基于微混合器的連續(xù)混合技術(shù)在丹參醇沉過程中的應(yīng)用

龔行楚+申基琛+瞿海斌

[摘要]連續(xù)制藥是國際制藥技術(shù)領(lǐng)域的發(fā)展方向之一。該研究采用膜分散法實現(xiàn)了丹參醇沉中加醇過程的連續(xù)化，考察了乙醇和濃縮液流量，以及醇料比等因素對醇沉效果的影響。乙醇和濃縮液流量增加能提高酚酸類活性成分的保留率，降低總固體去除率。醇沉上清液中活性成分純度主要受到乙醇和濃縮液流量比影響。該研究中連續(xù)流動加醇的混合效果與工業(yè)醇沉相當(dāng)。以膜分散混合器實現(xiàn)連續(xù)加醇，具有放大容易，單位體積處理量大，加醇過程穩(wěn)態(tài)易控等優(yōu)點，發(fā)展前景良好。

[關(guān)鍵詞]丹參； 醇沉； 膜分散； 連續(xù)制藥

Application of continuous mixing technology in ethanol precipitation

process of Salvia miltiorrhiza by using micromixer

GONG Xingchu， SHEN Jichen， QU Haibin*

（Pharmaceutical Informatics Institute， College of Pharmaceutical Sciences， Zhejiang University， Hangzhou 310058， China）

[Abstract]Continuous pharmaceutical manufacturing is one of the development directions in international pharmaceutical technology In this study， a continuous mixing technology of ethanol and concentrated extract in the ethanol precipitation of Salvia miltiorrhiza was realized by using a membrane dispersion method The effects of ethanol flowrate， concentrated extract flowrate， and flowrate ratio on ethanol precipitation results were investigated With the increase of the flowrates of ethanol and concentrated extract， retention rate of active phenolic acids components was increased， and the total solid removal rate was decreased The purity of active components in supernatants was mainly affected by the ratio of ethanol flowrate and concentrated extract flowrate The mixing efficiency of adding ethanol under continuous flow mixing mode in this study was comparable to that of industrial ethanol precipitation Continuous adding ethanol by using a membrane dispersion mixer is a promising technology with many advantages such as easy enlargement， large production per unit volume， and easy control

[Key words]Salvia miltiorrhiza； ethanol precipitation； membrane dispersion； continuous pharmaceutical manufacturing

doi：10.4268/cjcmm20162311

連續(xù)制藥是藥品生產(chǎn)的發(fā)展趨勢[1]。與間歇制藥相比，連續(xù)制藥的優(yōu)勢有：生產(chǎn)設(shè)備占地小，生產(chǎn)周期短，中間體儲存成本低，增加產(chǎn)量容易，生產(chǎn)過程更安全，過程監(jiān)控更容易，批次之間質(zhì)量波動小等。連續(xù)制藥有利于提高藥品生產(chǎn)的靈活性和藥品質(zhì)量的一致性[1]。目前中成藥生產(chǎn)采用間歇生產(chǎn)方式，缺乏連續(xù)制藥技術(shù)。

醇沉是中成藥生產(chǎn)常用工藝，為間歇操作方式，通常先將乙醇加入濃縮液，然后靜置冷藏。濃縮液粘度和密度均明顯大于乙醇。在加醇過程中，濃縮液和乙醇難以迅速混合均勻，容易出現(xiàn)局部醇濃度過高的現(xiàn)象。此外，醇沉過程大量產(chǎn)生的沉淀容易包裹未和乙醇充分混合的濃縮液，造成活性成分包裹損失[2]。

微分散技術(shù)通過采用不同內(nèi)部結(jié)構(gòu)的微混合器，能夠連續(xù)實現(xiàn)多種流體的高效混合[3]。和傳統(tǒng)混合技術(shù)相比，微混合器內(nèi)流體流動和分散尺度要小1～2個數(shù)量級，流體在微混合器內(nèi)的體積傳質(zhì)系數(shù)達(dá)到傳統(tǒng)設(shè)備的10～100倍[4]。微混合器種類眾多，其中膜分散式混合器具有處理量大，單位體積能耗小的優(yōu)點，其原理是一種流體經(jīng)過膜孔，被分割為微米級的流體，然后與另一種流體接觸混合。

如果用膜分散式混合器進(jìn)行濃縮液和乙醇的連續(xù)流動混合，根據(jù)駱廣生課題組的研究結(jié)論[56]，可以認(rèn)為混合效果主要受濃縮液和乙醇兩相的流量大小影響?；旌蠒r乙醇和濃縮液的流量之比相當(dāng)于單位體積濃縮液中乙醇的加入量（醇料比，ECR），影響濃縮液和乙醇充分混合時上清液中的溶劑組成[7]。溶劑組成同時影響活性成分和雜質(zhì)的溶解度，進(jìn)而影響活性成分沉淀損失量、雜質(zhì)成分去除量以及上清液中活性成分純度。

本文以丹參醇沉工藝為例，采用膜分散式混合器，連續(xù)地將濃縮液和乙醇通過混合器，實現(xiàn)醇沉工藝的加醇操作，考察流量和醇料比對醇沉效果的影響程度，探討這種連續(xù)流動加醇方式的優(yōu)點和不足。

1材料

高效液相色譜儀（Agilent 1100系列，安捷倫科技有限公司）；低溫恒溫槽（THD1008W，寧波天恒儀器廠）；電子天平（AB204N，Mettler Toledo公司）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DHG9146A，上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；齒輪泵（WT30001FB，蘭格恒流泵有限公司）。

丹參水提濃縮液（批號20151106，正大青春寶藥業(yè)有限公司提供）；丹酚酸B對照品（批號151206，純度>99%），丹參素對照品（批號160120，純度>98%），原兒茶醛對照品（批號151105，純度>99%），迷迭香酸對照品（批號151124，純度>99%）和紫草酸對照品（批號151120，純度>98%）均購自上海融禾醫(yī)藥科技有限公司；乙醇（純度>95%，浙江常青化工有限公司）；甲酸（純度>99%，美國迪爾股份有限公司）；磷酸（純度>98%，美國Fluka公司）；乙腈（色譜純，德國默克公司）；去離子水由水純化系統(tǒng)（MilliQ，Milford公司）制備。

2方法

21裝置實驗采用的膜分散連續(xù)流動加醇裝置示意圖見圖1。膜分散式混合器結(jié)構(gòu)見圖2，其中混合槽寬度為1 mm，深度為1 mm。95%乙醇經(jīng)過1 000目不銹鋼膜后與濃縮液接觸。收集膜分散裝置出口的固液混合物，將其置于5 ℃的低溫恒溫槽中冷藏24 h后，取上清液進(jìn)行分析。

1濃縮液儲罐；2乙醇儲罐；3，4齒輪泵；5，6壓力表；7，8球閥；9膜分散式混合器；10醇沉液儲罐。

22實驗設(shè)計由于濃縮液可能存在小顆粒，有堵塞膜孔的隱患，所以采用讓乙醇通過膜的混合方式。此時乙醇為分散相，濃縮液為連續(xù)相。當(dāng)醇料比一定時，可根據(jù)濃縮液流量確定乙醇流量。本研究考察流量和醇料比2個工藝參數(shù)對活性成分保留率、活性成分純度、總固體去除率的影響。具體實驗條件見表1。

23分析方法采用高效液相色譜儀測定各樣品中原兒茶醛、丹參素、迷迭香酸、紫草酸和丹酚酸B等5種活性成分含量[8]。色譜柱使用反相色譜柱ExtendC18 柱（46 mm×250 mm， 50 μm）；流動相為01%甲酸（A）和純乙腈（B）；采用梯度洗脫，0～10 min，7%～17% B；10～16 min，17%～21% B；16～32 min，21%～21% B；32～40 min，21%～29%

B；40～44 min，29%～35% B；44～50 min，35%～72% B；50～70 min，72%～75% B。流速10 mL·min-1；柱溫25 ℃；紫外檢測波長281 nm；進(jìn)樣量5 μL。

總固體含量的測定采用稱重法[9]。準(zhǔn)確稱取適量樣品，置于干燥恒重的稱量瓶中，然后置于干燥箱中105 ℃下恒溫干燥3 h。取出稱量瓶放入干燥器中，冷卻至室溫后稱量。根據(jù)干燥前后樣品的質(zhì)量變化計算出對應(yīng)的總固體含量。

24數(shù)據(jù)處理膜分散醇沉總固體去除率（RS）、活性成分保留率（AR）、活性成分純度（AP）的計算公式分別如下。

RS=1-ms×SCsFc×t×ρc×SCc×100%（1）

AR=ms×ACsFc×t×ρc×ACc×100 % （2）

AP=ACSC×100% （3）

式中，m，SC，F(xiàn)，t，ρ，AC分別表示質(zhì)量、固含量、流量、樣品收集時間、密度、活性成分含量，下標(biāo)s和c分別表示上清液和濃縮液。

通過對總固體去除率和活性成分純度、保留率的計算來研究醇沉規(guī)律。本文采用公式（4）定量表征工藝參數(shù)對活性成分保留率等指標(biāo)的影響，如下。

Y=b0+b1·Fc+b2·ECR+b3·Fc·ECR+b4·F2c+b5·ECR2（4）

其中，Y為活性成分保留率、純度或總固體去除率，b0為常數(shù)項，b1～b5為偏回歸系數(shù)。采用逐步回歸法簡化方程，模型移入和移出特定項的P設(shè)定為001。相關(guān)擬合及作圖分別用Design Expert V8061（美國StatEase公司）和Origin 85（美國Origin Lab公司）完成。

3結(jié)果與討論

31活性成分保留率表1中列出了實驗所得活性成分的保留率。原兒茶醛保留率可以超過90%，迷迭香酸保留率可以達(dá)到近70%。丹參素、紫草酸和丹酚酸B保留率均低于50%。采用公式（4）擬合所得結(jié)果見表2和圖3。決定系數(shù)（R2）均大于093，說明模型可以解釋數(shù)據(jù)中大部分變異。對于所有活性成分保留率，b1均為正數(shù)，且P<001，說明醇料比一定時，活性成分保留率隨兩相流量增加而增加。推測其原因可能在于流量增加使乙醇被濃縮液切割形成了更小的液滴，所以混合更充分，包裹損失減少。對于丹參素和紫草酸的保留率，b2均為負(fù)數(shù)，且P<001，說明在濃縮液流量一定時，醇料比增加使這2種成分保留率下降。該結(jié)果和前期工作相符[10]。

32活性成分純度實驗所得活性成分純度見表1。醇沉后5種活性成分純度均有提高，說明醇沉后活性成分雖有損失，但雜質(zhì)去除更多?；钚猿煞旨兌鹊臄M合結(jié)果見表2，圖4。流量對活性成分純度影響較小。b2均大于0，且P<001，說明原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸和丹酚酸B等成分的純度隨醇料比增加而增加。

33總固體去除率總固體去除率結(jié)果見表1。采用公式（4）擬合所得結(jié)果見表2，其中系數(shù)b1為負(fù)數(shù)，b2為正數(shù)，且均為統(tǒng)計顯著?？偣腆w去除率隨濃縮液流量增加而下降，見圖5。

34討論俞翔等[11]報道了丹參醇沉工業(yè)數(shù)據(jù)，其中丹參素和丹酚酸B保留率最高值分別為445%，493%，和本研究實驗C5結(jié)果相當(dāng)。估算得實驗C5中濃縮液在混合槽中流速約為72 m·s-1，乙醇在流經(jīng)膜孔時的流速約為82 m·s-1，2股高速液體接觸有利于獲得良好混合效果，減少包裹損失?？紤]到增加2相流量可能進(jìn)一步提高混合效果，可以認(rèn)為膜分散流動加醇的混合效果不亞于工業(yè)醇沉混合效果。

常規(guī)“慢加快攪”的醇沉過程中，體系組成始終變化，加上沉淀逐漸產(chǎn)生，過程狀態(tài)監(jiān)控難度較大[12]。連續(xù)膜分散加醇使混合過程成為穩(wěn)態(tài)過程，檢測過程狀態(tài)相對容易，有利于提高過程質(zhì)控水平。如果用于工業(yè)生產(chǎn)，膜分散連續(xù)流動加醇工藝可以平行放大，也即多個相同膜分散混合器并聯(lián)運行，降低放大效應(yīng)。本實驗室自制的膜分散混合器外表體積約為40 cm3，濃縮液處理量可達(dá)25 L·h-1以上。理論上1 m3的生產(chǎn)空間可放置25 000個混合器，對應(yīng)濃縮液處理量為625 m3·h-1。如果能夠后續(xù)連續(xù)過濾和濃縮的裝置，那么生產(chǎn)能力將是非常大的。

膜分散式混合器和其他類型微混合器一樣會有加工難度高，密封要求高，操作不當(dāng)易堵塞等不足之處，同時也要求泵能提供較高的壓頭和穩(wěn)定的流量。

4結(jié)論

本文采用膜分散法實現(xiàn)丹參醇沉中濃縮液和乙醇2相連續(xù)流動混合。2相流速下降使活性成分保留率降低且總固體去除率上升。醇料比適當(dāng)提高使上清液活性成分純度上升。該法的混合效果和工業(yè)攪拌醇沉相當(dāng)。該法易于放大，且使加醇過程成為穩(wěn)態(tài)，有利于過程監(jiān)控，有望進(jìn)一步發(fā)展成為連續(xù)制藥工藝之一。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Lee S L， O′Connor T F， Yang X， et al Modernizing pharmaceutical manufacturing： from batch to continuous production[J] J Pharm Innov， 2015， 10（3）：191

[2]陳勇， 李頁瑞， 金胤池， 等 中藥醇沉工藝及裝備研究進(jìn)展與思考[J] 世界科學(xué)技術(shù)——中醫(yī)藥現(xiàn)代化， 2007（5）：16

[3]李根， 葉世超， 張則光， 等 液液微分散萃取傳質(zhì)模型的研究[J] 高校化學(xué)工程學(xué)報， 2015 （6）：1325

[4]徐建鴻， 駱廣生， 陳桂光， 等 液液微尺度混合體系的傳質(zhì)模型[J] 化工學(xué)報， 2005， 56（3）：435

[5]Chen G G， Luo G S， Li S W， et al Experimental approaches for understanding mixing performance of a minireactor [J] AIChE J， 2005， 51（11）：2923

[6]徐建鴻， 駱廣生， 陳桂光， 等 一種微型膜分散式萃取器[J] 化學(xué)工程， 2005， 33（4）：56

[7]Gong X C， Yan A Y， Qu H B Optimization for the ethanol precipitation process of botanical injection： indicator selection and factor influences[J] Sep Sci Technol， 2014， 49：619

[8]Cao J， Wei Y J， Qi L W， et al Determination of fifteen bioactive components in Radix et Rhizoma Salviae Miltiorrhizae by highperformance liquid chromatography with ultraviolet and mass spectrometric detection[J] Biomed Chromatogr， 2008， 22：164

[9]許之麟， 黃文華， 龔行楚， 等 設(shè)計空間法優(yōu)化黨參一次醇沉工藝[J] 中國中藥雜志， 2015， 40（22）：4411

[10]Gong X C， Wang S S， Qu H B Comparison of two separation technologies applied in the manufacture of botanical injections： second ethanol precipitation and solvent extraction[J] Ind Eng Chem Res， 2011， 50（12）：7542

[11]俞翔， 莫必琪， 王治， 等 丹參醇沉過程中丹參素、丹酚酸B和丹酚酸D的回收率預(yù)測研究[J] 中草藥， 2010， 41（6）：900

[12]Huang H X， Qu H B Inline monitoring of alcohol precipitation by nearinfrared spectroscopy in conjunction with multivariate batch modeling[J] Anal Chim Acta， 2011， 707（1）：47

[責(zé)任編輯孔晶晶]