基于UPLCESIMS/MS的何首烏中12種真菌毒素污染檢測

李春 蘇曉 馮偉紅 李嬈嬈 劉曉謙 李鵬躍 王智民

[摘要]通過測定何首烏中多種真菌毒素的含量，探討其致肝毒性原因。采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測何首烏中黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2，赭曲霉毒素A，B，T2毒素，HT2毒素，伏馬毒素B1，B2，玉米赤霉烯酮和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇共12種真菌毒素的含量。樣品采用改良的QuEChERS方法提取，使用WelchUltimate XBC18色譜柱（46 mm×100 mm，25 μm）分離，甲醇含01%乙酸的2 mmol·L-1醋酸銨水溶液為流動相梯度洗脫，多反應(yīng)監(jiān)測模式下測定，外標(biāo)法定量。結(jié)果表明，12種真菌毒素在01～200 μg·kg-1線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為 0996 3～0999 9，加標(biāo)回收率為 7119%～9868%，相對標(biāo)準偏差為17%～13%。該方法操作簡單、準確、靈敏，可用于何首烏中多種真菌毒素的快速測定。結(jié)果顯示，41批樣品中的15批檢出了真菌毒素，涉及毒素類型有AFB1，AFG2，F(xiàn)B1，OTB，T2，HT2，F(xiàn)B2和OTA共8種，毒素在051～1 6432 μg·kg-1。其中1批制首烏中檢測到AFB1，達68 μg·kg-1，超出了其在2015年版《中國藥典》中的限量標(biāo)準（5 μg·kg-1）。AFB1具有明確的肝毒性。因此，推測何首烏在產(chǎn)地加工、儲存運輸過程中產(chǎn)生的少量霉變樣品是其導(dǎo)致肝損傷的重要因素之一。

[關(guān)鍵詞]何首烏； 肝毒性； 真菌毒素； 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法； QuEChERS

Simultaneous determination of 12 mycotoxins in Polygoni Multiflori Radix by UPLCESIMS/MS combined with modified QuEChERS

LI Chun1，2， SU Xiao1，2，3， FENG Weihong1，2， LI Raorao1，2， LIU Xiaoqian1，2， LI Pengyue1， WANG Zhimin1，2*

（1 Institute of Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China；

2 National Engineering Laboratory for Quality Control Technology of Chinese Herbal Medicines， Beijing 100700， China；

3Tianjin University of Chinese Medicine， Tianjin 300100， China）

[Abstract]To investigate the cause of liver toxicity induced by Polygoni Multiflori Radix through determining various mycotoxins in it An UPLCESIMS/MS method was developed and established to simultaneously determine 12 mycotoxins， Aflatoxins B1， B2， G1， G2， Ochratoxins A and B， Fumonisins B1 and B2，T2 toxin， HT2 toxin， Deoxynivalenol and Zearalenone， in rawand processed Polygon iMultiflori Radix The sample was extracted with modified QuEChERS method， and then was separatedon a Welc

hUltimate XBC18 column by gradient elution using methanol and 2 mmol·L-1 ammonium acetate aqueous solution containing 01% acetic acidas mobile phase The analytes were detected in MRM mode by mass spectrometry and determined by external standard method This method made a good linearity in the 01200 μg·kg-1 with correlation coefficients of 0996 30999 9 The average recoveries of 12 mycotoxins at three spiked concentration levels were ranged from 7119% to 9868% with relative standard deviations of 17%13%. This method is simple， sensitive， accurate and suitable for the quantification of 12 mycotoxins in Polygoni Multiflori RadixAs a result， 15 batches were found fungus contamination and total 8 kinds of mycotoxins including AFB1， AFG2， FB1， OTB， T2， HT2， FB2 and OTA were detected， and their contentswere between 0511 6432 μg·kg-1 Among these contaminated samples， AFB1 was detected in one batch of processed Polygoni Multiflori Radix with the content of 68 μg·kg-1 beyond its limit standard 5 μg·kg-1 Since AFB1 has clear liver toxicity， we deduced that the mouldy samples may be one of the important causes of Polygoni Multiflori Radix causing liver toxicity

[Key words]Polygoni Multiflori Radix； hepatotoxicity； mycotoxins； ultraperformance liquid chromatography tandem mass spectrometry； QuEChERS

doi：10.4268/cjcmm20162313

何首烏為蓼科植物何首烏Polygonum multiflorum Thunb 的干燥塊根，始載于《開寶本草》，上千年來一直作為補益藥物廣泛應(yīng)用于臨床，現(xiàn)在更是大量用于藥品、保健食品、洗護發(fā)用品及食療保健中。近年來何首烏肝損傷問題引起國內(nèi)外的高度關(guān)注，也引發(fā)了國內(nèi)外學(xué)者關(guān)于其肝損傷真實性及其肝毒性物質(zhì)基礎(chǔ)的研究熱潮。針對何首烏肝損傷問題，許多學(xué)者采用常規(guī)毒理學(xué)方法進行研究，雖然因動物種屬、藥材來源、實驗設(shè)計方案之不同而有所差異，但結(jié)果均表明何首烏在臨床劑量下使用是安全無毒的，只有在超大劑量長期使用時才表現(xiàn)出一定的毒性[110]。針對其肝毒性物質(zhì)基礎(chǔ)，先后有“蒽醌致毒”[1114]、“二苯乙烯苷致毒”[1516]、“鞣質(zhì)致毒”[15]等推測，但研究結(jié)果多為推測，至今尚無定論。筆者前期也曾考察了何首烏中11個蒽醌類成分的肝毒性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)何首烏中所含的微量的蒽醌類成分并不足以導(dǎo)致其肝損傷[17]。那么，其肝損傷是不是由外在污染引起的呢？

研究中發(fā)現(xiàn)新鮮何首烏塊/片或何首烏個子貨放置在通風(fēng)處攤晾，1 d后許多樣品上就有發(fā)霉斑點產(chǎn)生。在藥材市場購買何首烏時，許多商家也提到何首烏容易發(fā)霉長斑之問題。臨床醫(yī)生也反映臨床上見到有些何首烏片外觀漂亮但掰斷后內(nèi)部發(fā)黑質(zhì)量堪憂。在百度中輸入關(guān)鍵詞“發(fā)霉何首烏”后可得到十幾萬個詞條。這些現(xiàn)象提示何首烏的霉變是較普遍存在的事實。既然有霉變就有可能產(chǎn)生真菌毒素。近年來，陸續(xù)有從何首烏中檢測到真菌毒素的報道，郭麗敏等[18]在制何首烏中檢測到黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2，總含量在 20～25 μg·kg-1；Zheng H等[19]在何首烏中檢測到黃曲霉毒素B1、赭曲霉毒素B和T2毒素等9種真菌毒素，總含量在 43～300 μg·kg-1。許多真菌毒素具有明確的肝毒性，那么何首烏的肝毒性是不是由霉變樣品產(chǎn)生的真菌毒素導(dǎo)致的呢？為此，本文擬采用改良的QuEChERS（quick，easy，cheap，effective，rugged，safe）方法對何首烏樣品進行前處理，并通過UPLCESIMS/MS技術(shù)檢測何首烏中12種真菌毒素的含量，以考察何首烏中真菌毒素的污染水平并從外在污染方面探討何首烏致肝毒性的原因。

1材料

超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國 Agilent 公司，包括Agilent 1200高效液相色譜儀，Agilent 6410B三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜，電噴霧離子源）。氮吹干燥儀（NEVAPTM112，美國，Organomation Associates，Inc公司），1/10萬分析天平（BAS1234SCW，德國，Sartorius 公司），高速離心機（Multifuge X1R，美國，Thermo公司），渦旋儀（WH2，中國，上海滬西公司），超聲波清洗器（KQ250DB，中國，昆山市超聲儀器有限公司）。

甲醇和乙腈（Fisher 公司，HPLC級），實驗用水為屈臣氏純凈水。醋酸銨（質(zhì)譜級，美國，F(xiàn)isher 公司），乙酸（優(yōu)級純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；無水硫酸鎂、氯化鈉、檸檬酸三鈉均為分析純（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；檸檬酸二鈉為分析純（阿法埃莎中國化學(xué)有限公司）。

黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2（批號分別為025M4092V，025M4138V，055M4047V，114M4032V，簡稱AFB1，AFB2，AFG1，AFG2），伏馬毒素B1和B2（批號分別為F1147，F(xiàn)3771，簡稱FB1，F(xiàn)B2），以上6種毒素均購自美國Sigma 公司。赭曲霉毒素A（Pribolab公司，批號1500427，100 mg·L-1，簡稱OTA），赭曲霉毒素B（Pribolab公司，批號1500414，10 mg·L-1，簡稱OTB），T2毒素（Pribolab公司，批號1500807，100 mg·L-1），HT2毒素（Pribolab公司，批號1500423，100 mg·L-1），脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（美國Supelco公司，批號XA15101V，200 mg·L-1，簡稱DON），玉米赤霉烯酮（美國 Sigma 公司，批號 SZEF021XV，100 mg·L-1，簡稱ZEN）。

41批何首烏樣品信息見表1，經(jīng)中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所李嬈嬈副研究員鑒定為何首烏 P. multiflorum的干燥塊根或其炮制品。

2方法與結(jié)果

21分析條件

色譜條件 Welch Ultimate XBC18色譜柱（46 mm×100 mm，25 μm）；流動相為甲醇（A）含01%乙酸的2 mmol·L-1醋酸銨水溶液（B），梯度洗脫（0～2 min，20%A；2～5 min，20%～60%A；5～10 min，60%～80%A；10～15 min，80%A；15～20 min，80%～95%A），流速 03 mL·min-1，柱溫30 ℃，進樣量 5 μL。

質(zhì)譜條件離子源：電噴霧離子源；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；毛細管電壓：40 kV；霧化氣流速：100 L·min-1；脫溶劑氣流速：300 L·min-1；脫溶劑管溫度：325 ℃；加熱模塊溫度：325 ℃。采集模式、監(jiān)測離子對（m/z）和其他參數(shù)見表2。

22混合對照品溶液的制備

各精密稱取黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2和伏馬毒素B1對照品適量，分別置10 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，制成100 mg·L-1的單標(biāo)儲備溶液，于-20 ℃冰箱中保存，備用。精密稱取伏馬毒素B2適量置10 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度為40 mg·L-1的儲備液，于-20 ℃冰箱中保存，備用。

各精密量取黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2儲備液100 μL置同一10 mL棕色量瓶中，加甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度為1 mg·L-1的黃曲霉毒素工作液。

精密量取赭曲霉毒素B標(biāo)準液（10 mg·L-1）05 mL至5 mL量瓶中，加甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度為1 mg·L-1的工作液。

精密量取脫氧雪腐鐮刀菌烯醇標(biāo)準液（200 mg·L-1）05 mL至10 mL量瓶中，加甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度為10 mg·L-1的工作液。

精密量取玉米赤霉烯醇標(biāo)準液（100 mg·L-1）1 mL至10 mL量瓶中，加甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度為10 mg·L-1的工作液。

分別精密吸取取黃曲霉毒素工作液1 mL、伏馬毒素B1儲備液100 μL、伏馬毒素B2工作液250 μL、赭曲霉毒素A標(biāo)準液50 μL、赭曲霉毒素B工作液1 mL、T2標(biāo)準液50 μL 、HT2標(biāo)準液100 μL、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇工作液1 mL、玉米赤霉烯醇工作液1 mL 置同一10 mL棕色量瓶中，加甲醇定容至刻度，配制成每mL含AFB1，AFB2，AFG1，AFG2，OTB各100 ng，T2和OTA各500 ng，DON，HT2，F(xiàn)B1，F(xiàn)B2和ZEN各1 μg的12種真菌毒素混合對照品溶液，置-20 ℃冰箱中保存，備用。

23供試品溶液的制備

取何首烏藥材粉末（過40目篩）20 g，精密稱定，置50 mL離心管中，精密加入4 mL純凈水，渦旋30 s，再精密加入1%的乙酸乙腈溶液10 mL，密閉，超聲（250 W，40 kHz）提取30 min，期間振蕩2次，取出，再分別精密加入40 g無水硫酸鎂，10 g氯化鈉，10 g檸檬酸三鈉，05 g檸檬酸二鈉，渦旋振蕩2 min，以4 500 r·min-1離心10 min，精密取上清液 5 mL，于40 ℃水浴中氮氣流吹干，用1 mL流動相（起始比例）復(fù)溶，渦旋混勻后過022 μm 微孔濾膜，即得。

24方法學(xué)驗證

241專屬性試驗在21的色譜質(zhì)譜條件下，12 種真菌毒素的MRM色譜圖見圖1。從圖可知，12種真菌毒素分離良好，而空白基質(zhì)加標(biāo)樣品的分析表明基質(zhì)成分不干擾待測真菌毒素的檢測。

242線性關(guān)系及定量限選取不含真菌毒素的何首烏作為陰性樣品，按23項下方法制備空白基質(zhì)溶液，添加不同量的真菌毒素混合對照品制作基質(zhì)加標(biāo)標(biāo)準曲線，以待測真菌毒素色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（μg·kg-1）為橫坐標(biāo)進行線性回歸。以3倍信噪比作為檢出限，10倍信噪比作為定量限。線性范圍、回歸方程及相關(guān)系數(shù)等參數(shù)見表3。

243加樣回收試驗分別精密吸取22項下的混合對照品溶液40，100，200 μL，各平行6份，置50 mL離心管中，氮氣流吹干后，取何首烏陰性樣品（No11）約20 g，精密稱定，按23項下方法制備供試品溶液A。按21項下方法進行試驗，測定各真菌毒素的峰面積（A）。

取何首烏陰性樣品（No11）約20 g，精密稱定，按23項下方法進行操作，至“精密取上清液 5 mL”，此時分別加入22項下的混合對照品溶液20，

50，100 μL，每個加入量各平行6份，其余操作同23項下，制備供試品溶液B。照21項下方法進行試驗，測定各真菌毒素的峰面積（B）。

提取回收率以峰面積A/B進行計算。12種真菌毒素的提取回收率為7119%～9868%，相對標(biāo)準偏差為17%～13%，結(jié)果見表3。

25樣品分析

取生、制何首烏樣品共41份，按上述方法測定，結(jié)果顯示41批何首烏中的15批檢出了真菌毒素，污染率達37%；檢出的真菌毒素有AFB1，F(xiàn)B2，OTA，AFG2，OTB，HT2，T2和FB1共8種。其中購自河南焦作的制首烏樣品（No37）中檢測到AFB1，達68 μg·kg-1，超出了2015年版《中國藥典》中AFB1的限量標(biāo)準。共有11批樣品中檢測到FB2，其污染率高達314 %，其中7號樣品中的FB2高達1 6432 μg·kg-1，超過了歐盟規(guī)定的玉米淀粉中FB2的限量標(biāo)準1 000 μg·kg-1[20]。外觀有明顯霉變的樣品（No1～7）中均檢測到2～5種真菌毒素不等，而外觀正常的34份樣品中有8份檢測到真菌毒素。結(jié)果見表4。

3討論

31方法優(yōu)化

液質(zhì)聯(lián)用分析流動相選擇需要同時兼顧物質(zhì)分離和離子化效率。本研究曾采用乙腈水、甲醇水、甲醇01%甲酸水、甲醇01%乙酸水、甲醇含01%乙酸的2 mmol·L-1醋酸銨、甲醇含01%乙酸的5 mmol·L-1醋酸銨作為流動相組成，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲醇比乙腈具有更高的靈敏度和更好的峰形，因此選擇甲醇作為流動相A。加入01%甲酸水或01%乙酸水后，各化合物電離程度加大，離子響應(yīng)值提高，二者效果相當(dāng)。當(dāng)加入含01%乙酸的2 mmol·L-1醋酸銨后，各真菌毒素響應(yīng)值均較單獨使用01%乙酸水時提高，其中T2和HT2毒素響應(yīng)值升高最明顯，當(dāng)醋酸銨濃度增大到5 mmol·L-1時，T2和HT2的響應(yīng)值呈降低趨勢，因此最終選擇含01%乙酸的2 mmol·L-1醋酸銨作為流動相B。

參考文獻[2123]方法，采用QuEChERS法進行樣品前處理。期間優(yōu)化了不同酸性乙腈（1%甲酸乙腈、1%乙酸乙腈、5%甲酸乙腈及5%乙酸乙腈）對真菌毒素的提取效率，結(jié)果顯示1%乙酸乙腈的提取效率最高。傳統(tǒng)Quechers方法需要在樣品提取后加入C18和PSA等吸附劑除雜來凈化樣品，本實驗曾比較了C18和PSA吸附劑的凈化效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)凈化處理后各毒素的回收率均低于提取后直接測定的回收率，而基線也未見明顯改善，因此選擇樣品提取后直接測定，不予凈化處理。

32霉變何首烏是否能導(dǎo)致肝損傷

黃曲霉毒素對人及動物肝組織有破壞，嚴重時可導(dǎo)致肝癌甚至死亡。2015年版《中國藥典》中共有大棗、水蛭、蓮子等19種中藥項下和包括南五味子、麩炒薏苡仁等14種中藥飲片項下制定了黃曲霉毒素的限量標(biāo)準，其中AFB1的質(zhì)量分數(shù)不得過5 μg·kg-1，AFB1，AFB2，AFG1和AFG2的總量不得

超過10 μg·kg-1。本次測定發(fā)現(xiàn)，購自河南焦作的制首烏（No37）中的AFB1達68 μg·kg-1，明顯超出了其限量標(biāo)準，而其表面看起來又很正常沒有霉點產(chǎn)生，因此這批樣品很可能會在市場上正常流通，如果某人正好服用了這批AFB1超標(biāo)的何首烏則有可能發(fā)生肝損傷。此外，某些表面發(fā)霉的樣品中雖然沒有檢測到劇毒的AFB1，但是檢測到有多種真菌毒素共存，而共同存在的真菌毒素會產(chǎn)生毒性增強和協(xié)同的效果，這種毒性作用比單一毒素的總和要強烈，而且共存的真菌毒素會產(chǎn)生潛在的不能預(yù)測的毒性作用[2426]。因此，無論是患者正好服用了AFB1超標(biāo)的某批何首烏樣品，還是正好服用了有多種真菌毒素共存的樣品后都有可能出現(xiàn)肝損傷。而且，尚有其他可能導(dǎo)致肝損傷的真菌毒素未被檢測，其在何首烏中的污染水平不得而知。

綜上，筆者推測何首烏霉變產(chǎn)生的真菌毒素是其導(dǎo)致肝損傷的重要原因之一。后續(xù)研究中，課題組將收集更多批次和來源的生、制何首烏樣品進行真菌毒素檢測，考察市場上何首烏出現(xiàn)真菌污染的幾率，為制定其真菌毒素的限量標(biāo)準提供依據(jù)。同時，課題組還將對何首烏中真菌毒素的產(chǎn)生條件和含量變化規(guī)律進行研究，為杜絕污染提高其用藥安全奠定基礎(chǔ)。

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[責(zé)任編輯孔晶晶]