環(huán)境均有可能對蛋白質造成破壞，使其失去活性，降低藥物與受體的結合[10]，因此，在建立細胞膜色譜模型過程中需要時刻維持4 ℃的環(huán)境，以免細胞膜上的酶或受體在實驗處理過程中失活。在分析過程中，采用pH 7.4 的磷酸鹽緩沖液作為流動相，0.2 mL/min的低流速和37 ℃的柱溫來模擬體內環(huán)境[11]。

藥物若要發(fā)揮藥效，藥物分子必須與受體相互結合,只有能與受體結合的藥物分子才可能具有藥效。研究[12]表明，活性分子在細胞膜色譜模型上的保留行為與其生物活性密切相關；有保留的分子可能具有生物活性，而沒有保留的分子由于不與膜受體結合，難以具有相應的生物活性。利用細胞膜色譜模型篩選活性藥物，就是通過色譜保留行為篩選出與細胞膜及膜上受體相結合的化合物。k′和親和力之間存在一定的正相關性，k′很大程度上反映化合物的內在活性，并與藥效作用顯著相關[12-13]。藥物與受體的結合具有專一性,若兩種藥物作用于同一受體，則兩種藥物在色譜柱上的保留時間應該相接近。該實驗中，沙丁胺醇在大鼠肺細胞膜色譜柱上的保留時間與2-ME不一致，說明兩種藥物作用于不同的受體。雖然該實驗未能進一步研究2-ME受體的類型，但實驗結果可為以后分離研究提供參考。通過比較2-ME及其合成中間體1、2號化合物的k′，合成中間體2號化合物對大鼠肺細胞膜上的受體具有更強的親和力。而體外藥效學研究[13]結果也顯示2號化合物確實表現(xiàn)出最大的體外抗癌活性。

總之，該實驗揭示了2-ME在大鼠肺細胞膜上的特異性親和，為2-ME藥效學研究提供了一定的實驗基礎。同時實驗結果也表明合成中間體1號和2號化合物對大鼠肺細胞膜上的某些受體具有特異性親和，可以通過體外藥效學實驗考察該兩種化合物的抗癌活性，并進一步做肺癌藥效學實驗，將其結果與細胞膜色譜實驗結果進行相關性分析。

[1]侯曉芳,杜暉,賀曉雙,等.細胞膜色譜法用于藥物與受體相互作用研究進展[J].藥學進展,2015,39(12):882

[2]賀浪沖,楊廣德,耿信篤.固定在硅膠表面細胞膜的酶活性及其色譜特性[J].科學通報,1999,44(6):632

[3]馮穎淑,童珊珊,徐希明,等.親和色譜應用于天然活性成分篩選的研究進展[J].中國中藥雜志,2015,40(6):1032

[4]LI WF，NIU XF，ZHOU P，et al.A combined peritoneal macrophage/cell membrane chromatography and offine GC-MS method for screening anti-inflammatory components from Chinese traditional medicine Houttuynia cordata Thunb[J]．Chromatographia，2011，73(7)：673

[5]CHEN XF,CAO Y,LV DY,et al.Comprehensive two-dimensional HepG2/cell membrane chromatography/monolithic column/time-of-flight mass spectrometry system for screening anti-tumor components from herbal medicines[J].J Chromatogr A,2012,1242:67

[6] HE H，HAN SL，ZHANG T，et al．Screening active compounds acting on the epidermal growth factor receptor from Radix scutellariae via cell membrane chromatography online coupled with HPLC/MS[J]．J Pharm Biomed Anal，2012，62：196

[7]DU H,WANG SC,REN J,et al.Revealing multi-binding sites for taspine to VEGFR-2 by cell membrane chromatography zonal elution[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2012,887/888:67

[8]崔福德.藥劑學[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2014:537

[9]賈欣,韓淑萍,孫惠斌,等.肺癌荷瘤小鼠體內組織中2-甲氧基雌二醇納米混懸劑的分布[J].鄭州大學學報(醫(yī)學版),2014,49(6):792

[10]楊榮.β2-腎上腺素受體與藥物相互作用的研究[D].西安:西北大學,2008.

[11]HOU XF,ZHOU MZ,JIANG Q,et al.A vascular smooth muscle cell membrane chromatography-offline-gas chromatography mass spectrometry method for recognition,separation and identification of active components from traditional Chinese medicines[J].J Chromatogr A,2009,12(16):7081

[12]楊廣德,賀浪沖,邊曉麗,等.胰島β-細胞膜色譜模型建立及其生物親和特性[J].科學通報,2005,50(16):1709

[13]張崇威.2-甲氧基雌二醇衍生物的合成及其抗腫瘤活性的研究[D].鄭州:鄭州大學,2011.

(2016-06-28收稿 責任編輯王 曼)

Establishment of rat lung cell membrane chromatography and chromatographic affinity of 2-methoxyestradiol and synthetic derivatives

ZHANGQingqing1),ZHANGMiao2),SHANGCaihong1),ZHOUJianhua1),GUOLifang1),DUBin3)

1)DepartmentofPharmacy,theSecondAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450014 2)DepartmentofPharmaceuticalPreparationSchoolofPharmacy,ShenyangPharmaceuticalUniversity,Shenyang110016 3)DepartmentofPharmaceuticalAnalysis,SchoolofPharmacy,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001

2-methoxyestradiol;cell membrane chromatography;targeting

Aim: To screen the activity of 2-methoxyestradiol(2-ME) and synthetic derivatives by rat lung cell membrane chromatography.Methods: The lung cell membrane stationary phase(CMSP) was packed into a stainless steel column(10 mm×2 mm), and the HPLC conditions were as follows:a mobile phase consisted of 10 mmol/L phosphate buffer (pH 7.4) at a flow rate of 0.2 mL/min, and the column temperature was 37 ℃. Salbutamol was used as positive control in the screening. The capacity factork′ as chromatographic parameters was used to describe the affinity of 2-ME and its synthetic derivatives. Results: 2-ME,NO.1 synthetic derivative and NO.2 synthetic derivative had chromatographic retention on lung CMSP column andk′ of NO.2 was greater than NO.1 and 2-ME. Thek′ of 2-ME with rat lung CMSP was higher than those with pure silica gel column,rat cardiac muscle CMSP and liver CMSP.Conclusion: 2-ME has the property of specific affinity on the membrane of the rat lung cell membrane.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.02.027

R979.1