氯霉素降解菌的分離篩選及降解性能研究

陳茂祥 夏靈恩 毛樂(lè)佳 傅文韜 許雙燕 鄭華寶

摘要?從施用由豬糞堆肥制成的有機(jī)肥的土壤中篩選、馴化出一株能以氯霉素為唯一碳源的降解菌。經(jīng)形態(tài)學(xué)特征觀察及16S rDNA序列分析，初步鑒定該菌株屬于假單胞菌屬（Pseudomonas sp.），命名為CAP_CXMF。通過(guò)控制單一變量探討菌株的最佳生長(zhǎng)條件以及不同外加碳氮源對(duì)降解菌降解率的影響。結(jié)果表明，在氯霉素初始濃度為300 mg/L、接種量10%、溫度20 ℃、轉(zhuǎn)速160 r/min、pH為7時(shí)，該菌株對(duì)氯霉素的降解率達(dá)72.55%，添加一定量的酵母膏和葡萄糖后的降解率分別為73.15%和72.80%。該菌株對(duì)氯霉素有良好的降解性能，可以用于治理環(huán)境中的氯霉素污染問(wèn)題，并為生物降解抗生素提供一種新的優(yōu)勢(shì)菌株。

關(guān)鍵詞?氯霉素;降解菌;分離篩選;降解性能

中圖分類號(hào)?X172?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼?A?文章編號(hào)?0517-6611（2021）09-0061-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.09.017

Abstract?Isolating and screening a highly efficient chloramphenicol-degrading strain with chloramphenicol as the sole carbon source from soil applying organic fertilizer made from pig manure compost. The strain named as CAP_CXMF was initially identified as Pseudomonas sp. by morphological observation and 16S rDNA sequence analysis. The growth and the degradation of CAP were investigated in this research. The results showed that the chloramphenicol degradation rate with the initial concentration of 300 mg/L， the inoculation amount was 10%， the temperature was 20 ℃， the rotation speed was 160 r/min， and the pH was 7， reached 72.55%. The strain had a high degradation efficiency and the degradation rate after adding yeast extract was 73.15%， as well as adding glucose was 72.80%. Due to its good degradation performance， it could be used for the treatment of chloramphenicol antibiotic pollution， providing a new dominant strain for the biological treatment of chloramphenicol.

Key words?Chloramphenicol;Degrading strain;Isolation and screening;Degradation property

目前，抗生素的濫用尤其是在畜牧業(yè)中的濫用已成為重要的環(huán)境問(wèn)題[1]。2013年，抗生素在畜牧業(yè)中的使用量占總使用量的50%以上，已經(jīng)高于在人類中的使用量[2]。因此，2016年9月G20杭州峰會(huì)提出謹(jǐn)慎使用抗生素并考慮抗生素在可負(fù)擔(dān)和可獲得性上所面臨的挑戰(zhàn)和對(duì)公共衛(wèi)生的影響[3]。氯霉素（chloramphenicol，CAP）作為一種廣譜抗生素，近年來(lái)廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)中畜禽的疾病控制和治療方面[4]。氯霉素在水產(chǎn)、畜牧業(yè)中使用后，會(huì)隨著畜禽糞便的排放以及生產(chǎn)氯霉素類藥物廢水的排放進(jìn)入環(huán)境，導(dǎo)致大量氯霉素殘留在環(huán)境中，容易造成環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)[5]。氯霉素注射進(jìn)入家畜后容易在其體內(nèi)殘留，之后體內(nèi)殘留有氯霉素的家畜被人類食用，會(huì)隨之進(jìn)入人體，殘留在人體內(nèi)的氯霉素會(huì)引起人體再生障礙性貧血對(duì)人類健康產(chǎn)生極大的威脅[6-7]。因此2002年我國(guó)出臺(tái)法律，禁止氯霉素在食品動(dòng)物中的使用[8]。但因其廣泛高效的抗菌能力、低廉的價(jià)格等特點(diǎn)被過(guò)量使用，目前環(huán)境中的氯霉素殘留量問(wèn)題仍舊不容忽視。高劍容[9]監(jiān)測(cè)了深圳市龍崗區(qū)南灣街道轄區(qū)內(nèi)水產(chǎn)品獸藥殘留量，分析得出該轄區(qū)內(nèi)海水貝類氯霉素殘留問(wèn)題較突出。陳金玉等[10]對(duì)廣州市市售水產(chǎn)品氯霉素殘留情況進(jìn)行測(cè)定分析，得出氯霉素的檢出率為2.5%，說(shuō)明部分水產(chǎn)品仍存在氯霉素污染問(wèn)題。因此如何處理濫用后殘留的氯霉素，已成為當(dāng)下亟待解決的一個(gè)環(huán)境問(wèn)題。

目前常規(guī)處理工藝較難去除氯霉素，因此許多學(xué)者研究出了多種解決氯霉素問(wèn)題的方法。王玲麗[11]利用活性炭吸附飲用水中的氯霉素，采用微波（MW）技術(shù)再生達(dá)到飽和吸附的活性炭，然后利用再生后的活性炭再次吸附水中氯霉素，研究其對(duì)氯霉素吸附性能的變化，結(jié)果表明，利用片狀活性炭當(dāng)氯霉素初始濃度為1 000 mg/L時(shí)，飽和吸附量為24 mg/g，利用MW處理4 min后經(jīng)5次再生，再生率可達(dá)85%以上且性能穩(wěn)定。有研究通過(guò)紫外激活過(guò)硫酸鹽（UV/PS）去除水中的氯霉素并得到了較好的處理效果[12]。多種處理方法的聯(lián)用能有效提高處理效率，有研究利用生物陰極還原降解氯霉素[13]，得出24 h下生物陰極氯霉素還原效率遠(yuǎn)高于相同條件下非生物陰極氯霉素還原效率，證明了生物陰極工藝處理氯霉素的可行性。盡管很多高效去除方法被陸續(xù)研究得出，但氯霉素本身性質(zhì)穩(wěn)定、難降解，單用物理、化學(xué)方法難以將其去除，運(yùn)用復(fù)雜的工藝處理又會(huì)增加成本不具經(jīng)濟(jì)性，而生物自然降解法對(duì)環(huán)境擾動(dòng)小投資少，為一種具有廣闊前景的處理方法。但因生物處理氯霉素過(guò)程中，氯霉素和氯化物對(duì)普通生物有較強(qiáng)的抑制作用[14]，所以需要一種能耐受并降解氯霉素的菌株，進(jìn)行高效的生物處理。趙夢(mèng)君[15]從污泥中分離出一株氯霉素高效降解菌LMS-CY，該菌株能在24 h內(nèi)100%降解100 mg/L氯霉素，說(shuō)明自然中存在高效降解氯霉素的菌株，可用于生物處理氯霉素。因此該研究旨在從施用畜禽糞便制成的有機(jī)肥的土壤中篩選出能降解氯霉素的高效降解菌，并研究其降解特性，提供一種能高效降解氯霉素的新菌株，為今后制備高效降解氯霉素的菌劑奠定基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1?儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀（HPLC）;C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，Waters，USA）;HPX-9032MBE型電恒溫培養(yǎng)箱（上海博訊）;YXQ-75SⅡ型高壓蒸汽滅菌鍋（上海博訊）;UV-5100型紫外分光光度計(jì)（上海元析）;THZ-98AB型搖床（上海一恒）;DS-5510DTH型超聲波清洗機(jī)（上海生析）;Mini-15K型高速離心機(jī)（杭州奧盛）;YR-PTB型真空泵（上海亞榮）。

1.2?試劑

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g、H2O 1 L，調(diào)pH為7.0。配制固體培養(yǎng)基需加瓊脂粉16 g。

無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基：NH4NO3 1 g、KH2PO4 0.5 g、K2HPO4·3H2O 1.5 g、NaCl 1 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、H2O 1 L，調(diào)pH為7.0。

氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品：購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司，純度97%。

1.3?氯霉素降解菌的篩選馴化

1.3.1?菌種來(lái)源。

菌種取自浙江省杭州市富陽(yáng)區(qū)有機(jī)肥制造廠經(jīng)一年施肥的菜地土壤。該廠有機(jī)肥由豬糞和秸稈制成，存在氯霉素殘留，施過(guò)該有機(jī)肥的土壤長(zhǎng)期受氯霉素污染。

1.3.2?菌株馴化、分離和純化。

取10 g新鮮土壤，加至含50 mg/L氯霉素的100 mL無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，置于150 r/min、30 ℃搖床中振蕩培養(yǎng)3 d。從培養(yǎng)得到的菌液中以10%接種量轉(zhuǎn)接至含50 mg/L氯霉素的100 mL無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，在相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)3 d。提高氯霉素濃度至75 mg/L，在相同條件下馴化培養(yǎng)3 d，提高氯霉素濃度至100 mg/L相同條件培養(yǎng)3 d。將培養(yǎng)所得菌液以10-1～10-6的梯度稀釋，涂布在含100 mg/L氯霉素的LB固體培養(yǎng)基上，置于30 ℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)2 d。從中挑選出經(jīng)馴化后長(zhǎng)勢(shì)良好、菌落規(guī)則的菌株，分別轉(zhuǎn)接至加入100 mg/L氯霉素的無(wú)機(jī)鹽試管培養(yǎng)基中，30 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)24 h。觀察試管中降解菌生長(zhǎng)狀況，挑取長(zhǎng)勢(shì)良好的試管繼續(xù)馴化傳代培養(yǎng)，得到能高效專一降解氯霉素的菌株，同時(shí)將得到的菌株用30%甘油保存至-80 ℃超低溫冰箱。同時(shí)，取0.1 mL菌液轉(zhuǎn)接至濃度為25 mg/L的氯霉素?zé)o機(jī)鹽試管培養(yǎng)基，150 r/min、30 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)2 d后，取樣測(cè)定氯霉素濃度。從25 mg/L的氯霉素濃度開(kāi)始以25 mg/L的梯度逐漸提高氯霉素濃度至100 mg/L，在相同條件下培養(yǎng)，測(cè)定各濃度梯度菌株的降解率。經(jīng)過(guò)分離純化最終得到長(zhǎng)勢(shì)較好的氯霉素菌株，初步認(rèn)定該菌對(duì)氯霉素具有較好的降解能力。

1.4?菌株鑒定

將降解菌涂布到培養(yǎng)基平板上，30 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后觀察菌落形態(tài)，挑取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌株，送至浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院測(cè)試中心進(jìn)行電子顯微鏡觀察，對(duì)菌株個(gè)體形態(tài)進(jìn)一步完善。同時(shí)，進(jìn)行16S rDNA基因序列分析，以細(xì)菌總DNA為模版，利用細(xì)菌16S rDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系50 μL：模版DNA 1 μL，通用引物27F和1429R各1 μL，2×Taq Buffer Mix 25 μL，DDH2O 22 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃時(shí)預(yù)變性5 min，95 ℃時(shí)30 s，57 ℃時(shí)30 s，72 ℃時(shí)1.5 min共30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃時(shí)延伸10 min。將所得序列在NCBI 中進(jìn)行 BLAST 比對(duì)，研究其同源性，選取相近同源性的菌株構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。

1.5?降解菌的降解特性研究

以底物濃度、接種量、溫度、轉(zhuǎn)速、pH、外加碳氮源為研究對(duì)象，將菌株培養(yǎng)活化后接入到100 mL氯霉素濃度為300 mg/L的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，在不同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)48 h，測(cè)定氯霉素濃度。每個(gè)處理組設(shè)3個(gè)重復(fù)樣，并設(shè)空白對(duì)照。

1.5.1?初始底物濃度對(duì)氯霉素降解率的影響。

以10%接種量接種至底物濃度為10、50、100、200、300、400、500 mg/L的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，置于150 r/min、30 ℃恒溫?fù)u床中振蕩培養(yǎng)48 h，測(cè)定氯霉素濃度。

1.5.2?接種量對(duì)氯霉素降解率的影響。

以2%、4%、6%、8%、10%、12%接種量接種至100 mL氯霉素?zé)o機(jī)鹽培養(yǎng)基中，置于150 r/min、30 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)48 h，測(cè)定氯霉素濃度。

1.5.3?溫度對(duì)氯霉素降解率的影響。

以10%接種量接種至100 mL氯霉素?zé)o機(jī)鹽培養(yǎng)基，置于溫度分別為20、30、40、50 ℃的恒溫?fù)u床中，150 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，測(cè)定氯霉素濃度。

1.5.4?轉(zhuǎn)速對(duì)氯霉素降解率的影響。

在80、120、160、200 r/min的轉(zhuǎn)速條件下，接種量10%的菌液至100 mL氯霉素?zé)o機(jī)鹽培養(yǎng)基，30 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，測(cè)定氯霉素濃度。

1.5.5?pH對(duì)氯霉素降解率的影響。

調(diào)節(jié)100 mL無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基的pH分別為3、4、5、6、7、8、9，接種量10%的菌液，150 r/min、30 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)48 h，測(cè)定氯霉素濃度。

1.5.6?外加碳氮源對(duì)氯霉素降解率的影響。

將菌株以10%的接種量接種至100 mL氯霉素?zé)o機(jī)鹽培養(yǎng)基中，分別加入1.0 g/L的酵母膏、蛋白胨、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖，150 r/min、30 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)48 h，測(cè)定氯霉素濃度。

1.6?氯霉素殘留量的檢測(cè)

色譜柱為XTERRA RP C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液（A相）-乙腈（B相）。流速為1 mL/min，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)278 nm，依照梯度洗脫方式洗脫。在上述條件下使用高效液相色譜測(cè)定氯霉素殘留量，計(jì)算降解率。

1.7?最優(yōu)條件下降解率的測(cè)定

在最優(yōu)底物濃度、接種量、溫度、轉(zhuǎn)速、pH條件下振蕩培養(yǎng)48 h，測(cè)定氯霉素濃度，計(jì)算氯霉素降解率。

2?結(jié)果與分析

2.1?菌種鑒定

經(jīng)過(guò)多重馴化分離和富集篩選，得到一株氯霉素降解菌CAP_CXMF，菌落形態(tài)呈圓形（圖1A），白色、不透明，在透射電鏡下觀察菌株發(fā)現(xiàn)該菌以鞭毛運(yùn)動(dòng)（圖1B）。氯霉素降解菌經(jīng)PCR擴(kuò)增后的16S rDNA大小為1 442 kb。在NCBI中進(jìn)行BLAST比對(duì)，研究其同源性，初步鑒定為假單胞菌屬（Pseudomonas sp.），最高相似度達(dá)99.79%。選取相近同源性的細(xì)菌，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，如圖2所示。

2.2?生長(zhǎng)曲線

從圖3可以看出，CAP_CXMF從第1天開(kāi)始就進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌株持續(xù)增殖，第3天達(dá)到最大生長(zhǎng)量，OD600約為1.46，之后菌株進(jìn)入1 d的穩(wěn)定期，第4天后該菌進(jìn)入衰亡期。

2.3?降解菌的降解特性研究

2.3.1?初始底物濃度對(duì)降解菌降解率的影響。

從圖4可以看出，底物濃度為300 mg/L時(shí)降解菌CAP_CXMF對(duì)氯霉素的降解率達(dá)70.84%。在低濃度的初始條件下，氯霉素的降解率較低，可能由于濃度低的氯霉素供給的碳源不足以支撐降解菌的生長(zhǎng)。隨著底物濃度從10 mg/L增加至200 mg/L，降解率從44.98%迅速增大至69.09%，直至在300 mg/L達(dá)到最大。說(shuō)明該菌適于在氯霉素濃度較高的環(huán)境中生長(zhǎng)且利用底物效果較好。當(dāng)濃度大于300 mg/L時(shí)，氯霉素對(duì)菌株產(chǎn)生的生物毒害作用抑制了該菌的生長(zhǎng)，菌株的降解能力受到很大影響。

2.3.2?接種量對(duì)降解菌降解率的影響。

從圖5可以看出，接種量為10%時(shí)降解菌CAP_CXMF能高效率地去除氯霉素。較大的接種量有利于該菌對(duì)氯霉素的降解，因?yàn)樵摼枰牡孜餄舛容^大，接種量的增加能在一定程度上促進(jìn)菌株對(duì)氯霉素的降解作用。但是過(guò)高的接種量容易導(dǎo)致培養(yǎng)基中菌種受營(yíng)養(yǎng)限制而抑制生長(zhǎng)，降低生物活性。

2.3.3?溫度對(duì)降解菌降解率的影響。

從圖6可以看出，降解菌CAP_CXMF受溫度影響較大。在20 ℃的環(huán)境下菌株長(zhǎng)勢(shì)好、活性高，降解率達(dá)68.52%;30 ℃時(shí)該菌仍有較好的降解率。該菌株在適宜溫度下迅速生長(zhǎng)繁殖，大量消耗碳氮源，降解效率高。之后菌株降解率隨著溫度的上升而大幅下降，溫度為40 ℃時(shí)降解率低至27.10%，說(shuō)明溫度大于30 ℃，菌株酶活性受抑制生長(zhǎng)緩慢，對(duì)氯霉素的降解能力低。

2.3.4?轉(zhuǎn)速對(duì)降解菌降解率的影響。

從圖7可以看出，轉(zhuǎn)速對(duì)降解菌CAP_CXMF的降解率影響較小。轉(zhuǎn)速為160 r/min時(shí)降解率最高，達(dá)70.95%;轉(zhuǎn)速為200 r/min時(shí)，該菌的降解率也達(dá)到了70.74%;而轉(zhuǎn)速為80、120 r/min時(shí)，該菌的降解率仍有60%以上，表明轉(zhuǎn)速對(duì)菌株的生長(zhǎng)和降解率影響不大，說(shuō)明在該菌的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，溶解氧的需求量較少。160、200 r/min時(shí)菌株的降解率并未有較大的波動(dòng)，說(shuō)明該轉(zhuǎn)速范圍已接近菌株的最高降解性能?？紤]到搖床設(shè)備的高能耗，可以選擇160 r/min作為優(yōu)化的轉(zhuǎn)速。

2.3.5?pH對(duì)降解菌降解率的影響。

從圖8可以看出，pH對(duì)降解菌CAP_CXMF影響較大，隨pH的增加降解率呈先增加后降低的趨勢(shì)，pH為7時(shí)達(dá)到最高降解率。pH小于6，降解率由pH為3時(shí)的18.44%增加至pH為6時(shí)的70.64%，pH較低時(shí)菌株酶結(jié)構(gòu)遭破壞，活性受到抑制，難以適應(yīng)環(huán)境條件，降解性能低下。pH大于8時(shí)，菌株生長(zhǎng)量和降解率同樣因過(guò)高的pH而受到限制，菌株需要較長(zhǎng)的時(shí)間來(lái)適應(yīng)外部環(huán)境的改變。pH為7時(shí)，達(dá)到該菌的最佳降解條件，菌株活性最高，生長(zhǎng)繁殖最迅速，降解能力最強(qiáng)，能降解72.35%的氯霉素，降解效果較好。所以初始pH為7時(shí)，菌株的生長(zhǎng)量最大且氯霉素降解效率最高。

2.3.6?外加碳氮源對(duì)降解菌降解率的影響。

從圖9可以看出，碳氮源的添加能一定程度上提高降解菌CAP_CXMF對(duì)氯霉素的降解率。試驗(yàn)表明，該菌株利用酵母膏、葡萄糖和蛋白胨能力較好，在添加酵母膏、蛋白胨和葡萄糖的環(huán)境下降解菌對(duì)氯霉素的降解率較高，分別達(dá)73.15%、68.84%和72.80%;而添加蔗糖、麥芽糖作為碳源時(shí)降解率分別僅有54.87%和55.79%，說(shuō)明該菌利用蔗糖和麥芽糖效果一般。因此添加一定的葡萄糖、酵母膏、蛋白胨有助于該菌更好地利用、分解氯霉素。

2.3.7?最優(yōu)條件降解率。

接種菌株以10%的接種量，初始底物濃度300 mg/L，調(diào)節(jié)pH為7，在溫度20 ℃、轉(zhuǎn)速160 r/min條件下，測(cè)得降解率為72.55%。

3?討論

氯霉素的處理方法主要有物理吸附萃取、化學(xué)法和生物法[16]。近年來(lái)，氯霉素處理工藝主要集中在化學(xué)氧化還原上。吳宇煒[17]利用活性炭對(duì)納米零價(jià)鐵進(jìn)行改性，制備出活性炭負(fù)載納米零價(jià)鐵，用于處理去除氯霉素且具有很高的去除能力，經(jīng)分析結(jié)果得出活性炭負(fù)載納米零價(jià)鐵主要通過(guò)[H]的還原作用降解氯霉素。楊志偉[18]利用亞氧化鈦陽(yáng)極電化學(xué)氧化處理氯霉素廢水，在初始濃度為20 mg/L的廢水中進(jìn)行模擬，以0.05 mol/L的硫酸鈉溶液作為電解質(zhì)溶液，采用20 mA/cm2的電流密度，當(dāng)pH為5時(shí)能完全去除氯霉素;因其較低的能耗，可用于深度處理氯霉素廢水。