縫隙連接蛋白43對心衰進程作用的研究進展

康曼，袁鳳波

(安徽省紅十字朝陽醫(yī)院，安徽淮南232007)

縫隙連接蛋白43對心衰進程作用的研究進展

康曼，袁鳳波

(安徽省紅十字朝陽醫(yī)院，安徽淮南232007)

縫隙連接蛋白43(Cx43)作為心室縫隙連接主要的構成成分，它的結構、表達、分布影響著心臟功能。在心衰代償階段至失代償階段，Cx43在結構、表達、分布、磷酸化水平以及功能等方面均發(fā)生改變。Cx43的改變會導致心室肌細胞的傳導速度和傳導各向異性的改變，影響物質的交換與信息的傳遞，對心衰發(fā)生進程有重要影響。

心力衰竭;縫隙連接蛋白43；縫隙連接；心肌重構

縫隙連接是介導心肌細胞間信息交流和能量傳導的重要膜結構，縫隙連接蛋白43(Cx43)作為心室縫隙連接主要的構成成分，它的結構、表達、分布影響著心臟功能。研究Cx43在心衰發(fā)生進程中所扮演的角色，對心衰的診斷、治療及新藥的研發(fā)有重要意義。

1 縫隙連接與Cx43

縫隙連接分布廣泛，幾乎存在于所有的動物細胞中。它是一種特殊的連接細胞間細胞質的膜結構，是相鄰細胞間直接的電通道和代謝通道，從而同步化生理活動[1]。通過縫隙連接，可以完成細胞間的物質運輸，允許分子量在1.2 kD以下的分子通過，比如氨基酸、葡萄糖、ATP；離子Ca2+、Na+、Cl-；細胞信號分子IP3和cAMP以及潛在的功能性miRNAs[2]等。縫隙連接是一種動態(tài)結構，細胞內的pH值、Ca2+濃度和細胞膜電位的改變等都會影響通道的開放和關閉，而這種開與關通過蛋白磷酸化或蛋白激酶調節(jié)和控制。

縫隙連接由連接子構成，連接子是一種跨膜蛋白。每個連接子由4或6個相同或相似的連接蛋白亞基環(huán)繞中央形成孔徑為1.5～2 nm的水性通道，相鄰兩細胞分別用各自的連接子相互對接形成細胞間的通道，來完成細胞間信息交流和能量傳遞。迄今，在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)的縫隙連接蛋白有20多種，在不同的組織中其表達存在差異性，其中Cx43主要存在于心室中。研究表明，Cx43在內質網(wǎng)核糖體合成之后，運輸至高爾基復合體，最終在細胞膜聚集形成縫隙連接結構[3]。Cx43由382個氨基酸組成，羧基末端(C端)與氨基末端(N端)位于胞質內，從C端至N端，連續(xù)跨膜4次，形成了兩個胞外環(huán)和一個胞內環(huán)[3]。四個跨膜親水片段稱為M1～4，為α螺旋結構，兩個胞外環(huán)分別稱為E1～2和一個胞質環(huán)。

Cx43的N端相對保守，而C端的絲氨酸、蘇氨酸及酪氨酸殘基的磷酸化與去磷酸化水平影響著縫隙連接的形成及功能狀態(tài)。它們能夠感受胞內的信息變化而改變構象，從而調節(jié)縫隙連接傳導性。Cx43在心臟中的動態(tài)轉運可能是對細胞間偶聯(lián)和沖動傳導的重要調節(jié)機制。Cx43C末端241～382位點為其主要的磷酸化區(qū)，受到多種蛋白激酶的調節(jié)，也是多種激素的識別位點，對縫隙連接通道的組裝和功能的調節(jié)起到至關重要的作用[4]。例如，Cx43C端的絲氨酸殘基通過磷酸化去上調Ser325、Ser328、Ser364、Ser365、Ser330和Ser373,或下調Ser255、 Ser279、Ser282、Ser262和Ser368縫隙連接介導的細胞間通訊功能[5]，這些都是重要的磷酸化位點。在穩(wěn)態(tài)細胞的生命周期中，Cx43的不同位點都可以發(fā)生磷酸化，主要的磷酸化途徑包括：蛋白激酶C、PKA和PKG、蛋白酪氨酸激酶、MAPK和酪氨酸激酶1等。Cx43的各種磷酸化參與Cx43的整個代謝周期，包括轉運、組裝、解離、降解以及縫隙連接半通道和全通道的門控，從而影響Cx43正常的生理功能以及縫隙連接的細胞間通訊功能，進一步影響各種疾病的發(fā)生和發(fā)展。在多種心臟疾病的病例和模型中[6～10]，包括缺血、心肌肥厚和心動過速誘導的心肌病等，都存在著心室肌細胞中Cx43表達和磷酸化的改變。

2 心衰代償期Cx43 的變化

慢性心衰是一個多因素綜合作用的長期又復雜的過程。通常心臟發(fā)生病變時，首先會啟動代償機制，使心臟功能維持在與正常相當?shù)乃?，但通常有心肌肥大的表現(xiàn)，即心肌細胞的長度和寬度增加，伴隨著間質增生。心肌肥大時功能雖得到代償，但會出現(xiàn)心肌重構和一些組織、細胞或調節(jié)因子、信號通路等的變化，引發(fā)重構的特殊機制可能涉及到化學或體液介導的信號轉導通路的激活。在肥大心肌中，縫隙連接的重構過程復雜，包括干擾縫隙連接基因表達和蛋白的合成與降解以及其他空間結構的改變。

Cx43分布以及表達在心肌重構中發(fā)揮著重要的作用。細胞膜主動和被動轉運特性的改變，會引起異常的自主性、觸發(fā)活動以及折返性，這些都是肥大心室中致心律失常的底物，而縫隙連接是構成膜被動轉運的主要決定因素，它們組成的跨膜通道直接與相鄰細胞相聯(lián)系。在肥厚型心肌病人中，左心室中的Cx43會出現(xiàn)重塑，表達增加，出現(xiàn)側分布[11]。在擴張型心肌病人中，也有報道標記的Cx43表達減少，異質性增加，這會增加發(fā)生心律失常的風險。在缺血性心肌病中，遠離邊界區(qū)的Cx43表達下降[12]。在這些病理條件下，心室中不正常的傳導特性可能會歸因于或至少部分歸因于縫隙連接的重構。在大量的動物模型中對Cx43的研究也得到了相似的結果。例如，野百合堿誘導的肺動脈高壓模型中，肥大的右心室顯示在縫隙連接處典型Cx43分布紊亂。在肥厚右心室分離下來的心肌細胞中，Cx43并不是限定在閏盤處，而是廣泛離散分布在細胞表面。在肥大心室的組織切片中，Cx43分布在側面增加[8]。在一個肌鈣蛋白I突變引起肥厚性心肌病(HCM)的轉基因兔模型中，Cx43分布具有異質性，Cx43水平增加，磷酸化水平發(fā)生改變。在轉基因兔中，除了復極化時相的改變，沒有檢測到心電圖的異常，也就是說異質性表達的Cx43沒有導致心律失常加強，此可能緣于全部Cx43水平的增加[13]。在另一個HCM兔模型(β-肌球蛋白重鏈)中，檢測到Cx43水平的上調，但是僅是在中層心肌細胞中，對動作電位時程、傳導速率以及各向異性都沒有影響[14]。大鼠的HCM模型(野百合堿誘導的肺動脈高壓或者壓力負荷)表明，無論左、右心室，在閏盤處，橋粒斑蛋白分布正常，總Cx43水平正常，盡管之前有報道Cx43會在閏盤處重新分布到細胞質和心肌細胞的側面以及Cx43去磷酸化增加[8,15]。

在心臟的代償期，由于造模的方法不同，觀測的時間點不同，所使用的實驗動物不同等，出現(xiàn)的結果不盡相同。Cx43的表達增加或者減少，分布從端分布到側分布，無功能的Cx43增加，但在代償情況下，能夠維持正常的心臟功能。

3 心衰失代償期Cx43 的變化

各種心血管疾病發(fā)展的終末期即心力衰竭，表現(xiàn)為心臟收縮或舒張功能障礙，心輸出量降低，心臟射血不足引起心肌重構及心室重塑，從而不能滿足組織器官的代謝需求，心臟發(fā)生衰竭。心衰時，心肌收縮力下降，表現(xiàn)為非同步收縮功能下降。心肌收縮下降可能歸因于心臟組織的重塑、細胞間縫隙連接的脫偶聯(lián)和重新分布?？p隙連接在建立心肌同步收縮中至關重要，阻斷它使縫隙連接脫偶聯(lián)即可使收縮變?yōu)榉峭?。鑒于Cx43是縫隙連接的主要組成蛋白，有文獻報道Cx43在心肌缺血/再灌注損傷、心肌保護和神經(jīng)保護方面是一個新興的治療靶點[16]。

3.1 Cx43表達的變化 心衰時傳導紊亂與縫隙連接病變存在著很大關系，究其原因是嚴重的Cx43異質性。首先，表達量降低明顯。Poelzing等[17]報道，大量免疫原性的Cx43減少，伴隨著細胞間偶聯(lián)和傳導速度的下降，APD的跨壁離散增強；在一個慢性主動脈狹窄豚鼠模型中觀察到從肥大代償期過渡到失代償時，左心室Cx43減少，閏盤重構，心肌細胞的形狀也發(fā)生了改變[9]；在另一篇用傳統(tǒng)的腹主動脈縮窄所致的兔心衰模型中[18]，Cx43在三個心肌層表達明顯下降，尤其是中肌層的下降更有意義，增加的跨壁異質性Cx43可能會增強穿過心室壁的復極化分散，從而誘導惡性心律失常[18]。由先天性擴張心肌病或者缺血性心臟病發(fā)展而來的終末期心衰病人，Cx43表達量下調[7]；在壓力超負荷引起的失代償病人的心臟中(伴隨瓣膜性主動脈狹窄)，Cx43明顯下降。其他人類心臟疾病的研究報道顯示，除了肌纖維的紊亂，閏盤處Cx43的重新分布到心肌細胞的側面，都導致了Cx43在閏盤處分布的減少[11]。與之前Cx43下調形成對比，近來有報道在JCM病人的左心室活組織檢查發(fā)現(xiàn)，Cx43表達是增加的[11]。

3.2 Cx43分布的改變 心衰時，側分布更加明顯[11]，即Cx43、閏盤、N-鈣黏素共區(qū)域的減少，Cx43向無縫隙連接處移動。這種側化是通過蛋白激酶C來調控的。正常的端分布用于快速傳導電沖動，而側分布有利于平衡側面相連的心肌細胞間電沖動的提前和滯后，調節(jié)電沖動沿著肌束的縱軸進行連續(xù)傳導。分布紊亂會發(fā)生傳導方向變化、傳導速度降低、傳導阻斷等，易發(fā)生心律失常。在右心室檢測傳導速度發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，縱向傳導速率減慢，而橫向傳導速度不變，從而導致異質性的比率減少[8]?？v向傳導速率的減慢很有可能是由于閏盤處Cx43的減少，而不變的橫向傳導速率可能是因為無功能的側面Cx43，它可能會引起Cx43去磷酸化增加。

3.3 Cx43磷酸化水平的改變 在一篇犬心衰模型中Akar等[6]提出，不僅Cx43蛋白量發(fā)生下降，出現(xiàn)側分布，還會發(fā)生磷酸化水平的減少；Severs等[19]也提出慢性心臟疾病包括心肌肥大和心衰都與心律失常密切相關，伴隨著整體Cx43的下降和Cx43的去磷酸化。磷酸化是Cx43的功能形式，它的降低會造成細胞間縫隙連接通訊功能缺陷。Cx43羥基端有眾多不同的磷酸化位點，這些磷酸化位點可能都參與了心衰進程。同一個位點的磷酸化可能受到不同蛋白激酶的調節(jié)，而不同的位點又可能同時受同一個蛋白激酶的調節(jié)。所不同的是在不同疾病模式中起主導作用的位點和所經(jīng)的激酶途徑不盡相同，并且心肌細胞內Cx43與各種骨架蛋白形成復雜的蛋白網(wǎng)絡，而這個蛋白復合體也正是細胞內各個激酶發(fā)生作用的結構性載體場所。因此Cx43與各個激酶之間形成了復雜的相互影響、調節(jié)的網(wǎng)絡。心衰時非磷酸化Cx43增加，到底Cx43的去磷酸化在多大程度上影響縫隙連接，這需要更多的實驗來進行評估。有文獻提出在衰竭心臟中，PP-1可能會增加Cx43磷酸化水平，從而使得心臟收縮功能重建[20]，這對于心衰的治療和藥物的研發(fā)提供了新的靶點。

綜上所述，Cx43在心衰的發(fā)展進程中發(fā)揮著至關重要的作用。但是，縫隙連接和縫隙連接蛋白重構的調節(jié)機制、直接參與分子水平調節(jié)信號分子和離子通路、Cx43不同的磷酸化位點的作用等都有待于進一步探討。相信Cx43引起的縫隙連接變構和構成心臟結構和功能改變的機制將逐步被人類認識，并可能最終成為藥物作用的新靶點。

[1] Jassim A,Aoyama H,Ye WG,et al.Engineered Cx40 variants increased docking and function of heterotypic Cx40/Cx43 gap junction channels [J] .J Mol Cell Cardiol ,2016(90):11-20.

[2] Katakowski M,Buller B,Wang X,et al.Functional microRNA is transferred between glioma cells [J] .Cancer Res,2010,70(21):8259-8263.

[3] Willecke K,Eiberger J,Degen J,et al.Structural and functional diversity of connexin genes in the mouse and human genome [J].Biol Chem,2002,383(5):725-737.

[4] Johnson RG，Reynhout JK，TenBroek EM，et al.Gap junction assembly:roles for the formation plaque and regulation by the C-terminus of connexin43 [J].Mol Biol Cell,2012,23(1):71-86.

[5] Fong JT,Nimlamool W,Falk MM.EGF induces efficient Cx43 gap junction endocytosis in mouse embryonic stem cell colonies viaphosphorylation of Ser262,Ser279/282,and Ser368[J].FEBS Lett,2014,588(5):836-844.

[6] Akar FG,Spragg DD,Tunin RS,et al.Mechanisms underlying conduction slowing and arrhythmogenesis in nonischemic dilated cardiomyopathy [J].Circ Res,2004,95(7):717-725.

[7] Severs NJ,Coppen SR,Dupont E,et al.Gap junction alterations in human cardiac disease [J].Cardiovasc Res,2004,62(2):368-377.

[8] Uzzaman M,Honjo H,Takagishi Y,et al.Remodeling of gap junctional coupling in hypertrophied right ventricles of rats with monocrotaline-induced pulmonary hypertension [J].Circ Res,2000,86(8):871-878 .

[9] Fontes MS,van Veen TA,de Bakker JM,et al.Functional consequences of abnormal Cx43 expression in the heart [J].Biochim Biophys Acta,2012,1818(8):2020-2029.

[10] Wu T,Wu D,Wu Q,et al.Effect and mechanism of Irbesartan on occurrence of ventricular arrhythmias in rats with myocardial ischemia through connexin43 (cx43) [J].Asian Pac J Trop Med,2016,9(10):1007-1012.

[11] Salameh A,Krautblatter S,Karl S,et al.The signal transduction cascade regulating the expression of the gapjunction protein connexin43 by beta-adrenoceptors[J].Br J Pharmacol,2009,158(1):198-208.

[12] Kostin S,Rieger M,Dammer S,et al.Gap junction remodeling and altered connexin43 expression in thefailing human heart [J].Mol Cell Biochem,2003,242(1-2):135-144.

[13] Sanbe A,James J,Tuzcu V,et al.Transgenic rabbit model for human troponin I-based hypertrophic cardiomyopathy [J].Circulation,2005,111(18):2330-2338.

[14] Ripplinger CM,Li W,Hadley J,et al.Enhanced transmural fiber rotation and connexin 43 heterogeneity are associated with an increased upper limit of vulnerability in a transgenic rabbit model of human hypertrophic cardiomyopathy[J].Circ Res,2007,101(10):1049-1057.

[15] Sasano C,Honjo H,Takagishi Y,et al.Internalization and dephosphorylation of connexin43 in hypertrophied right ventricles of rats with pulmonary hypertension [J].Circ J,2007,71(3):382-389.

[16] Schulz R,Grge PM,Grbe A,et al.Connexin 43 is an emerging therapeutic target in ischemia/reperfusion injury,cardioprotection and neuroprotection [J].Pharmacol Ther,2015,153:90-106.

[17] Poelzing S,Rosenbaum DS.Altered connexin43 expression produces arrhythmia substrate in heart failure [J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2004,287(4):H1762-H1770.

[18]Zhong JH,Lu SJ.Changes of transmural heterogeneity of CX43 expression in chronic heart failure [J].J Am Coll Cardiol,2014,64(16):C45.

[19] Severs NJ,BruceAF,Dupont E,et al.Remodelling of gap junctions andconnexin expression in diseased myocardium [J].Cardiovasc Res,2008,80(1):9-19.

[20] Pathak A,del Monte F,Zhao W,et al.Enhancement of cardiac function and suppression of heart failure progression byinhibition of protein phosphatase 1 [J].Circ Res,2005,96(7):756-766.

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.01.038

R541.6

A

1002-266X(2017)01-0106-03

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